Akryl hartsavgjutningen Based Head Fixering Teknik Gnagare

Introduction

Head fixering eller huvudet besöksförbud är en teknik för immobilisering djurets huvud genom att fästa en ram eller platta på skallen för styva kläm. Tekniken har antagits för exakt sensorisk stimulering, beteendeanalys med eller utan neurala inspelning i vakna djur ^1-3 och juxtacellular märkning under sömnen-vakna cykel ^4. Det används också för in vivo hjärnavbildning ^5,6. Nu huvud bindningsteknik är ett vanligt förekommande verktyg inom neurovetenskap och beteendevetenskaplig forskning.

I grund och botten kräver traditionella huvudet fixering kirurgisk fastsättning av metall huvud-inlägg på toppen av skallen ^6-8. Fästena är sedan fast på en stationär plattform, vilket resulterar i immobilisering av huvudet. Neurofysiologisk forskning vakna djur såsom neurala och / eller optisk registrering, hjärnkretsar ingripande, är hjärnröntgen tillsammans med implantationskirurgi hjälp av tand akryler. Därför,det verkar vara en enkel uppgift att genomföra huvudfixering i dessa laboratorier när det är experimentellt nödvändigt. Ramarna bör utformas för att vara lätt och tillräckligt liten för att inte störa djurets naturliga beteende i sina hemmaburar. Det ger också mekanisk styvhet när fastklämd till den stationära plattformen. Det har vidare biokompatibilitet beroende på försöksändamål. Därför är det tekniskt svårt att utforma och tillverka sådana huvud-tjänster i allmän laboratorieutrustning.

I denna studie, är en ny huvudfixerings beskrivna metoden, vilket ger mekanisk styvhet genom praktisk kläm utan att använda metall huvud-inlägg. Genom att använda metoden kunde huvudet fixering ske under allmänna laboratorieförhållanden, där implantationskirurgi vanligtvis utförs hos gnagare för hjärnan studie. Metall huvud-inlägg ersätts med akrylharts cement formas delvis genom en skräddarsydd huvudfixerings bar och formningsprocessen sker under implanförandet kirurgi. Fixeringen bar ger hög rumslig kompatibilitet med andra implantat, såsom neurala inspelning sonder, stimuleringselektroder. Också det förenklar steg kläm djurets huvud på fixerings plattform genom att ta bort skruvfäste. Vi använde detta förfarande i den tidigare beteendestudie och vi drog slutsatsen att denna metod är lätt att implementera och bekvämt vid praktisk experimentering ^9.

Protocol

Etik uttalande:
Detta experiment har godkänts av Kyungpook National University Institutional Animal Care och användning kommittén, och utfördes enligt Guide för skötsel och användning av försöksdjur (National Institute of Health, 1996). Efter experimentet avlivades djuren under koldioxid eutanasi.

1. Design av Head-fixering Bar för råttor

OBS: Detta steg är en allmän riktlinje för en fixerings bar design. Eventuella ändringar om dimensionen och materialet är möjligt beroende på djur eller implantat. Utforma en huvud-fixering bar med hjälp av CAD-program rekommenderas, men inte nödvändigt.

1. Använd CAD-program för att utforma en fixerings bar.
   1. Designa en fixeringsfältet i en rektangulär form (123 × 35 × 6 mm) (Figur 1A). Gör en rektangulär skåra (16 × 20 mm, port) i mitten av fixeringsfältet. Lägg till sluttningar eller fördjupningar which fungera som en styrskena på gränsen till hamnen (Figur 1A-a, -arrows Figur 1B).
      OBS: Se till att området runt den hamn täcker beräknade rektangel råtta skalle över hjärnan att tillåta vertikala accesser med hjälp av en stereotaktisk manipulator till de flesta av de områden i hjärnan genom en kraniotomi.
   2. Fäst plattor (50 x 20 x 6 mm) med två långsträckta förankringshålen på båda sidorna av fixeringsfältet. Se till att dessa hål passerar skruvar med 6 mm diameter (Figur 1A-dg). Gör ett hål med diametern 3 mm framför porten för en låshake (Figur 1A-B).
   3. Gör en låda med ett golv (135 × 305 mm) och sidoväggar (305 × 76 mm). Borra hål två 6 mm i diameter, såsom visas i figur 1 A (infällt). Lägg bärande väggar på fixeringsfältet (Figur 1A-e).
2. Tillverka utformade bar och rutan och montera en av dem med hjälp av cyanoakrylat somsom visas i figur 1A (infällt). Montera stången på lådan med hjälp av skruvar 6 mm diameter. Applicera lutning genom att justera skruv position ribban för ergonomiska huvudet fixering (Figur 1A-infälld).
   OBS: För möss, är den dimension av fixeringsfältet 60 × 20 × 4 mm (som består av två skikt av 2 mm tjocka akryl paneler). Porten är kvadraten på 8 mm bredd (övre) och 9 x 10 mm (lägre), såsom visas i figur 1C. Förankringsplattor är samma storlek på råttor ". Lådan plattan och sidoväggar är 100 × 72 mm och 100 x 50 mm, resp.

2. Head Mounter Construction under implantationskirurgi

VARNING: Var försiktig när du arbetar med dentala akrylharts. Vätska kan orsaka hudirritation. Sätt på en mask och handskar. Arbeta i ett väl ventilerat utrymme.

1. Förberedelser för operation
   1. Tätt linda gränsen av hamnen i fixeringskroken med aparaffin film för att förhindra vidhäftning av applicerad akrylharts till bar (se figur 1B och figur 2A). Coat gränsen mellan porten täcks av paraffinfilmen med ett tunt skikt av akrylharts.
   2. Använd steriliserade kirurgiska instrument. Noggrant desinficera stereotaktisk ram och dess omgivning med hjälp av 70% etanol.
2. Utför stereotaxic implantationskirurgi
   1. Söva ett djur genom intraperitoneal injektion av en cocktail-blandning (2 ml / kg) av ketamin 10 ml (50 mg / ml), xylazinhydroklorid 1,5 ml (23,32 mg / ml), och saltlösning 2,5 ml. Kontrollera att djuret helt bedövad och svarar inte på svans och tå klämmer. Injicera cocktail blandning av 1 ml / kg under operation vid behov.
   2. Fäst djuret till stereotaxic apparaten. Applicera oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under operation. Raka och rengör hårbotten med 70% etanol. Ge subkutan injektion av 2% lidokain och incisionsfilm SCAlp längs mittlinjen av skallen. Helt skrapa bort benhinnan. Skölj med saltlösning flera gånger.
   3. Gör burr hålsborrning i närheten av fälgen av skallen. Implantat skruvar 4-5 varv (upp till 1 mm djup) från skallen yta för att förhindra ett brott mot dura mater. Se till att inget läckage av CSF och blod på skallen ytan efter skruv implantation. Skölj med saltlösning och torka skallen ytan med användning av luft-puff, särskilt runt skruvarna.
   4. Klädskallytan med ett tunt skikt av "tandbindemedel (Super-Bond C & B)". Inte helt täcka ytan av skallen inklusive bregma om ytterligare elektrod implantering är schemalagd. Använd bregma för märkning kraniotomi koordinater. Implantat elektroder och / eller microdrive och fixa det på skallen genom att tillämpa akrylharts runt den.
   5. Applicera ytterligare akrylharts ovanpå dentala cement. Använd lämplig mängd akrylharts att lämna tillräckligt fylla ut utrymmet mellan bar belagda harts end initial montering harts vid fixering skruvar och / eller elektroder (Figur 2A).
3. Placera huvud-fixeringsfältet 5 mm eller mer ovanför skallytan och rikta in dess mitt (figur 2A -Left).
4. Applicera akrylharts i springan mellan basen och inledande monterings hartser. (Figur 2A -Center). Vänta tills hartset blir hårt.
5. Ta bort öron bar och dra den formade mounter ur fixeringsfältet porten. (Figur 2A -Rätt). Applicera försiktigt ytterligare akrylharts runt kantskenor formade mounter om det behövs.
6. Skölj sårytan av hårbotten med steril koksaltlösning. Injicera ett antibiotikum (enrofloxacin, 5 mg / kg se) och ett analgetikum (butorfanoltartrat, 2 mg / kg se) omedelbart efter operation. Hysa djur individuellt i en enda bur.

3. habituerade Animals to Head-fixering

Obs: Detta steg debeskrivs hur tillvänjning scheman baserade på författarnas empiriskt framgångsrika bedömningar. För en översikt av tillvänjning förfarande för head-fixering, se Schwartz ¹⁰ eller Guo ¹¹ verk.

1. Ge tillräcklig återhämtningsperiod (en vecka eller mer) till djur. På dag 1, hantera djuren ofta på uppdelade korta sessioner.
2. På nästa dag (Dag 2), utsätter djuret till fixerings miljön (ruta). För inte in huvudet mounter i hamnen i fixeringsfältet. Lämna djuren att vänja sig vid miljön. Säkert ta tag i huvudet Mounter använder handen för 1-2 sek och släpp den omedelbart. Upprepa kortsiktigt fixering hand-grab flera gånger.
3. Dag 3, vänja djur till head-fixering.
   1. Ta djur från hemmet burar och lösa dem i rutan rikta huvuden mot hamnen i fixeringsfältet. Ta huvudet Mounter och sätt in den i porten på fixeringsfältet.
   2. Bind Mounter (djuretshuvudet) till låskroken av fixeringsbygeln med ett gummiband. Stativ för 5 minuter.
      OBS: Rör inte stammen eller svansen på djuret efter fixering, vilket leder djuret att gnissla och kamp att öka djurets stress. När djuret fortsätter att kämpa mer än 1 minut, släppa den och försök senare. Från detta steg, djur visar urin och avföring utsöndring när de utsätts för huvudet fixering men gradvis blir reduceras tillvänjningsfortskrider.
   3. Hämta spärr gummiband och mata ut mounter ut ur hamnen. Sätt djuren tillbaka till buren och ge en bit av spannmål eller en solrosfrö i hemmet buren som en belöning. Nästa försök börjar i 30 minuter. Upprepa 3.4.1 till 3.4.4 fem eller mer inom en dag.
4. På dag 4 till 7, exponera djuret att huvudet fixering såsom beskrivet i protokoll 3,4. Gradvis öka varaktigheten av huvudfixerings (10 min, 20 min, 30 min och 50 min som tillvänjningsskrider).
   OBS: Om djur inte görat tillförsel maten belöning, det kan vara ett tecken på en hög nivå av stress. Öka inte fixeringstiden. Om djur visar upprepade kämpar beteende, vänja dem under en längre period.
5. Kontrollera djurets kroppsvikt dagligen. Överväg misslyckade tillvänjning när kroppsvikten minskar. Fortsätt till beteende uppgifter med huvudet fixering efter lyckad tillvänjning.
   OBS: Lyckad tillvänjning underlättar efterföljande beteendevetenskaplig utbildning (figur 3E och F).

Representative Results

Detta huvud fixering metod tillämpas på både råttor och möss. Totalt åtta råttor fick bilateral implantation av stimulerande elektroder i den mediala framhjärnan bunt. För fyra av dem, anpassade volframtrådelektroder (Microdrive) dessutom implanteras i M1 forelimb området (figur 2C). För möss (n = 2), fyra rostfria trådelektroder implanterades i frontal / occipitala kortikala områden. Under operationen, var huvudet mounters gjuten för huvudfixering i både råttor och möss, som beskrivs i protokollet avsnitt 2. Efter återhämtning från operationen, var de utsätts för dagliga sessioner huvudet fixering för antingen tillvänjning eller beteende uppgift. De formade huvud mounters stannade till slutet av experimentet (40,5 ± 1,73 (medelvärde ± SD) dagar för råttor och 81 ± 5,66 (medelvärde ± SD) dagar för möss efter operation). Råttor utsattes dagligen 40-60 min huvudet fixering under uppförande uppgift, möss utsattes dagligen 20 till 40 minuter av varamänskliga beteenden som appliceras uppgift.

Tidigare använde vi denna teknik för att utbilda råttor driva och dra en spak under huvudfixering. Belöningen var direkt elektrisk stimulering av den mediala framhjärnan bunt. Även om det framkallar överdriven rörelsebeteende, var huvudet fixering fast upprätthållas utan oavsiktlig mounter separation.

Efter tillvänjning var dockning huvudet mounter i hamnen i fixerings bar avslutades i några sekunder genom att låsa gummiband till kroken. När först introducerades till huvudfixering, presenterar djur som kämpar beteenden som att köra på plats, räta ut benen (Figur 3A och B). Sådana beteenden minskade med tillvänjning. Framgångsrik tillvänjning kan bekräftas att djuren inte visar några mer kämpande beteende medan huvudet fast (figur 3C och D).

Figur 1. Design av huvudfixerings bar.
(A) -komponenten namnen på huvudfixeringsfältet. a) port; b) låsande krok; c) fixering bar kropp; d) förankringshålen; e) stödvägg; f) förankringsplatta. Design av fixerings rutan visas i infällda. Två hål i sidoväggen används för att ergonomiskt positionering av fixeringsfältet. (B) perspektiwy av utformade huvudfixerings bar för råttor. Svarta pilar anger gränsen för att täcka paraffin filmer. (C) Utformningen av port för huvudfixerings hos möss. (Ändrad från figur 1 i et al. Roh ⁹⁾ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Konstruktion av mounter gjutning under operation.
(A) Critic al stegen formning av huvudet Mounter. (Vänster) Skruvar (T former i svart) ska implanteras vinkelrätt mot skallen (grå) yta. Ett tunt skikt av dentala adhesiva hartscement (grön) täcker skruvarna och skallytan. (Center) Efter implantation beroende på experimentsyfte, är ytterligare akrylhartser (orange) fylls i gapet mellan första hartsbestrukna på hamn- och bashartser av skallen ytan och blir en del av huvudet Mounter. (Höger) Efter tillsatta akrylhartser är hårda set, kan huvudet Mounter frigöras genom att skjuta ut ur hamnen. Fasta svarta linjer indikerar paraffin filmer. (Modifierad från fig 1 av Roh et al., ⁹⁾ (B) Konstruerad huvudet mounter hos råttor är klar för att släppa (efter steget av A-Center). (CD) Gjuten akrylhartser som tjänar som ett huvud Mounter. Efter operation, fortfarande under anestesi, djur frigörs från fixeringsfältet. Svarta pilar indikerar styrskenor matchning till formen på porten. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Huvud-fixerade råtta och mus.
(AB) När djuren inledningsvis utsätts för huvudet fixering, de avger kämpar beteende. (CD) Som tillvänjningsfortskrider, djur visar mindre kämpar beteende och brukar sitta ner på golvet i den stationära plattformen. (EF) Resultat av beteendeaktivitets uppträdanden från lyckad (E) och misslyckade (F) tillvänjning av huvudfixerings miljön (Modifierad från figur 3 av Roh et al., ^9). Belöning nummer omfattar både gratis (för att forma ändamål) och villkorad spaken pull. I båda sessionerna, visar tillräckligt vana råtta dåliga resultat med endast belönas genom oavsiktlig spaken drar från icke-kontingent beteende.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic resin	Lang Dental Manufacturing	Ortho-Jet	to make molded mounter
Paraffin film	Bemis	Parafilm	to prevent adhesion of acrylic resin to the bar
Dental adhesive	Sun Medical	Super-Bond C&B	to bond between acrylic resin and skull
Plexglass or other acrylic plate			to make fixation bar and box platform
Cyanoacrylate			to bond acrylic plates