Introduction
Testa fissaggio o la testa di ritegno è una tecnica di immobilizzare testa dell'animale collegando un frame o piatto sul cranio per il bloccaggio rigido. La tecnica è stata adottata per una precisa stimolazione sensoriale, rilevamento comportamentale con o senza registrazione neurali in animali svegli 1-3 e per l'etichettatura juxtacellular durante il ciclo sonno-veglia 4. E 'utilizzato anche per l'imaging in vivo cerebrale 5,6. Ora tecnica di fissazione testa è uno strumento comunemente usato nel campo delle neuroscienze e ricerca comportamentale.
In sostanza, la fissazione testa tradizionale richiede attacco chirurgico di metallo testa-messaggi su parte superiore del cranio 6-8. Gli allegati vengono poi fissate ad una piattaforma fissa, con conseguente immobilizzazione della testa. Ricerca neurofisiologica in animali svegli, come neurale e / o la registrazione ottica, intervento circuiti cerebrali, imaging cerebrale è accompagnata da un intervento chirurgico di impianto utilizzando resine dentali. Dunque,sembra un compito semplice da implementare la fissazione testa nei laboratori quando è necessario sperimentalmente. I telai devono essere progettati per essere leggero e abbastanza piccolo da non disturbare il comportamento naturale dell'animale nelle loro gabbie a casa. Inoltre fornisce rigidità meccanica quando ancorata al piattaforma fissa. Ha inoltre biocompatibilità seconda fini sperimentali. Pertanto, è tecnicamente difficile progettare e fabbricare tali testa-messaggi in apparecchiature da laboratorio.
In questo studio, un metodo di fissaggio testa romanzo è descritto, fornendo rigidità meccanica attraverso conveniente serraggio senza usare metallo testa-messaggi. Usando il metodo di fissazione testa potrebbe essere fatto in condizioni di laboratorio generali, in cui la chirurgia di impianto è di solito eseguita nei roditori per lo studio del cervello. Gli head-perni in metallo vengono sostituiti con cemento resina acrilica stampata parzialmente da una barra di fissaggio testa su misura e il processo di stampaggio viene fatto durante implanchirurgia zione. La barra di fissaggio offre elevata compatibilità spaziale con altri impianti, quali sonde di registrazione neurali, elettrodi di stimolazione. Inoltre semplifica fasi di serraggio dell'animale sulla piattaforma fissaggio rimuovendo vite di fissaggio. Abbiamo usato questo metodo nel precedente studio comportamentale e abbiamo concluso che questo metodo è facile da implementare e conveniente in sperimentazione pratica 9.
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Protocol
Etica Dichiarazione:
Questo esperimento è stato approvato dalla Institutional Animal Care and Use Committee Kyungpook National University, ed è stata effettuata in base alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto Superiore di Sanità, 1996). Dopo esperimento, gli animali sono stati sacrificati sotto l'anidride carbonica l'eutanasia.
1. Progettazione del capo fissazione Bar per topi
NOTA: Questo passaggio è un orientamento generale per un design bar fissazione. Qualsiasi modifica della dimensione e materiale è possibile a seconda animali o impianti. Progettare un bar testa fissazione utilizzando il software CAD è consigliato ma non necessario.
- Utilizzare il software CAD per la progettazione di un bar fissazione.
- Progettare una barra di fissaggio di forma rettangolare (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1A). Realizzare un intaglio rettangolare (16 × 20 mm; porta) al centro della barra di fissaggio. Aggiungere pendii o rientranze which servire come una rotaia guida ai confini del porto (Figura 1A-a, Figura 1B -arrows).
NOTA: Assicurarsi che la zona del porto copre il rettangolo previsto per il cranio di topo sopra il cervello per consentire accessi verticali utilizzando un manipolatore stereotassico alla maggior parte delle aree del cervello attraverso una craniotomia. - Montare le piastre (50 × 20 × 6 mm) con due fori di fissaggio allungati su entrambi i lati della barra fissaggio. Assicurarsi che questi fori passano viti 6 mm di diametro (Figura 1A-d). Effettuare un foro del diametro di 3 mm di fronte alla porta per un gancio di chiusura (Figura 1A-b).
- Fare una scatola con un piano (135 × 305 mm) e pareti laterali (305 × 76 mm). Praticare due fori del diametro di 6 mm, come mostrato in Figura 1A (nel riquadro). Aggiungere muri di sostegno sulla barra di fissaggio (Figura 1A-e).
- Progettare una barra di fissaggio di forma rettangolare (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1A). Realizzare un intaglio rettangolare (16 × 20 mm; porta) al centro della barra di fissaggio. Aggiungere pendii o rientranze which servire come una rotaia guida ai confini del porto (Figura 1A-a, Figura 1B -arrows).
- Fabbricazione il bar progettato e box e assemblare ogni di loro usando cianoacrilato comemostrato nella Figura 1A (inserto). Montare la barra sulla scatola con viti di 6 mm di diametro. Applicare pista regolando la posizione della vite della barra per il fissaggio della testa ergonomico (Figura 1A-riquadro).
NOTA: Per i topi, la dimensione della barra di fissaggio 60 × 20 × 4 mm (costituito da due strati di 2 mm di spessore) pannelli acrilici. La porta è quadrato di 8 mm di larghezza (superiore) e 9 x 10 mm (inferiore) come mostrato nella Figura 1C. Piastre di ancoraggio sono le stesse dimensioni dei ratti '. Le pareti della piastra scatola e laterali sono 100 × 72 millimetri e 100 × 50 mm, rispettivamente.
2. Testa Mounter costruzione durante l'impianto Chirurgia
ATTENZIONE: Siate cauti quando si tratta di resina acrilica dentale. Il liquido può causare irritazione alla pelle. Indossare una maschera e indossare i guanti. Lavorare in un ambiente ben ventilato.
- Preparazione prima dell'intervento chirurgico
- Strettamente avvolgere il bordo del porto della barra di fissaggio con appellicola araffin per impedire l'adesione della resina acrilica applicata alla barra (vedi Figura 1B e Figura 2A). Coat confine del porto coperta dal film paraffina con uno strato sottile di resina acrilica.
- Utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati. Disinfettare accuratamente telaio stereotassico e il suo territorio con il 70% di alcol etilico.
- Eseguire un intervento chirurgico di impianto stereotassica
- Anestetizzare un animale mediante iniezione intraperitoneale di una miscela cocktail (2 ml / kg) di ketamina 10 ml (50 mg / ml), xilazina cloridrato 1,5 ml (23,32 mg / ml), e soluzione salina 2,5 ml. Verificare che l'animale completamente anestetizzato e non risponde a coda e punta pizzica. Iniettare cocktail miscela di 1 ml / kg durante chirurgia quando necessario.
- Fissare l'animale al apparato stereotassico. Applicare pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la disidratazione durante l'intervento chirurgico. Shave e pulire il cuoio capelluto con il 70% di etanolo. Dare iniezione sottocutanea di lidocaina al 2% e incidere la scalp lungo la linea mediana del cranio. Completamente raschiare periostio. Risciacquare con saline diverse volte.
- Rendere bava foratura vicino al bordo del cranio. Viti d'impianto 4-5 giri (fino a 1 mm di profondità) dalla superficie del cranio per evitare una violazione della dura madre. Assicurarsi che nessuna perdita di liquor e sangue sulla superficie del cranio dopo vite impianto. Sciacquare con soluzione salina e asciugare la superficie del cranio con aria-soffio, soprattutto intorno alle viti.
- Cappotto superficie del cranio con un sottile strato di "adesivo dentale (Super-Bond C & B)". Non coprire interamente la superficie del cranio, compresi il bregma se aggiuntivo l'impianto degli elettrodi è in programma. Utilizzare il bregma per la marcatura coordinate craniotomia. Elettrodi e / o microdrive implantari e fissarlo sul cranio applicando resina acrilica intorno ad esso.
- Applicare ulteriore resina acrilica sopra il cemento dentale. Utilizzare adeguate quantità di resina acrilica di lasciare sufficiente spazio fill-out tra bar rivestito in resina di und resina montaggio iniziale quando fissarsi le viti e / o elettrodi (Figura 2A).
- Place Bar testa fissazione 5 mm o più al di sopra della superficie del cranio ed allineare il centro (Figura 2A -Sinistra).
- Applicare resina acrilica nella fessura tra la base del cranio e resine montaggio iniziale. (Figura 2A -Center). Attendere che la resina diventare difficile.
- Rimuovere orecchio-bar e tirare il montatore modellata dalla porta barra di fissaggio. (Figura 2A -Right). Applicare con cura supplementare resina acrilica intorno alle rotaie di bordo del montatore stampato, se necessario.
- Lavare la superficie della ferita del cuoio capelluto con soluzione fisiologica sterile. Iniettare un antibiotico (enrofloxacina, 5 mg / kg sc) e (tartrato butorfanolo, 2 mg / kg sc) analgesico immediatamente dopo la chirurgia. Ospitare l'animale individualmente in un'unica gabbia.
3. abituare Animali da Head-fissaggio
Nota: Questo passaggio describi orari assuefazione basate su valutazioni empiricamente successo degli autori. Per una panoramica di procedura di assuefazione per la testa-fissazione, vedere 11 opere di 10 Schwartz o di Guo.
- Dare sufficiente periodo di convalescenza (una settimana o più) per gli animali. Il giorno 1, Maniglia animali spesso in brevi sessioni divise.
- Il giorno successivo (giorno 2), esporre l'animale per l'ambiente di fissazione (box). Non inserire il montatore testa nella porta della barra di fissaggio. Lasciare gli animali di abituarsi all'ambiente. Trovare e afferrare il montatore testa con la mano per 1-2 secondi e rilasciarlo immediatamente. Ripetere la fissazione a breve termine a mano-grab più volte.
- Il giorno 3, abituare gli animali a testa fissazione.
- Portare gli animali dalle gabbie casa e li stabilirsi nella casella di dirigere le teste verso il porto della barra di fissaggio. Afferra il montatore testa e inserirlo nella porta della barra di fissaggio.
- Associare il montatore (animale ditesta) al gancio di bloccaggio della barra di fissaggio usando un elastico. Stare in piedi per 5 minuti.
NOTA: Non toccare il tronco o la coda dell'animale dopo la fissazione, che porta l'animale a squittire e lottare aumentando lo stress dell'animale. Quando l'animale continua lotta più di 1 minuto, rilasciarlo e riprovare più tardi. Da questo punto, gli animali mostrano urine e feci l'escrezione quando esposto a testa la fissazione, ma questo a poco a poco si riduce come procede assuefazione. - Recuperare l'elastico di bloccaggio ed espellere il montatore dalla porta. Mettere gli animali torna alla gabbia a casa e di fornire un pezzo di cereali o di un seme di girasole nella gabbia di casa come ricompensa. Il processo successivo inizia in 30 min. Ripetere da 3.4.1 a 3.4.4 cinque o più in un giorno.
- Il giorno 4 a 7, esporre l'animale a testa fissaggio come descritto nel protocollo 3.4. Aumentare gradualmente la durata di fissaggio testa (10 min, 20 min, 30 min e 50 min come procede assuefazione).
NOTA: Se gli animali non fannot carica il premio cibo, può essere un segno di un alto livello di stress. Non aumentare il tempo di fissazione. Se gli animali mostrano ripetuti lottando comportamento, li abituare per un periodo più lungo. - Controllare il peso corporeo dell'animale quotidiano. Considerare assuefazione infruttuoso quando il peso corporeo è in diminuzione. Procedere a compiti comportamentali con testa di fissaggio dopo assuefazione successo.
NOTA: Riuscito assuefazione facilita la successiva formazione comportamentale (Figura 3E e F).
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Representative Results
Questo metodo di fissazione testa è applicabile sia ai ratti e topi. Totale otto ratti hanno ricevuto impianto bilaterale di stimolare elettrodi nel fascio proencefalo mediale. Per quattro di loro, elettrodi a filo di tungsteno personalizzati (Microdrive) sono stati ulteriormente impiantate nella zona forelimb M1 (Figura 2C). Per i topi (n = 2), quattro elettrodi a filo di acciaio inossidabile sono stati impiantati in aree corticali frontali / occipitali. Durante l'intervento, montatori di testa sono state stampate per la fissazione testa in entrambe le ratti e topi, come descritto nella sezione protocollo 2. Dopo il recupero da un intervento chirurgico, sono stati esposti alle sessioni giornaliere di fissaggio testa sia per assuefazione o attività comportamentale. I montatori testa modellati rimasti fino alla fine della sperimentazione (40.5 ± 1.73 (media ± DS) giorni per i ratti e 81 ± 5,66 (media ± DS) giorni per i topi dopo l'intervento chirurgico). I ratti sono stati esposti quotidianamente 40-60 min fissaggio testa durante compito comportamento; topi sono stati esposti giornaliera da 20 a 40 min di esserecompito comporta-.
In precedenza abbiamo utilizzato questa tecnica per allenare ratti spingere e tirare una leva sotto di fissaggio testa. La ricompensa era stimolazione elettrica diretta del fascio proencefalo mediale. Anche se suscita comportamento motorio esagerato, fissaggio testa era fermamente mantenuta senza separazione montatore accidentale.
Dopo assuefazione, l'attracco il montatore testa nella porta della barra di fissaggio è stata completata in pochi secondi bloccando elastico al gancio. Quando la prima volta alla fissazione testa, animali presenta lottando comportamenti come correre sul posto, raddrizzare le gambe (Figura 3A e B). Tuttavia, tali comportamenti diminuiscono con l'assuefazione. Assuefazione successo può essere confermato che gli animali non mostrano un comportamento più che lotta mentre la testa fissa (Figura 3C e D).
Figura 1. Progettazione della barra testa-fissazione.
(A) i nomi dei componenti della barra di fissaggio testa. a) porto; b) gancio di bloccaggio; c) il corpo barra di fissaggio; d) di ancoraggio fori; e) il sostegno a parete; f) piastra di ancoraggio. Disegno della scatola di fissaggio è raffigurato nel riquadro. Due fori della parete laterale sono utilizzati per posizionare la barra ergonomicamente fissazione. (B) Vista di prospettiva di barra di fissaggio testa progettato per i ratti. Frecce nere indicano il limite di coprire film paraffina. (C) Il design della porta per il fissaggio della testa nei topi. (Modificata dalla figura 1 di Roh et al. 9) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Costruzione di stampaggio montatore durante l'intervento chirurgico.
(A) Critico Al fasi di stampaggio il montatore testa. (Sinistra) Viti (T forme in nero) devono essere impiantati perpendicolari al cranio (grigio) di superficie. Un sottile strato di cemento dentale resina adesiva (verde) comprende viti e la superficie del cranio. (Center) Dopo l'impianto a seconda fini sperimentali, resine acriliche addizionali (arancione) sono riempiti nello spazio tra resina iniziale rivestita sulle resine portuali e di base della superficie del cranio e diventa parte del montatore testa. (A destra) Dopo aver aggiunto resine acriliche sono difficili insieme, il montatore testa può essere rilasciato facendo scorrere fuori dal porto. Linee nere continue indicano film paraffina. (Modificato da figura 1 del Roh et al. 9) (B) Costruito testa montatore nei ratti è pronta per rilasciare (dopo la fase di A-Center). (CD) modellata resine acriliche che servono come montatore testa. Dopo l'intervento chirurgico, ancora sotto anestesia, gli animali vengono rilasciati dalla barra di fissaggio. Frecce nere indicano guide corrispondenti alla forma della porta. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Ratto e nel topo Figura 3. Head-fisso.
(AB) Quando gli animali sono inizialmente esposti a testa la fissazione, emettono lottando comportamento. (CD) Come procede assuefazione, gli animali mostrano un comportamento meno che lotta e di solito sedersi sul pavimento della piattaforma fissa. (EF) Risultato delle prestazioni comportamentali attività di successo (E) e successo (F) assuefazione dell'ambiente fissaggio testa (Modificato da figura 3 Roh et al., 9). Numero ricompensa abbraccia entrambi gratuiti (per scopi di plasmare) e contingente della leva di trazione. In entrambe le sessioni, non sufficientemente ratto abituata mostra scarso rendimento con premiata solo la leva accidentale tira dal comportamento non contingente.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
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