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Neuroscience

Microelectrode लंबे समय तक गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन के लिए चूहे की सबथैलेमिक न्यूक्लियस में इलेक्ट्रोड का आरोपण गाइडेड

doi: 10.3791/53066 Published: October 2, 2015

Abstract

गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन (डीबीएस) ऐसे अज्ञातहेतुक पार्किंसंस रोग, dystonia या कंपन के रूप में कई तंत्रिका संबंधी विकारों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और प्रभावी उपचार है। डीबीएस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विशिष्ट गहरी शारीरिक संरचनाओं के लिए बिजली उत्तेजनाओं के वितरण पर आधारित है। हालांकि, डीबीएस के प्रभाव अंतर्निहित तंत्र रहस्यपूर्ण रहते हैं। यह विशेष रूप से चूहों में पशु मॉडल में डीबीएस के प्रभाव की जांच करने में रुचि के लिए प्रेरित किया। डीबीएस एक लंबी अवधि के उपचार के रूप में है, अनुसंधान डीबीएस के बाद कई हफ्तों होती है कि तंत्रिका सर्किट के आणविक-आनुवंशिक परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए। चूहों जगह में उत्तेजक करने के लिए पशु के सिर से अग्रणी तार ध्यान में रखते हुए समस्याओं का कारण बनता है, जो उनके पिंजरे में चारों ओर ले जाने की वजह से चूहों में लंबे समय तक डीबीएस चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, चूहे के मस्तिष्क में उत्तेजना के लिए लक्ष्य संरचनाओं छोटे हैं और इसलिए इलेक्ट्रोड आसानी से आवश्यक स्थिति में नहीं रखा जा सकता। इस प्रकार, लंबे समय से स्थायी stimula के लिए एक सेट-अपके बारे में 1 MΩ के एक प्रतिबाधा के साथ प्लैटिनम / इरीडियम इलेक्ट्रोड का उपयोग चूहों की tion के इस अध्ययन के लिए विकसित किया गया था। इन विशेषताओं के साथ एक इलेक्ट्रोड पर्याप्त उत्तेजना लेकिन यह भी डीबीएस के लिए लक्ष्य क्षेत्र की पहचान करने के लिए गहरी मस्तिष्क संरचना की रिकॉर्डिंग के लिए न केवल अनुमति देता है। हमारे सेट-अप में, तार के लिए एक प्लग के साथ एक इलेक्ट्रोड खोपड़ी पर सुरक्षित चार प्रस्तोता शिकंजा के साथ दंत सीमेंट में एम्बेडेड था। उत्तेजक करने के लिए प्लग से तार एक स्टेनलेस स्टील वसंत द्वारा संरक्षित किया गया। एक कुंडा उलझ बनने से तार को रोकने के लिए सर्किट से जुड़ा था। कुल मिलाकर, इस उत्तेजना सेट-अप चूहे के लिए मुक्त गतिशीलता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है और लंबे समय तक चलने की ताकत बनाए रखने के लिए सिर प्लग, साथ ही प्लग और उत्तेजक के बीच तार कनेक्शन, सक्षम बनाता है।

Introduction

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4 या उदर मध्यवर्ती चेतक 5 - गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन (डीबीएस) इस तरह के आंतरिक ग्लोबस पैलिडस 1, सबथैलेमिक नाभिक (एसटीएन) 2 के रूप में विशिष्ट मस्तिष्क संरचना, को प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड के माध्यम से बिजली के उद्यमी के वितरण पर आधारित एक इलाज है। पिछले दो दशकों में, इस इलाज पार्किंसंस रोग 1 के लिए एक शक्तिशाली चिकित्सकीय उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है - 4, dystonia 6 और कंपन 7, और भी पुराने दर्द 7, मानसिक विकारों (मिलाना के लिए इस्तेमाल किया जाता है, यानी, जुनूनी बाध्यकारी विकार 8, प्रमुख अवसाद 9) या असभ्य मिर्गी 10,11। इसके अलावा, डीबीएस, भविष्य में, आग रोक धमनी उच्च रक्तचाप के 12 या ओर्थोस्टेटिक हाइपोटेंशन 13 के लिए एक उपचार के विकल्प बन सकता है।

प्रभाव अंतर्निहित शारीरिक तंत्रडीबीएस की समझ में आ खराब रहते हैं। Anesthetized कृन्तकों में अध्ययन चिकित्सकीय डीबीएस 14 आवेदन किया है कि नकल उच्च आवृत्ति उत्तेजना के तंत्रिका प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, इन अध्ययनों डीबीएस प्रभाव के व्यवहार मंडन की कमी ही नहीं बल्कि 14 से लागू किया उत्तेजना मापदंडों के आधार पर काफी परिवर्तनशीलता में परिणाम।

अधिक संक्षेप में सचेत कृन्तकों में डीबीएस के व्यवहार प्रभाव और अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए, एक उत्तेजना सेट-अप विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करता है कि जरूरत है। डीबीएस ज्यादातर एक लंबी अवधि के उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, पार्किंसंस रोग, जीर्ण दर्द)। यूनिट एक प्लग, साथ ही एक बाहरी उत्तेजक करने के लिए प्लग से एक तार के साथ एक इलेक्ट्रोड के होते तो यह है कि इस प्रकार, मूषक में उत्तेजना सेट-अप तैयार किया जाना चाहिए; खोपड़ी पर तय है और जब इस इकाई हल्के लेकिन अटूट होना चाहिए। इसके अलावा, आंदोलन की स्वतंत्रता stimula दौरान चूहों के लिए अपरिहार्य हैएक लम्बी अवधि में tion। डीबीएस का लक्ष्य संरचनाओं छोटे हैं; उदाहरण के लिए, चूहों में एसटीएन 1.2 मिमी की लंबाई और 0.8 मिमी 3,15 की मात्रा है। इसलिए, इलेक्ट्रोड नाभिक सम्मिलन के दौरान lesioned नहीं है और जरूरतों को निशाना बनाने के लिए सटीक है कि इस तरह तैयार किया जाना चाहिए। कृन्तकों में आयोजित सबसे डीबीएस पढ़ाई के लक्ष्य संरचना करने के लिए इलेक्ट्रोड का मील का पत्थर आधारित स्टीरियोटैक्टिक प्रविष्टि का इस्तेमाल किया है, त्रुटि दर Paxinos और वाटसन 16 के अनुसार निर्देशांक का उपयोग, तब भी जब अपेक्षाकृत ज्यादा हो सकती है। यह एक सांख्यिकीय सार्थक परिणाम तक पहुँचने की जरूरत जानवरों की एक बड़ी संख्या में परिणाम है।

एक इलेक्ट्रोड आरोपण तकनीक शुरू की है वर्तमान अध्ययन में, कि इलेक्ट्रोड को आगे बढ़ाने, जबकि एक microrecording प्रणाली का उपयोग करके उच्च सटीकता के साथ एसटीएन लक्ष्य। इसके अलावा, एक उत्तेजना प्रणाली केवल प्रेरित जानवर के लिए गतिशीलता के एक उच्च डिग्री की अनुमति है लेकिन यह भी निरंतर stimulati की गारंटी नहीं है कि प्रस्तुत किया हैचूहे के सिर पर (एक स्टेनलेस स्टील वसंत द्वारा संरक्षित किया जाता है) उत्तेजना के तार के सुरक्षित निर्धारण के माध्यम से पर।

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Protocol

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प्रयोगात्मक स्ट्रोक में अनुसंधान के लिए सिफारिशों के अनुसार और प्रदर्शन किया 17 का अध्ययन करता है और वर्तमान पशु अनुसंधान: पशु प्रयोगों वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय और कानूनी राज्य के अधिकारियों (54-2531.01-102 / 13 लोअर Franconia, अनुमोदन संख्या): द्वारा अनुमोदित किया गया की रिपोर्टिंग vivo प्रयोगों के दिशा निर्देशों में (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines)।

1. संज्ञाहरण

  1. प्रक्रिया की अवधि के लिए आपूर्ति गैस (ऑक्सीजन) और isoflurane की पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए संवेदनाहारी प्रणाली की जाँच करें। Stereotaxic साधन की छेनी पट्टी के साथ nosecone कनेक्ट और -3.3 मिमी पर छेनी बार डाल दिया।
  2. आपूर्ति गैस (2 एल / मिनट) चालू करें। एक बॉक्स में चूहे रखें और ऊपर सील। 3.5% isoflurane vaporizer चालू करें।
  3. चूहे लेटा हुआ है जब संवेदनाहारी गैस छेनी पट्टी करने के लिए तय हो गई है, जो nosecone के लिए बहती है, ताकि सिस्टम स्विच।
  4. रा हटायेबॉक्स कक्ष से टी और कान और आंखों के बीच क्षेत्र दाढ़ी; Jodosept पीवीपी से लथपथ एक कपास कली का उपयोग कर, किसी भी ढीली बाल हटाने के लिए मुंडा क्षेत्र झाड़ू।
  5. Nosecone (चित्रा 1) में चूहे की स्थिति और ओ 2 (/ मिनट 1 एल) में isoflurane 2.5% के साथ संज्ञाहरण जारी है। इंटरडिजिटल क्षेत्र pinching द्वारा संज्ञाहरण के स्तर की जाँच करें। चूहे पर्याप्त रूप से anesthetized है, तो रक्षात्मक सजगता (पैर की यानी, वापसी) को समाप्त कर दिया जाता है।
  6. प्रक्रिया के दौरान उत्तेजना के श्वसन और प्रतिक्रिया पर नजर रखने और जरूरत के रूप में vaporizer समायोजित।
  7. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें। मॉनिटर और एक प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग सिस्टम द्वारा 37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए।

2. सर्जरी

  1. पूरे सर्जरी के दौरान बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र रखें। Surgeon's हाथों बाँझ कर रहे हैं और ऑपरेटिंग क्षेत्र बाँझ है एक बार, केवल carefu के लिए कदमlly और बाँझपन तोड़ने के लिए नहीं याद है। यह भी एक वाद्ययंत्र नीचे सेट कर सकते हैं, जिस पर एक बाँझ क्षेत्र (यानी, बाँझ निविड़ अंधकार पर्दे) होने के भी शामिल है।
  2. मुंडा क्षेत्र के केंद्र में Mepivacaine subcutaneously 0.2 मिलीलीटर इंजेक्षन। Mepivacaine 3 घंटा तक की कार्रवाई की अवधि है कि एक स्थानीय संवेदनाहारी है। इसे आगे भी शल्य चिकित्सा के क्षेत्र anesthetize होगा।
  3. एक छुरी का उपयोग करना, एक midline चीरा कान के बीच शुरू करने और 2 सेमी की ओर का विस्तार कर सकते हैं। Periosteum (त्वचा के नीचे चमकदार झिल्ली) भी छिन्न है कि सुनिश्चित करें। चार अकड़न (चित्रा 2) के साथ खोपड़ी को बेनकाब।
  4. राज्याभिषेक और बाण टांके उजागर कर रहे हैं जब तक एक कपास कली का प्रयोग, धीरे periosteum हटा; इसके बाद, रूई के साथ खून stanch।
  5. एक जांच धारक पर तय एक सुई का उपयोग शीर्षस्थान के निर्देशांक निर्धारित करते हैं, और फिर एक काला महसूस की नोक कलम के साथ सुई की नोक के निशान। पूर्वकाल / पीछे (एपी) का उपयोग करना, midline / पार्श्व(माले) और dorsoventral (डीवी) ड्राइव शिकंजा, सीधे शीर्षस्थान पर सुई की नोक स्थिति।
  6. एपी और एमएल वर्नियर पैमाने रीडिंग ले: सही एसटीएन में इलेक्ट्रोड आरोपण के लिए ML पढ़ने से एपी पढ़ने से 3.6 मिमी और 2.5 मिमी घटाना, या बाईं एसटीएन में इलेक्ट्रोड आरोपण के लिए 2.5 मिमी जोड़ें। इस स्थिति में खोपड़ी की सतह के लिए सुई की नोक कम करने के बाद महसूस की नोक कलम की डाई द्वारा चिह्नित किया जाएगा।
  7. Stereotaxic साधन की बड़ी जांच धारक पर दंत ड्रिल दबाना। यानी, खोपड़ी पर चिह्नित बिंदु - गणना क्षेत्र के लिए दंत ड्रिल ले जाएँ। ड्यूरा दिख रहा है जब तक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख रहे हैं, (खोपड़ी के बारे में 1 मिमी मोटी है) खोपड़ी के माध्यम से एक छेद (व्यास के बारे में 1 मिमी) ड्रिल। माइक्रो-विच्छेदन संदंश या एक बाँझ सुई का उपयोग ड्यूरा वापस लेना। ड्यूरा इलेक्ट्रोड की नोक नष्ट करने के लिए काफी कठिन है।
  8. प्रत्येक ललाट squama में दंत ड्रिल के साथ एक छेद ड्रिल, और पूर्णांक मेंइलेक्ट्रोड छेद करने के लिए erparietal squama विपरीत। Stereotaxic साधन से जांच धारक डिस्कनेक्ट। शिरापरक वाहिकाओं खोपड़ी के तहत टांके पालन के रूप में एक खोपड़ी सीवन पर ड्रिल नहीं है।
  9. पाँच छेद में से प्रत्येक में एक हड्डी पेंच भाड़ में। बहुत गहरे में शिकंजा सूत्रण से बचें। स्टेनलेस स्टील शिकंजा (M1.6) के लिए, 2-3 पर्याप्त रूप से मस्तिष्क पर दबाव डालने के बिना पेंच आयोजित करेगा पेंच के बदल जाता है। घुमावों की संख्या पेंच की पिच पर निर्भर करेगा। Micromanipulator में इलेक्ट्रोड (चित्रा 3) के साथ जांच धारक दबाना।
  10. टिप लगभग पर्वबिन्दु को छू रहा है, जब तक एपी, एमएल और डीवी ड्राइव शिकंजा का उपयोग करना, इलेक्ट्रोड के साथ जांच धारक चलते हैं। शीर्षस्थान पर एपी, एमएल और डीवी वर्नियर पैमाने रीडिंग नोट। रीडिंग बना रहे हैं, आंदोलन के दौरान खोपड़ी स्क्रैप से इलेक्ट्रोड को रोकने के लिए इलेक्ट्रोड कुछ मिलीमीटर बढ़ा। इलेक्ट्रोड में डाला जाना है, जहां स्थिति के निर्देशांक निर्धारित करने के लिएछेद करने के लिए, एमएल पढ़ने के लिए 2.5 मिमी एपी पढ़ने के लिए 3.6 मिमी जोड़ सकते हैं और जोड़ने (या घटाना)।
  11. एपी और एमएल ड्राइव शिकंजा का उपयोग करना, गणना की स्थिति के लिए इलेक्ट्रोड चलते हैं। इस बिंदु पर, इलेक्ट्रोड टिप drilled इलेक्ट्रोड छेद पर सीधे स्थित होना चाहिए। फिर, माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख कर, ड्यूरा (चित्रा 4) के स्तर पर इलेक्ट्रोड कम है। इस स्तर डीवी दिशा में शून्य स्तर के रूप में कार्य करता है। इसके बाद धीरे माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख कर मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड की नोक डालें।
  12. रिकॉर्डिंग प्रणाली का कनेक्टर के लिए इलेक्ट्रोड पिन कनेक्ट करें। एक फैराडे पिंजरे रखो (या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ विकल्प) stereotaxic साधन में चूहा (चित्रा 5) से अधिक है। में काम किया जा रहा है कि कमरे के पासंग साथ stereotaxic साधन जमीन।
  13. रिकॉर्डिंग प्रणाली शुरू करो। उपलब्ध है, तो भी advancin दौरान निर्वहन / एकल इकाइयों की Salves के एक ध्वनिक संकेत प्राप्त करने के लिए एक लाउडस्पीकर का उपयोगजी इलेक्ट्रोड।
  14. धीरे धीरे इलेक्ट्रोड को आगे बढ़ाने के दौरान बिजली की गतिविधि को रिकॉर्ड करके मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड डालें। ड्यूरा से 7.5 के बीच और 8.1 मिमी की गहराई में, एसटीएन के विशिष्ट बिजली गतिविधि आमतौर पर पहचाने जाने (चित्रा 6) है। 18: एसटीएन में न्यूरॉन्स की विशिष्ट गतिविधि एक अनियमित फायरिंग पैटर्न और एक उच्च फायरिंग दर की विशेषता है (40.9 ± 12.9 हर्ट्ज आवृत्ति मतलब है)।
  15. रिकॉर्डिंग के दौरान, (0.8-1.0% करने के लिए, उदाहरण के लिए) के लिए जितना संभव संज्ञाहरण कम; कम anesthetized जानवरों एक स्पष्ट बिजली मस्तिष्क गतिविधि दिखा।
  16. इलेक्ट्रोड को कम जब खोपड़ी की सतह पर विस्थापित किया गया है कि किसी भी रक्त या मस्तिष्कमेरु द्रव दूर झाड़ू।
  17. दंत सीमेंट की एक छोटी राशि को मिक्स और इलेक्ट्रोड के आसपास है और एक छोटा सा रंग (चित्रा 7) का उपयोग कर पांच शिकंजा के चार आसपास इसे लागू होते हैं। पांचवें पेंच प्लग की जमीन तार ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  18. दंत सीमेंट तय हो गई है जब रिकॉर्डिंग प्रणाली के इलेक्ट्रोड धारक और कनेक्टर से इलेक्ट्रोड पिन डिस्कनेक्ट।
  19. दंत सीमेंट से तय नहीं था कि पेंच खोल देना। इलेक्ट्रोड पिन पर प्लग रखो। पांचवें पेंच (चित्रा 8) के साथ प्लग का तार जमीन को ठीक करें।
  20. दंत सीमेंट मिश्रण और प्लग के आसपास इसे लागू होते हैं। सीमेंट thickens के रूप में, एक टोपी के रूप में करने के लिए प्लग के आसपास यह ढालना। पशु को नुकसान पहुँचा और चित्रा (9 ए और बी) सख्त दौरान उन्हें हटा सकता है कि दंत सीमेंट के तेज किनारों से बचें।
  21. घाव किनारों Debride और मोर्चे पर और टोपी के पीछे एक सीवन के साथ उन्हें बंद कर दें। घाव किनारों कीटाणुरहित।
  22. एक कुंडा पर तय हो गई है कि तार करने के लिए सिर प्लग कनेक्ट करें। Stereotaxic साधन से चूहे निकालें।
  23. 2-3 दिनों के लिए एक बार दैनिक तब हस्तक्षेप के अंत में tramadol (12.5 मिलीग्राम / किग्रा, intraperitoneally) लागू करें और। THERMA के साथ एक साफ पिंजरे में चूहे रखेंएल समर्थन, इस पिंजरे (10 चित्रा) पर कुंडा को ठीक करने और 1 घंटे के लिए इसे ध्यान से निरीक्षण किया।
  24. यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर को मत छोड़ो। पूरी तरह से ठीक है, जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक जानवर नहीं लौटते।

3. उत्तेजना

  1. एक प्रतिबाधा मीटर का उपयोग कर उत्तेजना से पहले जानवर में प्रतिरोध का निर्धारण करें।
  2. एक तार और वर्तमान उत्पादन के साथ तार के दूसरे छोर पर प्लग और उत्तेजक की जमीन तार के लिए उत्पादन के साथ कुंडा के प्लग कनेक्ट करें। उत्तेजक कार्यक्रम करने के क्रम में एक कंप्यूटर के साथ उत्तेजक कनेक्ट करें।
  3. कार्यक्रम में उत्तेजना के मापदंडों को चुनें; उदाहरण के लिए, पार्किंसंस रोग में इस्तेमाल किया मानकों पल्स लंबाई हैं: 60 μsec; आवृत्ति: 130 हर्ट्ज। अपगति में पहचाने जाते हैं जब तक एक बढ़ती हुई वर्तमान आयाम के साथ चूहे को प्रोत्साहित। वें में कमीअपगति हासिल कि तीव्रता नीचे 10-20% तक या तंत्रिका संबंधी संकेत गायब हो और पशु सहज है जब तक ई बिजली तीव्रता। Monophasic आयताकार दालों इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया।
  4. प्रयोग पूरा करने के बाद, isoflurane साथ पशु euthanize: 5% या अधिक से अधिक करने के लिए isofurane प्रवाह की दर या एकाग्रता को समायोजित करें। बंद हो जाता है साँस लेने के बाद 1 मिनट तक isoflurane के जोखिम को जारी रखें।

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Representative Results

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एक रिकॉर्डिंग प्रणाली का उपयोग कर एक चूहे की एसटीएन में एक इलेक्ट्रोड दाखिल - यहाँ प्रस्तुत के रूप में - पशु के अनुसार लगभग 1 घंटा लेता है कि डीबीएस के लिए एक प्रभावी और सटीक प्रक्रिया है। यह मॉडल एक काफी मामूली प्रक्रिया है: सर्जरी के अधीन 10 चूहों के बाहर, सभी हस्तक्षेप से बच गया। चौबीस घंटा के हस्तक्षेप के बाद, प्रत्येक चूहे के राज्य नजर रखी थी और कोई जानवर गंभीरता कोड के अनुसार 1 से अधिक 3 अंक की हासिल की। निरंतर उत्तेजना की अवधि (14 दिन, 24 घंटा एक दिन) के दौरान अलग कोई तार तोड़ दिया, या के माध्यम से काट लिया था। 10 चूहों में से कोई भी दंत सीमेंट की टोपी को खो दिया है और न ही वे उत्तेजना के चरण के दौरान उपकरणों से चोट लगी हो। उत्तेजना से पहले इन 10 जानवरों में मापा प्रतिबाधा 353 ± 101 kΩ था। चूहे 130 हर्ट्ज की एक आवृत्ति और 60 μsec के एक पल्स चौड़ाई में प्रेरित किया गया। मतलब उत्तेजना तीव्रता orofacial या शेष भाग की तीव्रता सीमा से नीचे 20% पर स्थापित किया गया था, जो 60 μA था,ralateral forepaw अपगति, जिससे उत्तेजना की अवधि के दौरान खिला या हरकत के साथ समस्याओं को रोकने।

गहरी संज्ञाहरण और दिमाग तेजी से काटा गया के बाद चौदह दिनों के हस्तक्षेप और निरंतर उत्तेजना के बाद, सभी 10 चूहों कत्ल द्वारा euthanized थे। एक चूहे के मस्तिष्क मैट्रिक्स में, एसटीएन शामिल एक 2 मिमी मोटी मस्तिष्क ब्लॉक काट दिया गया और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं। ये मस्तिष्क ब्लॉकों राज्याभिषेक वर्गों (8 माइक्रोन मोटी) में काट रहे थे। प्रत्येक अनुभाग इलेक्ट्रोड की नोक स्थित था, जहां स्थिति की कल्पना, साथ ही पता लगाने के लिए की वजह से इलेक्ट्रोड के लिए सूजन या निशान ऊतक के गाती करने hematoxylin और eosin साथ सना हुआ था। एसटीएन में इलेक्ट्रोड स्थानीयकृत के लिए सफलता की दर 10 पशुओं के 8 था। Histologically के रूप में दिखाया इन 8 चूहों में प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड की नोक, एसटीएन में स्थित था। 11 एसटीएन में इलेक्ट्रोड स्थान दिखाता है चित्रा। निरंतर सेंट बाद विकसित एक छोटा सा घावimulation सभी चूहों में पाया गया था। यह घाव भड़काऊ कोशिकाओं (11 चित्रा) की एक छोटी संख्या से घिरा हुआ था।

चित्र 1
चित्रा stereotaxic साधन में सिर के 1. फिक्सेशन। चूहे stereotaxic फ्रेम के कान सलाखों के द्वारा तय हो गई है, साथ ही गैस संज्ञाहरण मुखौटा द्वारा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
खोपड़ी उजागर चित्रा 2। एक midline चीरा के बाद, त्वचा और periosteum घाव किनारों को लुढ़का कर रहे हैं और चार clamps का उपयोग शल्य चिकित्सा के क्षेत्र से दूर रखा है। एक बड़ी देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के आर संस्करण।

चित्र तीन
एक जांच धारक में इलेक्ट्रोड की चित्रा 3. फिक्सेशन। संदंश का प्रयोग, इलेक्ट्रोड का पिन प्लग में डाला जाता है और एक जांच धारक के साथ तय हो गई है। प्लग एक तार के माध्यम से रिकॉर्डिंग उपकरण के साथ जुड़ा हुआ है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड की चित्रा 4. निवेशन। सटीक एपी और सबथैलेमिक नाभिक के एमएल निर्देशांक निर्धारित करने के बाद, इलेक्ट्रोड की नोक की हवा निकाल दी ड्यूरा के स्तर पर और dorsoventral वर्नियर पैमाने पढ़ने लिया जाता है करने के लिए उन्नत है।= "_blank" मिल> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
बिजली के हस्तक्षेप के चित्रा 5. संरक्षण। एक फैराडे पिंजरे (या, वैकल्पिक रूप से, एल्यूमीनियम पन्नी) stereotaxic साधन और साधन, साथ ही पशु में चूहे के ऊपर डाल दिया जाता है, पर आधारित है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्रा 6
18: मस्तिष्क की गतिविधियों का आंकड़ा 6. रिकॉर्डिंग सबथैलेमिक नाभिक (एसटीएन) एक अनियमित फायरिंग पैटर्न और एक उच्च फायरिंग दर (40.9 ± 12.9 हर्ट्ज आवृत्ति मतलब है) से पता चलता है। एसटीएन प्रवेश करने से पहले, इलेक्ट्रोड Zona incerta के साथ संगत है, जो एक अपेक्षाकृत चुप क्षेत्र से गुजरता है; खड़ी sizइस क्षेत्र के उपायों के बारे में 0.5-1 मिमी ई। इसके बाद, एसटीएन में सम्मिलन के पूरा हो गया है कि यह दर्शाता है spikes की संख्या बढ़ जाती। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
इलेक्ट्रोड की 7 चित्रा फिक्सेशन। सबथैलेमिक नाभिक रिकॉर्डिंग के माध्यम से पहचान की है, इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड टांग और शिकंजा चारों ओर दंत सीमेंट लगाने से तय हो गई है। इस इलेक्ट्रोड की स्थिति बदलता बिना इलेक्ट्रोड पिन से कनेक्टर के unplugging अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा Attachiइलेक्ट्रोड पिन करने के लिए प्लग एनजी। उत्तेजक की कनेक्टर के लिए प्लग इलेक्ट्रोड पिन से जुड़ा हुआ है। प्लग पर soldered है जो जमीन तार, खोपड़ी पर एक पेंच के साथ तय हो गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
प्लग के 9 चित्रा फिक्सेशन। (ए) ललाट और (बी) के पार्श्व विचार। दंत सीमेंट प्लग के चारों ओर लागू किया जाता है और एक टोपी का गठन किया है; तेज किनारों से परहेज किया जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
Stimul को चूहे का आंकड़ा 10 कनेक्शनअभिनेता। एक कुंडा उलझ बनने से तार को रोकने के लिए सर्किट में शामिल हो गया था। चूहे तार काटने के लिए शुरू होता है, तो एक स्टेनलेस स्टील वसंत तार सुरक्षा करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 11
सबथैलेमिक नाभिक (एसटीएन) (hematoxylin और eosin धुंधला) के माध्यम से चित्रा 11. मस्तिष्क अनुभाग। (ए) अवलोकन, बढ़ाई 2.5। एक ठोस लाइन एसटीएन के चारों ओर। इलेक्ट्रोड टिप उत्तेजना के एक 14 दिन की अवधि के दौरान स्थित था, जहां एक छोटे घाव दिखाई दे रहा है। इलेक्ट्रोड ऊतक संरक्षण किया जाता है, यह दर्शाता है: (125 माइक्रोन टांग व्यास) यह इलेक्ट्रोड दृश्यमान का कोई पैठ नहर ध्यान दें कि वहाँ की है। (बी) तस्वीर एक (बॉक्स) से छवि विस्तार, बढ़ाई 100. एक छोटी संख्या कीभड़काऊ कोशिकाओं की वजह से इलेक्ट्रोड टिप करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों की प्रतिक्रिया के घाव के आसपास detectable था। तीर:। एक भड़काऊ सेल का एक उदाहरण यह दर्शाता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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इस अध्ययन में चूहों के एसटीएन में एक monopolar पुरानी इलेक्ट्रोड दाखिल करने के लिए निर्देश के लिए एक कदम-दर-कदम सेट प्रस्तुत करता है। कम प्रतिबाधा के साथ टंगस्टन इलेक्ट्रोड अक्सर डीबीएस 18,19, प्लेटिनम / इरीडियम (पं / आईआर) के बारे में एक MΩ के एक प्रतिबाधा था कि नियोजित किया गया था के बने एक monopolar इलेक्ट्रोड के लिए उपयोग किया जाता है। पं / आईआर इलेक्ट्रोड भी है क्योंकि उनके अनुकूल गुणों की पार्किंसंस रोग के साथ रोगियों में इस्तेमाल कर रहे हैं: वे कम से कम कटाव 20 का प्रदर्शन और कोई उच्च प्रभारी घनत्व का उपयोग किया जाता है, तो प्रासंगिक ऊतकों को नुकसान 21 उपज नहीं है। इस अध्ययन का उद्देश्य एक translational दृष्टिकोण को प्राप्त करने के क्रम में एक लंबे समय तक उत्तेजना सेट-अप और था, के बाद से, ऊपर उल्लिखित विशेषताओं के साथ इलेक्ट्रोड वर्तमान प्रयोग में लागू किया गया। इलेक्ट्रोड टिप के स्थानीयकरण दिखा मस्तिष्क स्लाइस की histologic परीक्षा इस प्रयोग में पं / आईआर 22 की तनु विदेशी शरीर प्रतिक्रिया पुष्टि की।

वर्तमान अध्ययन में ईएनटी ">, 1 MΩ के एक प्रतिबाधा के साथ पं / आईआर के इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल किया गया। इलेक्ट्रोड कम, या यहां तक ​​कि उच्च प्रतिबाधा के साथ, केवल या तो मस्तिष्क गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए या मस्तिष्क संरचनाओं उत्तेजक के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन दोनों नहीं। में हमारे अध्ययन में इस्तेमाल के रूप में इसके विपरीत, 1 MΩ की एक इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा, गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों की गतिविधि रिकॉर्डिंग और ऐसे एसटीएन के रूप में मस्तिष्क संरचनाओं उत्तेजक, दोनों के लिए उपयुक्त है। रिकॉर्डिंग के प्रमुख लाभ एक में एसटीएन स्थान की पहचान है । हमारे परिणामों से पता चला है के रूप में समय रिकॉर्डिंग की छोटी राशि, एसटीएन के विश्वसनीय स्थानीयकरण अनुमति देता है:। histologic नियंत्रण एसटीएन (8 से 10 के जानवरों) को निशाना बनाने का एक उच्च सफलता दर झुकेंगे इलेक्ट्रोड टिप पृष्ठीय के ऊपरी सेल परतों में प्रत्यारोपित किया गया था मोटर प्रांतस्था 23 से मुख्य रूप से मोटर आदानों प्राप्त करने के लिए जाना जाता है जो: एसटीएन (7.7 मिमी डीवी) की -lateral भाग।

डीबीएस के लिए एक तारों प्रणाली का उपयोग करते हुए संभावित compli द्वारा सीमित किया जा सकता हैइस तरह के तारों या जानवरों की आवाजाही की स्वतंत्रता की एक डिग्री कम से तोड़ने के रूप में फैटायनों। हालांकि, हमारे सेट-अप में, तारों जानवरों आसानी से ले जाने के लिए अनुमति दी है, जो swivels से जुड़े थे। विवो में वायरलेस उत्तेजक सिस्टम (अक्सर सिर पर तय हो या जानवर के ट्रंक में प्रत्यारोपित) भी बैटरी के लिए आवश्यकता के द्वारा सीमित हैं। बैटरी छोटे होने की जरूरत है, वोल्टेज इसलिए कम है। 1 MΩ इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, एक उच्च वोल्टेज वांछित उत्तेजना तीव्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और बदले में, बड़ा बैटरी या बैटरी की लगातार प्रतिस्थापन में यह परिणाम है। हालांकि, हमारे अध्ययन में इस्तेमाल प्रोत्साहन प्रणाली का एक लाभ यह है कि उत्तेजक और लगातार चालू उत्तेजना के विकल्प के बड़े वोल्टेज अनुपालन रेंज है। इस मोड में उत्तेजक इलेक्ट्रोड पर एक निरंतर वर्तमान उत्पादन प्रदान करने के लिए ऊतक प्रतिबाधा में परिवर्तन करने के लिए वोल्टेज समायोजित करता है। एक प्रतिबाधा परिवर्तन के रूप में के गठन के साथ डीबीएस की लंबी अवधि के पाठ्यक्रम पर उम्मीद हैतालिका ऊतक इलेक्ट्रोड इंटरफेस, इलेक्ट्रोड टिप 22 के जैसे, glial encapsulation।

सारांश में, इलेक्ट्रोड आरोपण की प्रस्तुत विधि आंदोलन की स्वतंत्रता को सीमित करने या यहां तक ​​कि लंबी अवधि के दौरान पशु घायल हुए बिना चूहों में एसटीएन की सटीक और सुरक्षित उत्तेजना अनुमति देता है, तकनीकी रूप से प्रदर्शन करने के लिए सरल, विश्वसनीय, और मजबूत है। छोटे संशोधनों के साथ (जैसे, अतिरिक्त बिजली outputs के साथ एक प्लग का उपयोग), इस प्रोटोकॉल भी STNs या अन्य मस्तिष्क संरचनाओं, लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग या दोनों, एक और मस्तिष्क क्षेत्र की गहरी मस्तिष्क संरचना की उत्तेजना और रिकॉर्डिंग गतिविधि दोनों में microelectrodes दाखिल द्वारा लागू है ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pt/Ir electrode FHC Inc. UE Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs GT Labortechnik (Arnstein/Germany) Custom-made
Pin header DISTRELEC 143-95-324 single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket DISTRELEC 143-95-621 single-row,straight 2 mm pole no.1 x 3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring Plastics ONE SS0102 Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur Heraeus Kulzer 64707938 Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur Heraeus Kulzer 64707954 Powder, rose, 500 g
Head screw Hummer & Reiss V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP Vetoquinol 435678/E04
Mepivacain 1% AstraZeneca PZN03338515
Epinephrine Sanofi-Aventis PZN00176118
Tramadolhydrochloride Rotexmedica 38449.00.00

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Microelectrode लंबे समय तक गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन के लिए चूहे की सबथैलेमिक न्यूक्लियस में इलेक्ट्रोड का आरोपण गाइडेड
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Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation. J. Vis. Exp. (104), e53066, doi:10.3791/53066 (2015).More

Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation. J. Vis. Exp. (104), e53066, doi:10.3791/53066 (2015).

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