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Neuroscience

微电极引导电极植入到大鼠丘脑底核的长期深部脑刺激

doi: 10.3791/53066 Published: October 2, 2015

Abstract

深部脑刺激(DBS)是一种广泛使用的和有效的疗法为几个神经系统疾病,例如特发性帕金森氏病,肌张力障碍或震颤。 DBS是基于递送电刺激中枢神经系统的特定深解剖结构。不过,DBS的效果背后的机制仍然是神秘的。这导致了兴趣调查DBS的在动物模型中的影响,特别是在大鼠。作为星展是一个长期的治疗,研究应集中在星展银行之后发生的数周神经回路的分子遗传学改变。长期DBS在大鼠是具有挑战性的,因为老鼠走动的笼子里,这将导致在保持到位,从动物到刺激的头部领先的电线问题。此外,靶结构刺激大鼠脑内都很小,因此电极不能很容易地放置在所要求的位置上。因此,设置为长效stimula使用铂/铱电极具有大约1兆欧的阻抗大鼠和灰这项研究开发的。这些规范的电极不仅允许足够的刺激,也记录脑深部结构,以确定目标区域的DBS。在我们的设置,用塞子为电线的电极包埋在牙科用粘固剂与固定在颅骨4锚固螺钉。从插头到刺激器的导线是由一个不锈钢弹簧保护。旋转接头被连接到电路,以防止电线的缠结。总体而言,这种刺激设置提供自由流动的高度为大鼠和使头部插头,以及在插头和刺激器之间的导线连接,以保持持久的强度。

Introduction

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深部脑刺激(DBS)是一种基于电脉冲通过植入电极,以特定脑结构中,递送一个治疗诸如内部苍白球1,底丘脑核(STN)2 - 4或腹侧中间丘脑5。在过去的二十年中,这种治疗方法已经被确立为一个有力的治疗工具为帕金森氏病1 - 4,张力障碍6和震颤7,并且也用于调节慢性疼痛7,精神障碍例如,强迫症8,抑郁症9)或难治性癫痫10,11。此外,DBS可能,在未来,成为耐火动脉高血压12或体位性低血压13一种治疗选择。

效果背后的生理机制DBS的仍然知之甚少。在研究啮齿动物的麻醉提供了深入了解,以模仿临床应用DBS 14高频刺激神经 ​​反应。然而,这些研究不仅缺乏的DBS影响行为的佐证,但也导致依赖于刺激参数相当大的变化应用14。

为了研究更简明星展银行在有意识的啮齿类动物行为的影响和作用机制,刺激建立是必要的,满足特定需求。 DBS大多用作长期治疗例如,帕金森氏病,慢性疼痛)。因此,刺激设置在啮齿类动物的设计应使该单元由一个插头,以及从插头向外部刺激器的导线的电极的;当固定在头骨这个单位应该是轻量级的,但牢不可破。此外,行动自由是必不可少的stimula在大鼠化过长时间。 DBS的目标结构是小的;例如,在大鼠中的STN的长度为1.2毫米和0.8毫米3,15的体积。因此,电极必须被设计为使得细胞核未插入时损伤并靶向需要是精确的。如在啮齿类动物进行最DBS研究已经使用的电极与靶结构基础的里程碑式的立体定向插入时,错误率可以是比较高的,根据Paxinos和Watson 16使用坐标时也是如此。这导致达到统计学上有意义的结果需要的动物的数量较多。

在本研究中的电极注入技术被引入,即通过使用一个microrecording系统,同时推进电极靶向以高精度在STN。此外,刺激系统,提出不仅允许移动性的刺激动物的高度,而且确保连续stimulati上通过的刺激导线的安全固定(这是由一个不锈钢弹簧保护)到大鼠的头部。

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Protocol

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动物实验批准了维尔茨堡大学和法治国家主管部门(下弗兰肯行政区,批准文号:54-2531.01-102 / 13)和执行根据的研究实验性卒中的建议,研究了17和当前的动物研究:的报告体内实验指南(http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines)。

1.麻醉

  1. 检查麻醉剂系统,以确保供应气体(氧气)和异氟烷足量的过程的持续时间。连接的立体定位仪的门牙条鼻锥,把门牙栏上的-3.3毫米。
  2. 打开供应气体(2L /分钟)。将大鼠成箱和密封的顶部。打开异氟烷蒸发器至3.5%。
  3. 当老鼠是横卧,切换系统,使麻醉气体流到被固定到所述门齿杆鼻锥。
  4. 删除RA吨从箱室和刮耳朵和眼睛之间的区域;用棉签浸泡Jodosept PVP,擦拭剃光区域,以消除任何松散的头发。
  5. 定位在鼻锥图1)的大鼠和继续用异氟烷2.5%麻醉中 O 2(1升/分钟)。按捏叉指区域检查麻醉的水平。如果大鼠充分麻醉,防御反射被取消(脚停药)。
  6. 手术过程中监测呼吸和刺激反应,并根据需要调整蒸发器。
  7. 取适量涂抹于眼兽医药膏,以防止干燥,而在麻醉下。监测和反馈控制的加热系统保持体温在37±0.5°C。

2.手术

  1. 保持术野消毒,整个手术过程中。一旦surgeon's手是无菌的并且操作字段是无菌的,只移动carefuLLY记得不要打破不育。这包括也是一个无菌区( 即,无菌防水窗帘),哪一个可以放下工具。
  2. 注入0.2 ml的甲哌卡因皮下进入剃区域的中心。甲哌卡因是局部麻醉剂具有至多3小时的作用持续时间。它会进一步麻醉手术区。
  3. 使用手术刀,使两耳之间中线切口开始并朝向2厘米延伸。确保骨膜(皮肤下有光泽的膜)也被切开。暴露四个夹( 图2)的头骨。
  4. 用棉签,轻轻地取下骨膜,直到冠状面和矢状缝暴露;此后,止住血用脱脂棉。
  5. 确定使用针固定在探头座前囟的坐标,然后标记针用黑色毡尖笔的尖端。使用前/后(AP)中线/外侧(ML)和背腹(DV)驱动螺丝,定位针的尖端直接在囟。
  6. 参加AP和ML游标刻度读数:减去3.6毫米从AP的阅读和2.5毫米的ML读数电极植入右侧STN,或加入2.5毫米的电极植入左STN。针的尖端下降到颅骨的表面上后,此位置将被标记的毡尖笔的染料。
  7. 夹紧牙钻到立体定位仪的大探头支架。将牙钻来计算的区域- 即,在头骨的标记点。看,通过显微镜,钻透头骨的孔(直径约1毫米),直到硬脑膜是可见的(头骨为约1毫米厚)。缩回使用显微解剖钳或消毒针头硬脑膜。硬脑膜是艰难的,足以摧毁电极的尖端。
  8. 上钻孔,在每个正面鳞的牙钻,并且在整型erparietal相对的电极孔鳞。断开立体定位仪的探头支架。不要在颅骨缝钻的静脉血管遵循头骨下缝合。
  9. 拧接骨螺钉到每一个五杆洞的。避免螺纹螺钉陷得太深。对于不锈钢螺丝(M1.6),2-3圈的螺丝将充分保持螺丝没有把压力对大脑。匝数取决于螺杆的螺距。夹紧探头支架具有图3)中的显微电极。
  10. 使用AP,ML和DV的驱动器螺钉,移动探头保持器与电极直到其前端几乎触及前囟。请注意AP,ML和DV游标刻度读数前囟门。当读数制成,提高电极几毫米以防止电极从运动期间刮头骨。为了确定位置的坐标,其中所述电极,必须在插洞口,增加3.6毫米到AP的阅读,并添加(或减)2.5mm至的ML阅读。
  11. 使用AP和ML驱动螺丝,移动电极所计算的位置。在这一点上,电极尖端应当直接位于在钻孔电极孔。然后,通过查看通过显微镜,降低电极到硬脑膜图4)的水平。这个水平作为零电平在DV方向。然后,轻轻地通过观察通过显微镜插入电极进入大脑的尖端。
  12. 连接电极销到记录系统的连接器。放一个法拉第笼(或用铝箔代替它)在大鼠中的立体定位仪图5)。接地立体定位仪与在正在处理房间的平衡。
  13. 启动记录系统。如果有的话,还可以使用扬声器advancin过程中获得的排放/单台药膏的声信号克的电极。
  14. 慢慢推进电极在录制过程中的电活动插入电极进入大脑。在距硬脑膜之间7.5和8.1毫米的深度,在STN的特定电活性通常是可检测的图6)。在STN神经元的典型活性的特征在于不规则的点火模式和高的发射率(平均频率:40.9±12.9赫兹)18。
  15. 在记录,减少尽可能麻醉例如,0.8-1.0%);低动物麻醉显示更清晰的电子大脑活动。
  16. 拭远降低电极时被置换在颅骨的表面上的任何血液或脑脊液。
  17. 混淆少量牙科水泥和应用它周围的电极及其周围的四个使用小刮铲图7)的五个螺钉。第五螺钉将用于固定插头的接地线。
  18. 断开记录系统的电极座和连接器的电极销,当牙科用粘固剂固定。
  19. 拧开,这不是固定的牙科水泥螺丝。将电源插头上的电极针。固定与第五螺钉图8)插头的接地线。
  20. 混合了牙科水泥和运用它周围的插头。作为水泥变稠,模具它周围的插头,以形成一个盖。避免牙科水泥可能危害动物和硬化( 图9A和 B)中删除它们锋利的边缘。
  21. 清创伤口边缘和带缝线关闭它们的前部和所述盖的后面。消毒伤口边缘。
  22. 头部插头连接到被固定在一个旋转的导线。从立体定位仪中取出老鼠。
  23. 每日一次申请的曲马多(12.5毫克/千克,经腹膜内)在干预结束时,然后2-3天。放置老鼠在一个干净的笼THERMAl支持,固定在这个笼子( 图10)旋转,仔细检查它1小时。
  24. 不要让动物无人看管,直到它重新获得足够的意识,以保持胸骨斜卧。不返回已经历手术给其他动物的公司,直到完全恢复的动物。

3.刺激

  1. 确定使用阻抗计在动物的电阻刺激前。
  2. 连接旋转的插头用导线和插头在导线与当前输出的另一端和用于刺激器的地线的输出。连接刺激与计算机,以便在节目的刺激器。
  3. 选择刺激方案的参数;例如,在帕金森氏病中使用的参数是脉冲长度:60微秒;频率:130赫兹。与增加的电流幅值刺激老鼠,直至运动障碍的认可。减少日电子电器强度由强度低于10-20%是引起运动障碍,或直至神经症状消失,所述动物是舒适。单相矩形脉冲在此研究中使用。
  4. 在完成实验后,安乐死用异氟烷动物:调整isofurane流量或浓度为5%或更大。继续异氟醚曝光,直至呼吸停止后1分钟。

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Representative Results

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植入电极插入用的记录系统大鼠的STN - 作为这里提出 - 是一种有效和精确的程序的DBS该取每只动物约1小时。这个模型是一个相当小的过程:10只进行手术,全部存活的干预。介入后二十四小时,将每只大鼠的状态进行监测,并没有动物根据严重码实现了超过1的3个点。在连续刺激(14天,24小时的天)期间,没有电线脱落,破裂或被咬伤过。没有一个10只失去牙科水泥盖也没有他们得到由设备过程中刺激的阶段受伤。刺激前,这10个动物测得的阻抗为353±101千欧。大鼠刺激,在130赫兹的频率和60微秒的脉冲宽度。平均刺激强度为60μA,这是设定在20%以下的颜面部或续强门槛ralateral前爪运动障碍,从而防止在刺激的期限问题,喂养或运动。

干预和连续刺激后第14天,全部10只断头后实施安乐死深麻醉和大脑正在迅速收获。在大鼠脑基质,2毫米厚的脑块包围在STN被切断,立即冷冻在-80℃。这些脑块切成冠状切片(8微米厚)。每个切片用苏木精 - 伊红进行可视化,其中电极的尖端位于的位置,以及检测唱炎症或瘢痕组织由于电极。成功率用于定位电极在STN为10只动物的8。在这些8只大鼠中,植入电极的尖端位于在STN,如图组织学。 图11示出了在STN电极位置。连续ST后开发的小病灶imulation都发现了老鼠。这种病变是周围有少量炎症细胞( 图11)。

图1
图1.固定头部的立体定向仪,大鼠是固定的立体框架的耳棒,以及由气体麻醉面罩。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.暴露颅骨后正中切口,皮肤和骨膜被卷到伤口边缘,并远离使用四个夹子手术区域。 请点击此处查看大 - [R版本这个数字。

图3
图3.固定在一探头座的电极。使用镊子,电极的销插入在插塞和固定有探针支架。该插件是通过导线与记录装置相连。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.插入在大脑中的电极。在确定确切AP和底丘脑核ML坐标,电极的前端前进到穿刺硬脊膜的水平和背腹游标刻度读数取。获得=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.保护电气干扰。一个法拉第笼(或者,铝箔)放置在在立体定位仪,仪器,以及动物的老鼠,是接地。 请点击此处查看大图这个数字。

图6
图6.记录大脑活动的丘脑底核(STN)显示了一个不规则的射击模式和高发射率(平均频率:40.9±12.9赫兹)18。在进入了STN,电极穿过一个相对无声区域,这是与未定带相符;垂直SIZ电子商务这方面的措施,约0.5-1毫米。此后,峰值数量的增加,表明插入STN完成。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
图7.固定电极,当底丘脑核是由记录装置识别,则电极被固定通过施加牙科用粘固剂在电极柄和螺钉。这使得从电极针的连接器拔下不移位电极的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8
图8. Attachi纳克插头到电极针的插头的刺激器的连接器连接到所述电极销。接地线,这是焊接在插头,是用螺钉固定到颅骨。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9
图9.固定插头。(A)正面 (B)的侧视图。牙科用粘固围绕插头施加并形成帽;应避免锋利的边缘。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10
图10.连接大鼠给stimul员,一个旋转也加入到电路,以防止电线的缠结。一个不锈钢弹簧保护线如果老鼠开始咬的丝。 请点击此处查看该图的放大版本。

图11
通过丘脑底核(STN)(苏木精-伊红染色)图11.大脑部分。(一)概述 ,放大倍率2.5。实线包围的STN。一个小的病变是可见其中电极头位于期间刺激14天。值得注意的是,没有渗透管的电极的可见光(柄直径:125微米),这表明该电极保护组织。 ( 二)从画面A(盒)图片详情,放大倍率100少数炎性细胞是病灶周围可检测由于脑组织到电极尖端的反应。箭头:表示一种炎性细胞的例子,请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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这项研究提出了一个一步一步的指令集,用于植入单极慢性电极插入老鼠的STN。虽然具有低阻抗钨电极通常用于DBS 18,19,由铂/铱(铂/铱)溶液采用该具有约1兆欧的阻抗的单极电极。铂/铱电极也可用于治疗帕金森氏病,因为它们的有利性质的:它们显示最低侵蚀20,不产生,如果没有高的电荷密度被用于相关组织损伤21。由于本研究的目的是一个长期刺激设置和,以达到一个平移的方法,用上述规格的电极,在本实验中的应用。脑切片示出电极头的定位的组织学检查证实了的Pt /铱22在这个实验中的减毒的异物反应。

ENT“>在本研究中,铂/铱为1MΩ的阻抗电极使用。电极较低,或甚至更高的阻抗,只适合于任一记录脑活动或用于刺激脑的结构,但不能同时在相比之下,1兆欧的电极阻抗,如在我们的研究中所用,是适合于,记录的脑深部区域的活性和刺激大脑结构,如在STN。记录的主要优点是在STN位置中一个的识别,时间记录短量允许STN可靠的定位,因为我们的研究结果表明:组织学控制产生针对STN(8 10的动物)的高成功率的电极尖端植入背的上部细胞层这是已知的,主要接收电动机输入来自运动皮层23:在STN(7.7毫米的DV)的-lateral部。

使用星展集团的布线系统可能潜在compli限制阳离子如破线或动物的移动的自由程度低的。然而,在我们的设置,所述电线被连接到旋转接头,其允许动物自由移动。无线体内刺激系统(通常固定在头部或注入到动物的主干)还受对电池的要求。作为电池需要是小的,电压因此低。当使用1兆欧电极,需要高电压以实现所需的刺激强度,并反过来,将导致更大的电池或频繁更换电池。然而,在我们的研究中所使用的刺激系统的一个优点是,刺激器和恒定电流刺激的选项的大顺从电压范围。在这种模式下,刺激器调节的电压的变化,组织阻抗,以提供在电极的恒定电流输出。阻抗的变化,预计在星展银行的长期使用过程中,作为形成表组织-电极的界面,电极头22的 例如,胶质封装。

总之,电极植入了该方法在技术上是简单的执行,可靠,坚固的,允许大鼠在STN的准确和安全的刺激不限制移动自由,甚至受伤长期过程中的动物。用小的修改例如,使用具有附加电输出的插头),该协议也可以适用通过在两个STNS或其它脑结构,长期的录音或两者,脑深部结构的刺激另一脑区域和记录活动植入微电极。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pt/Ir electrode FHC Inc. UE Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs GT Labortechnik (Arnstein/Germany) Custom-made
Pin header DISTRELEC 143-95-324 single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket DISTRELEC 143-95-621 single-row,straight 2 mm pole no.1 x 3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring Plastics ONE SS0102 Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur Heraeus Kulzer 64707938 Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur Heraeus Kulzer 64707954 Powder, rose, 500 g
Head screw Hummer & Reiss V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP Vetoquinol 435678/E04
Mepivacain 1% AstraZeneca PZN03338515
Epinephrine Sanofi-Aventis PZN00176118
Tramadolhydrochloride Rotexmedica 38449.00.00

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References

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Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation. J. Vis. Exp. (104), e53066, doi:10.3791/53066 (2015).More

Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation. J. Vis. Exp. (104), e53066, doi:10.3791/53066 (2015).

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