Introduction
헤드 고정 또는 헤드 금지는 엄격한 클램핑의 두개골에 프레임 또는 판을 부착하여 동물의 머리를 고정하는 기술이다. 이 기술은 정확한 감각 자극, 또는 깨어 동물 1-3에서 신경 기록없이 수면 - 각성주기 4시 juxtacellular 라벨에 대한 행동 감지를 위해 채택되었다. 또한, 생체 내에서 뇌 영상 5,6- 사용된다. 지금 헤드 고정 기술은 신경 및 행동 연구에서 일반적으로 사용되는 도구이다.
기본적으로, 전통적인 헤드 고정 두개골 6-8 위에 금속 헤드 게시물의 수술 첨부 파일이 필요합니다. 첨부 후 헤드의 고정화 결과 고정 플랫폼에 고정된다. 이러한 신경 및 / 또는 광 기록, 뇌 회로의 개입과 같은 웨이크 동물에서 신경 생리 학적 연구는, 뇌 영상은 치과 아크릴을 사용하여 이식 수술을 동반한다. 따라서,그것은 실험적 필요할 때 그 실험실 헤드 고정을 구현하는 단순한 작업을 보인다. 프레임은 자신의 홈 케이지에 동물의 자연스러운 행동을 방해하지 가벼운 무게와 충분히 작은을 할 수 있도록 설계되어야한다. 고정 플랫폼에 고정 할 때 또한 기계적 강성을 제공한다. 그것은 더 실험 목적에 따라 생체 적합성을 가지고있다. 따라서, 설계 및 일반 실험실 장비 등의 헤드 게시물을 제작하는 것은 기술적으로 어렵다.
본 연구에서는, 신규 한 헤드 고정 방법은, 금속 포스트 헤드를 사용하지 않고 편리하게 클램핑 통해 기계적 강성을 제공하고, 설명한다. 방법을 사용하여, 헤드 고정은 수술 이식은 보통 뇌 연구 설치류에서 수행되는 일반적인 실험실 조건 하에서 수행 될 수있다. 금속 헤드 게시물은 IMPLAN 동안 이루어집니다 맞춤형 헤드 고정 줄 및 성형 공정에 의해 부분적으로 성형 아크릴 수지 시멘트로 대체됩니다테이션 수술. 고정 바는 신경 기록 프로브, 자극 전극과 같은 다른 임플란트와 높은 공간 호환성을 제공합니다. 또한 나사 체결을 제거함으로써 고정 플랫폼 동물의 머리를 클램핑하는 단계를 단순화한다. 우리는 이전의 행동 연구에서이 방법을 사용하고 우리는이 방법이 실제 실험 9에서 구현하기 쉽고 편리 결론을 내렸다.
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Protocol
윤리 문 :
이 실험은 경북 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었으며, 관리 및 사용 실험 동물의 (국립 보건 연구원, 1996)에 대한 안내에 따라 수행되었다. 실험 후, 동물은 이산화탄소 안락사 하에서 희생시켰다.
쥐의 헤드 고정 바의 1. 디자인
참고 :이 단계는 고정 바 디자인에 대한 일반적인 지침입니다. 치수 및 재료에 대한 모든 수정은 동물이나 임플란트에 따라 할 수있다. CAD 소프트웨어를 사용하여 헤드 고정 막대를 설계하는 것은 권장하지만, 필요하지 않습니다.
- 고정 막대를 설계하는 CAD 소프트웨어를 사용합니다.
- 직사각형 (123 × 35 × 6mm) (그림 1A)의 고정 막대를 디자인합니다. 고정 바의 중간에, 직사각형 노치 (포트 16 × 20 mm)를 확인합니다. 슬로프 또는 들여 쓰기를 추가 whic시간은 (그림 1B는 -arrows 그림은 1A-) 포트의 경계에 가이드 레일 역할을합니다.
참고 : 포트의 영역은 개두술을 통해 뇌 영역의 대부분에 정위 조작을 사용하여 수직 접근 할 수 있도록 뇌를 통해 쥐의 두개골의 추정 사각형을 다루고 있는지 확인합니다. - 고정 바의 양쪽에 두 개의 긴 고정 구멍 (50 × 20 × 6mm) 판을 연결합니다. 이 구멍은 직경 6mm (그림 1A-D)의 나사를 통과했는지 확인하십시오. 록킹 후크 (도 1A-B)를위한 포트 앞에 직경 3mm의 구멍을 만든다.
- 상자 바닥 (135 × 305mm)과 측벽 (305 × 76mm)를 갖는합니다. 도 1a (삽입)에 도시 된 바와 같이 두 개의 직경 6mm의 구멍을 뚫는다. 고정 바 (그림 1A-E)에 지원하는 벽을 추가합니다.
- 직사각형 (123 × 35 × 6mm) (그림 1A)의 고정 막대를 디자인합니다. 고정 바의 중간에, 직사각형 노치 (포트 16 × 20 mm)를 확인합니다. 슬로프 또는 들여 쓰기를 추가 whic시간은 (그림 1B는 -arrows 그림은 1A-) 포트의 경계에 가이드 레일 역할을합니다.
- 설계 막대를 제조 및 상자 등의 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 각각의 조립그림 1A (삽입)에 표시. 6mm 직경의 나사를 사용하여 상자에 막대를 조립합니다. 인체 공학적 헤드 고정 (그림 1A-삽입)에 대한 바의 나사 위치를 조정하여 기울기를 적용합니다.
주 : 생쥐를 들어, 고정 바의 크기 (2 mm 두께의 아크릴 패널의 2 개의 층으로 이루어진) 60 × 20 × 4mm이다. 포트는 8mm 폭 (상부) 및도 1c에 도시 된 바와 같이 9 X 10mm (아래)의 제곱이다. 고정 플레이트 쥐 '의 동일한 크기이다. 상자 판과 측면 벽은 각각 100 × 72mm와 100 × 50mm이다.
임플란트 수술시 2. 헤드 마운터 건설
주의 : 치과 아크릴 수지를 처리 할 때주의해야합니다. 액체는 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 마스크를 착용하고 장갑을 착용하십시오. 환기가 잘되는 곳에서 작업 할 수 있습니다.
- 수술 전 준비
- 단단히 고정 막대를 사용하여 AP의 포트의 테두리를 감싸는막대에 적용되는 아크릴 수지의 접착을 방지하기 위해 araffin 필름 (그림 1B 그림 2A 참조). 코트 아크릴 수지의 얇은 층으로 파라핀 필름으로 덮여 포트 보더.
- 멸균 수술 도구를 사용합니다. 철저 고정대 소독 및 70 % 에틸 알코올을 사용한 주변.
- 정위 이식 수술을 수행
- 복강 내 케타민 10 ㎖의 칵테일 혼합물의 주입 (2 ㎖ / kg) (50 ㎎ / ㎖), 자일 라진 하이드로 클로라이드 1.5 ㎖ (23.32 ㎎ / ㎖) 및 염수 250 ml로 동물을 마취. 동물이 완전히 마취와 꼬리와 발가락 핀치에 응답하지 않음을 확인합니다. 필요한 경우 수술 중 1 ㎖ / ㎏의 칵테일 혼합물을 주입.
- 정위 장치에 동물을 고정합니다. 수술 중 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용합니다. 면도 및 70 % 에탄올로 두피를 청소합니다. 2 % 리도카인의 피하 주사를주고 SCA를 절개두개골의 중간 선을 따라 LP로. 완전히 골막을 긁어. 식염수 여러 번 씻어.
- 두개골의 가장자리 근처에 버 - 홀 드릴링을 확인합니다. 임플란트 나사는 두개골 표면에서 4 ~ 5 회전 (최대 1mm까지의 깊이)는 뇌경막의 위반을 방지합니다. 나사 주입 후 두개골 표면에 뇌척수액과 혈액의 확인 누설하지 않습니다. 식염수로 씻어 특히 나사 주위에 공기 퍼프를 사용하여 두개골 표면을 건조.
- "치과 용 접착제 (슈퍼 본드 C & B)"의 얇은 층으로 코트 두개골 표면. 완전히 추가 전극 주입이 예약 된 경우 브레 그마를 포함하여 두개골의 표면을 커버하지 마십시오. 개두술 좌표를 마킹 브레 그마를 사용합니다. 임플란트 전극 및 / 또는 마이크로 드라이브 및 주위 아크릴 수지를 적용하여 두개골에 고정합니다.
- 치과 용 시멘트의 상단에 추가 아크릴 수지를 적용합니다. 바 코팅 수지 사이에 충분한 칠 아웃 공간을 떠나 아크릴 수지의 적절한 양을 사용하여D 초기 장착 수지 나사 및 / 또는 전극 (그림 2A)에 집착 할 때.
- 머리 고정 바를 두개골 표면 위 5mm 이상을 배치하고 중앙 (그림 2A - 왼쪽)을 맞 춥니 다.
- 두개골의 기본 초기 설치 수지 사이의 간격에 아크릴 수지를 적용합니다. (그림 2A -CENTER). 하드가 수지 될 때까지 기다립니다.
- 귀 막대를 제거하고 고정 바 포트에서 성형 마운터를 당깁니다. (그림 2A - 오른쪽). 조심스럽게 성형 마운터 필요한 경우의 가장자리 레일 주변에 추가로 아크릴 수지를 적용합니다.
- 멸균 식염수 두피의 상처 표면을 씻어. 즉시 수술 후 항생제 (enrofloxacin, 5 ㎎ / ㎏ SC) 및 진통제 (부토 르파 놀 주석산, 2 ㎎ / ㎏ SC)를 주입한다. 하나의 새장에 개별적으로 동물을 집입니다.
3. Habituating 동물 머리 고정을합니다
참고 :이 단계 드를저자의 경험적으로 성공적인 평가를 기반으로 습관화 일정을 스크라이브. 머리 고정에 대한 습관화 절차에 대한 개요, 슈워츠의 10 구오의 11 일을 참조하십시오.
- 동물에게 충분한 회복 기간 (주 이상)을 얻었다. 1 일에서 자주 나눈 짧은 세션에 동물을 처리합니다.
- 다음 날 (2 일)에 고정 환경 (상자)에 동물을 노출. 고정 바의 포트에 머리 마운터를 삽입하지 마십시오. 환경에 익숙해 동물을 둡니다. 안전하게 1-2 초 동안 손을 사용하여 헤드 마운터를 잡아 즉시 놓습니다. 손으로 잡아 몇 배 단기 고정을 반복합니다.
- 3 일에, 머리 고정에 동물을 길들.
- 홈 케이지에서 동물을 가져오고 고정 바의 포트를 향해 머리를 연출 박스에 정착. 헤드 마운터를 잡고 고정 바의 포트에 삽입합니다.
- 동물의 (마운터 바인딩고무 밴드를 사용하여 상기 고정 바의 걸림 후크에 머리). 5 분 동안 서.
참고 : 찍찍과 동물의 스트레스를 증가 투쟁 동물을 리드 고정 후 동물의 트렁크 또는 꼬리를 만지지 마십시오. 동물이 더 이상 1 분 고군분투 계속하면, 분리 한 후 시도하십시오. 고정을 머리에 노출하지만이 점차 습관화 진행됨에 따라 감소됩니다 때마다이 단계에서, 동물은 소변과 대변 배설을 보여줍니다. - 잠금 고무 밴드를 검색하고 포트에서 마운터를 꺼냅니다. 다시 홈 케이지에 동물을 넣고 시리얼의 조각 또는 보상 등 홈 케이지에 해바라기 씨앗을 제공합니다. 다음 재판은 30 분에 시작됩니다. 하루 만에 3.4.1 다섯 3.4.4에 이상을 반복합니다.
- 7 일 4 일, 프로토콜 3.4에 설명 된대로 고정을 머리에 동물을 노출. 점진적으로 (10 분, 20 분, 30 분, 및 습관화 진행됨 50 분)의 헤드 고정 지속 시간을 증가시킨다.
참고 : 동물이 경우 더t는 스트레스의 하이 레벨의 신호가 될 수 있고, 음식 보상을 피드. 고정 시간을 증가하지 마십시오. 동물 행동 어려움을 겪고 반복 표시하는 경우, 더 긴 기간을 길들. - 매일 동물의 체중을 확인합니다. 체중 감소에 실패 습관화를 생각해 보자. 성공 습관화 후 헤드 고정과 행동 작업을 진행합니다.
참고 : 성공적인 습관화 후속 행동 훈련 (그림 3E 및 F)를 용이하게한다.
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Representative Results
이 헤드 고정 방법은 래트 및 마우스 모두에 적용 가능하다. 총 여덟 쥐 내측 전뇌 다발로 전극을 자극 양자 간 이식을 받았다. 그들 중 4를 들어, 사용자 정의 텅스텐 와이어 전극 (마이크로 드라이브)를 추가로 M1의 앞다리 영역 (그림 2C)에 이식했다. 쥐 (N = 2), 네 개의 스테인레스 스틸 와이어 전극을 정면 / 후두 피질 영역으로 이식 하였다. 수술에서 회복 한 후 프로토콜 섹션 2에서 설명하는 바와 같이 수술하는 동안, 헤드 마운터가, 쥐 모두에서 헤드 고정을 위해 성형했다, 그들은 습관화 또는 행동 작업 중 하나에 대한 헤드 고정 매일 세션에 노출되었다. 성형 헤드 마운터이 실험의 말까지 머물렀다 (40.5 ± 1.73 (쥐에 대한 SD) 일 평균 ±과 ± 5.66 81 (수술 후 마우스를 위해 SD) 일 평균 ±). 쥐의 행동 작업하는 동안 매일 40 헤드 고정 60 분 노출; 마우스는 수의 40 분에 매일 20 노출havior 작업.
이전에 우리는 쥐 밀어 훈련 헤드 고정 아래 레버를 당겨이 기술을 사용했다. 보상은 내측 전뇌 다발을 직접 전기 자극했다. 이 과장 전위의 행동을 이끌어 있지만, 헤드 고정 단단히 실수 마운터의 분리없이 유지되었다.
습관화 후, 고정 바의 포트에 머리 마운터를 도킹하는 후크에 고무 밴드를 잠금으로써 몇 초에 완료되었다. 먼저 헤드 고정을 소개 할 때, 동물은 자신의 다리 (그림 3a 및 B)를 똑 바르게, 장소에서 실행으로 행동 어려움을 겪고 선물. 그러나 이러한 행동이 습관화로 감소. 성공적인 습관화는 헤드 (도 3c 및 D)에 고정하는 동안 동물이 더 이상 동작 고투 없어야 것을 확인할 수있다.
헤드 고정 바의 그림 1. 디자인.
(A) 헤드 고정 바의 구성 요소 이름. ) 포트; b)는 후크 잠금; C) 고정 바 본체; d)에 구멍을 고정; E) 벽을 지원; F) 고정 플레이트. 고정 상자의 디자인은 삽입에 도시되어있다. 측벽의 두 구멍은 인체 공학적으로 고정 막대를 배치하는 데 사용됩니다. 쥐에 대한 설계 헤드 고정 바의 (B) 전망보기입니다. 검은 화살표는 파라핀 필름 피복의 경계를 나타낸다. (C) 마우스에서 헤드 고정 용 포트의 디자인. (노 대통령 등. (9)의 그림 1에서 수정 된) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수술 중 마운터 성형 2. 건설 그림.
(A) 평론가 알은 머리 마운터 성형 단계를 반복합니다. (왼쪽) 나사 (검은 색 T 모양)는 두개골 (회색) 표면에 수직으로 이식해야합니다. 치과 용 접착 성 수지 시멘트 (녹색)의 얇은 층은 나사와 두개골 표면을 커버한다. 실험 목적에 따라 주입 후 (센터)은, 추가의 아크릴 수지 (주황색) 두개골 표면의 포트 및베이스 수지에 코팅 초기 수지 사이의 간극에 충전하고, 헤드 마운터의 일부가된다. 추가 아크릴 수지는 하드 설정되어 있습니다 (오른쪽) 후, 헤드 마운터는 포트에서 밀어 해제 할 수있다. 검은 색 선은 파라핀 영화를 나타냅니다. 쥐 (B) 구축 헤드 마운터 (노 대통령 등. (9)의 그림 1에서 수정 된 것은) (A-센터의 단계 이후) 해제하기위한 준비가되어 있습니다. (CD) 성형 헤드 마운터로서의 아크릴 수지 등을들 수있다. 수술 후, 여전히 마취, 동물 고정 바에서 해제됩니다. 검은 화살표는 포트의 형상에 일치하는 안내 레일을 나타낸다. PS : //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 쥐와 마우스를 헤드는 고정.
동물 초기 고정을 머리에 노출되는 경우 (AB)는, 그들은 행동 어려움을 겪고 방출한다. 습관화 진행됨 (CD)은, 동물 이하 고투 동작을 보여주고 보통 고정 플랫폼의 바닥에 내려 앉는다. 성공 (E)에서 행동 태스크 공연 (EF) 결과와 헤드 고정 환경의 실패 (F)의 습관화는 (노 대통령의 그림 3 등. 9에서 수정 된). 보상 번호 (목적을 형성하기위한) 무료 우발 레버 풀을 모두 포함한다. 두 세션에서, 충분히 길들여 쥐은 실수로 레버 비 우발적 인 행동에서 끌어 보상과 낮은 성능을 보여줍니다.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007 (2014).
