微小電極は、長期的な脳深部刺激のためのラットの視床下核に電極の移植ガイド付き

Abstract

脳深部刺激（DBS）は、特発性パーキンソン病、ジストニアまたは振戦などのいくつかの神経障害のために広く使用され、効果的な治療です。 DBSは、中枢神経系の特定の深い解剖学的構造への電気刺激の配信に基づいています。しかし、DBSの効果のメカニズムは謎のままです。これは、特にラットに、動物モデルにおいてDBSの影響を調査の関心につながっています。 DBSは、長期的な治療であるため、研究はDBS後数週間を発生する神経回路の分子遺伝的変化に焦点を置くべきです。ラットは所定の位置に刺激に対する動物の頭からの導線を維持するのに問題が発生し、そのケージに動き回るため、ラットの長期DBSは困難です。また、ラットの脳内の刺激のための標的構造は、小型であり、したがって、電極は、容易に必要な位置に配置することができません。このように、長期的なstimulaためのセットアップ約1MΩのインピーダンスと白金/イリジウム電極を用いたラットの化は、この研究のために開発されました。これらの仕様と電極は、適切な刺激だけでなく、DBSのためのターゲット領域を識別するために、脳深部構造の記録だけでなくすることができます。我々のセットアップでは、ワイヤ用のプラグと電極を頭蓋骨に固定4本のネジで固定する歯科用セメントに埋め込まれました。刺激へのプラグからワイヤーをステンレス製のスプリングにより保護されていました。スイベルは、もつれたならワイヤを防止するために回路に接続しました。全体的に、この刺激のセットアップは、ラットのための自由移動性の高い学位を提供し、長期的な強度を保持するために、ヘッドプラグだけでなく、プラグと刺激間の配線の接続を可能にします。

Introduction

⁴または腹側中間視床^{5 -}脳深部刺激（DBS）は、内部の淡蒼球^1、視床下核^（STN）2のような特定の脳構造に埋め込 ​​まれた電極を介した電気インパルスの配信に基づいて治療法です。過去20年間では、この治療は、パーキンソン病¹のための強力な治療ツールとして確立されている^{- 4、}ジストニア⁶と震え^7、および慢性疼痛^{7を変調するために}も使用され、精神障害（ すなわち 、強迫性障害^8、大うつ病^9）または難治性てんかん^10,11。また、DBSは、将来的には、耐火動脈高血圧¹²や起立性低血圧¹³のための治療選択肢になるかもしれません。

効果の基礎となる生理学的メカニズムDBSのよくわかっていないままです。麻酔をかけたげっ歯類での研究は、臨床的にDBS ¹⁴適用模倣高頻度刺激に神経応答への洞察を提供してきました。しかしながら、これらの研究は、DBS効果の行動の裏付けを欠くだけでなく^{、14を適用した}刺激パラメータに応じてかなりのばらつきが生じます。

より簡潔に意識げっ歯類におけるDBSの行動への影響と根底にある機構を調べるために、刺激のセットアップには、特定の要件を満たすことが必要です。 DBSは、主に、長期療法として使用されている（例えば、パーキンソン病、慢性の痛み）。ユニットはプラグと同様に、外部刺激へのプラグからのワイヤと電極で構成されるようにこのように、げっ歯類における刺激セットアップを設計する必要があります。頭蓋骨に固定されたときや、本機は、軽量で割れないでなければなりません。また、移動の自由はstimula中のラットのために不可欠です長期にわたってる。 DBSの標的構造は小さいです。例えば、ラットにおけるSTNは1.2mmの長さおよび0.8 mmの^3,15の体積を有します。したがって、電極は、核が挿入中に損傷しないように設計されており、正確にニーズを標的としなければなりません。げっ歯類で行わ最もDBS研究は、標的構 ​​造に対して電極のランドマークベースの定位挿入を使用しているように、エラーレートがPaxinosとWatsonの¹⁶に従って座標を用いた場合であっても、比較的高いとすることができます。これは、統計的に意味のある結果に到達するために必要な動物の多数を生じます。

本研究では、電極注入法は、電極を進めながらmicrorecording系を用いて高精度にSTNを標的とする、導入されます。また、刺激システムは、刺激された動物のための移動性の高度を可能にするだけでなく、連続stimulatiを保証しない提示されていますラットの頭の上に（ステンレス製スプリングで保護されている）刺激線の確実な固定を介した上で。

Protocol

動物実験は、ヴュルツブルク大学と法的状態当局（ウンターフランケン、承認番号：54-2531.01-102 / 13）によって承認された、実験ストロークでの研究のための推奨に従って行っ^17を研究し、現在の動物実験：の報告in vivo実験ガイドライン（http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines）。

1.麻酔

1. 手続きの期間中、供給ガス（酸素）およびイソフルランの適切な量を確保するための麻酔システムをチェックしてください。定位固定装置の切歯バーをノーズコーンを接続し、-3.3ミリメートルに切歯バーを置きます。
2. 供給ガス（2 L /分）をオンにします。ボックスにラットを置き、上部を密封します。 3.5％にイソフルラン気化器の電源をオンにします。
3. ラットが横臥のとき麻酔ガスは、切歯バーに固定されたノーズコーンに流れるように、システムを切り替えます。
4. RAを削除ボックス室からトンと耳と目の間の領域を剃ります。 Jodosept PVPを浸した綿棒を使用して、任意の緩い毛を取り除くために剃った領域を綿棒。
5. ポジションノーズコーンにおけるラット（ 図1）とO _2（1リットル/分）でイソフルラン2.5％で麻酔を続けます。インターデジタルの領域をつまんで麻酔のレベルを確認してください。ラットを十分に麻酔されている場合は、守備の反射は（足のすなわち 、撤退を）廃止されています。
6. 手順の間刺激に呼吸し、応答を監視し、必要に応じて気化器を調整します。
7. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。監視およびフィードバック制御加熱方式により37±0.5℃の体温を維持します。

2.手術

1. 全体の手術中に無菌手術野を保管してください。 surgeon's手は無菌であり、動作フィールドは、滅菌すると、のみcarefuを移動LLYと無菌状態を壊さないように覚えています。これも一つの楽器を下に設定することができるの無菌領域（ すなわち、滅菌防水ドレープ）を有する含まれています。
2. 剃っエリアの中心にメピバカイン皮下0.2ミリリットルを注入。メピバカインは、最大3時間の作用持続時間を有する局所麻酔薬です。さらに、手術領域を麻酔ます。
3. メスを用いて、正中切開は耳の間に開始し、2センチメートルに向かって延在作ります。骨膜（皮膚の下に光沢のある膜）も切開されていることを確認します。 4クランプ（ 図2）で頭蓋骨を公開します。
4. 綿棒を使用して、冠状および矢状縫合が露出するまで静かに骨膜を取り除きます。その後、綿ウールで血を止めます。
5. プローブホルダに固定された針を用いてブレグマの座標を決定し、黒のサインペンで針の先端をマーク。前方/後方（AP）を使用して、正中線/横（ML）と背腹（DV）の駆動ネジは、直接ブレグマの上に針の先端を置きます。
6. APとMLバーニアスケールの測定値を取る：APの読みから3.6ミリメートルを引き、右STNに電極注入のための読書のMLから2.5ミリメートル、または左STNに電極注入の2.5ミリメートルを追加します。この位置は、頭蓋骨の表面に針の先端を下げた後、フェルトペンの色素によってマークされます。
7. 定位固定装置の大型プローブホルダーに歯科用ドリルを固定します。 すなわち、頭蓋骨上の印を付けた点-計算された領域に歯科用ドリルを移動します。硬膜が表示されるまで、顕微鏡で見ると、（頭蓋骨は約1mmの厚さである）頭蓋骨の貫通孔（直径約1mm）を開けます。マイクロ解剖鉗子または滅菌針を用いて硬膜を撤回。硬膜は、電極の先端を破壊するのに十分なタフです。
8. 各前頭鱗であり、int型に歯科用ドリルで穴を開け電極穴にerparietal鱗の反対。定位固定装置からのプローブホルダを外します。静脈血管が頭蓋骨の下に縫合糸をたどるよう頭蓋骨縫合糸をドリルしないでください。
9. 5つの穴のそれぞれに骨ねじをねじ込みます。深すぎるでネジをねじ込むことは避けてください。ステンレス製ねじ（M1.6）は、ねじの2-3ターンは十分に脳に圧力をかけることなく、ねじを保持します。巻き数は、ねじのピッチに依存します。マイクロマニピュレーターで、電極（ 図3）とプローブホルダーを固定します。
10. 先端がほぼブレグマに触れられるまで、AP、MLとDVドライブネジを使用して、電極とプローブホルダを移動します。ブレグマでのAP、MLとDVバーニアスケールの測定値に注意してください。朗読が行われた場合には、移動中に頭蓋骨をこするから電極を防ぐために、電極を数ミリメートルを上げます。電極に挿入する必要がある位置の座標を決定するために穴にMLの読み取りには、APの読み取りに3.6ミリメートルを追加し、追加（または減算）2.5ミリメートル。
11. APとMLドライブネジを使用して、計算された位置に電極を移動します。この時点で、電極先端が掘削電極穴の真上に位置する必要があります。その後、顕微鏡を通して見ることにより、硬膜（ 図4）のレベルに電極を下げます。このレベルは、DV方向のゼロレベルとして機能します。その後、静かに顕微鏡で見ることによって、脳への電極の先端を挿入します。
12. 記録システムのコネクタに電極ピンを接続します。定位固定装置（ 図5）で、ラットの上にファラデーケージを入れて（またはアルミホイルでそれを置き換えてください）。で働いていたされている部屋のカウンターポイズと定位固定装置を接地してください。
13. 記録システムを起動します。可能な場合、またadvancin時は、1単位の放電/軟膏の音響信号を得るためにスピーカーを使用G電極。
14. ゆっくり電極を進める中の電気活動を記録することにより、脳内に電極を挿入します。硬膜から7.5の間と8.1ミリメートルの深さで、STNの特定の電気的活動は、（ 図6）は、通常、検出可能です。 ^18：STNのニューロンの典型的な活動が不規則な発火パターンと高発火率によって特徴付けられる（40.9±12.9 Hzの周波数を意味します）。
15. 録音中に、（0.8から1.0パーセントに、 例えば ）できるだけ多くの麻酔を減らします。低麻酔動物は明確に電気脳の活性を示します。
16. 電極を下げたときに、頭蓋骨の表面で移動された任意の血液や脳脊髄液を離れて綿棒。
17. 歯科用セメントの少量を混合し、電極の周りに、小さなへら（ 図7）を使用して、5本のネジの4の周りにそれを適用します。第五のネジは、プラグのアース線を固定するために使用されます。
18. 歯科用セメントが固定されたときに記録システムの電極ホルダーとコネクタから電極ピンを外します。
19. 歯科用セメントで固定されませんでしたネジを外します。電極ピンのプラグを入れてください。第五ネジ（ 図8）とプラグのアース線を固定してください。
20. 歯科用セメントを混合し、プラグの周りにそれを適用します。セメントが厚くなるように、キャップを形成するために、プラグの周りにそれを成形。動物に害を与えると（ 図9Aおよび B）硬化中にそれらを除去することができる歯科用セメントのシャープなエッジを避けてください。
21. 傷のエッジを創面切除し、前面にキャップの後ろに縫合糸でそれらを閉じます。傷のエッジを消毒します。
22. スイベルに固定されたワイヤにヘッドプラグを接続します。定位固定装置からラットを削除します。
23. 2〜3日間毎日一回、その後の介入の最後にトラマドール（12.5ミリグラム/キログラム、腹腔内）を適用し、。 THERMAと清潔なケージにラットを置き、リットルのサポートは、このケージ（ 図10）にスイベルを修正し、1時間慎重に検査します。
24. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。

3.刺激

1. インピーダンスメータを用いて、刺激の前の動物の抵抗を決定します。
2. ワイヤと電流出力を有するワイヤの他端のプラグと刺激装置のアース線用の出力とスイベルのプラグを接続します。刺激をプログラムするために、コンピュータと刺激を接続します。
3. プログラム内の刺激のパラメータを選択してください。例えば、パーキンソン病に使用されるパラメータは、パルス長さ：60μ秒;周波数：130 Hzの。ジスキネジアが認識されるまで増加する電流振幅を有するラットを刺激します。目を削減ジスキネジアを誘発強度以下の10〜20％で、または神経学的徴候が消え、動物が快適になるまで電子電界強度。単相矩形パルスをこの研究で使用しました。
4. 実験を完了した後、イソフルランで動物を安楽死さ：5％以上にisofurane流量や濃度を調整します。停止を呼吸した後、1分までイソフルラン暴露を続けます。

Representative Results

記録システムを用いてラットのSTNに電極を移植する - ここに提示されるようなことは - 動物あたり約1時間かかりますDBSための効果的かつ正確な手順です。このモデルは、かなりマイナーな手順です：手術を施したラット10匹のうち、すべての介入を生き延びました。介入後の二十四時間は、各ラットの状態をモニターし、何の動物は、重大度コードに応じて1以上3点を達成していません。連続刺激（14日、24時間日）の期間中は、ワイヤが取り外されていない、または壊れを通して噛まれました。 10匹のラットのいずれも、歯科用セメントのキャップを失ったことも、彼らは刺激のフェーズの間に設備によって傷つくました。刺激前に、これらの10の動物で測定されたインピーダンスは353±101kΩのでした。ラットは、130ヘルツの周波数及び60マイクロ秒のパルス幅で刺激しました。平均刺激強度は、口腔顔面または続きの強度閾値を下回る20％に設定した60μAでしたralateral前足の運動障害は、それによって、刺激の期間中に給餌や移動の問題を防止することができます。

14日の介入と連続刺激の後、すべての10匹のラットを深麻酔後に断頭により安楽死させ、脳を迅速に回収しました。ラット脳マトリックスにおいて、STNを取り囲む2mm厚の脳ブロックを切断し、直ちに-80℃で凍結しました。これらの脳のブロックは、冠状切片（厚さ8μm）で切断しました。各セクションは、電極の先端が配置された位置を視覚化するだけでなく、電極に起因する炎症または瘢痕組織を歌う検出するために、ヘマトキシリン​​＆エオシンで染色しました。 STNに電極をローカライズするための成功率は10匹の動物の8でした。組織学的に示すように、これら8ラットでは、移植され、電極の先端が、STNに位置した。 図11は 、STNにおける電極の位置を示しています。連続ST後に開発した小型病変imulationは、すべてのラットに認められました。この病変は、炎症性細胞（ 図11）の数が少ないに囲まれていました。

定位固定装置におけるヘッドの図1.固定は。ラットを定位フレームの耳のバーによって、同様にガス麻酔マスクで固定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

頭蓋骨を公開図2.。正中切開した後、皮膚や骨膜は、創傷縁に巻かれており、4クランプを使用して、手術領域から遠ざけ。 大型を見るにはこちらをクリックしてくださいこの図のRバージョン。

プローブホルダにおける電極の図3固定は、鉗子を使用して、電極のピンは、プラグに挿入され、プローブホルダに固定されています。プラグは、ワイヤを介して記録装置に接続されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

脳内の電極の図4.挿入は。視床下核の正確なAPおよびML座標を決定した後、電極の先端がパンクした硬膜のレベルに進むと背腹バーニアスケールの読みが取られています。= "_空白"を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

電気的干渉の図5.保護。ファラデーケージ（あるいは、アルミ箔）を定位固定装置、機器だけでなく、動物におけるラットの上に置かれた、接地されている。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。

脳活動の図6.録音視床下核（STN）は、（周波数平均：40.9±12.9 Hz）で不規則な発火パターンと高発火率を示している^。18。 STNに入る前に、電極は、不確帯と一致している比較的サイレント領域を​​通過します。垂直SIZこの地域対策について0.5〜1ミリメートルの電子。その後、STNへの挿入が完了したことを示すスパイクの数が増加するが、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

電極の図7固定。視床下核は記録によって識別されると、電極は、電極軸部とねじの周りに歯科用セメントを塗布することにより固定されています。これは、電極の位置をずらすことなく、電極ピンからコネクタの抜き差しが可能になります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8. Attachi電極端子にプラグをngの。刺激装置のコネクタ用プラグは、電極端子に接続されています。プラグに半田付けされているアース線は、頭蓋骨の上にネジで固定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プラグの図9.固定。（A）正面および（B）側面図。歯科用セメントは、プラグの周りに適用され、キャップが形成されます。シャープなエッジを避けるべきである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

stimulに対するラットの図10.接続レータ。スイベルは、もつれからワイヤを防止するために回路に結合されました。ラットは、ワイヤを噛まないように開始する場合はステンレス鋼ばねワイヤを保護します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

視床下核（STN）を通じて図11.脳切片（ヘマトキシリン＆エオシン染色）。（A）の概要、倍率2.5。実線はSTNを取り囲んでいます。電極先端を刺激の14日の期間中に位置していたところ、小さな病変が見えます。電極が組織を温存していることを示す、：それは電極の可視（125μmのシャンク径）のない浸透運河が存在しないことに注意すべきです。画像A（ボックス）から（B）イメージの詳細、倍率100の少数炎症性細胞は、電極チップの脳組織の反応に病変の周りに検出可能でした。アロー：炎症性細胞の例を示す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

本研究では、ラットのSTNにモノポーラ慢性電極を移植するための命令のステップバイステップのセットを提供します。低インピーダンスのタングステン電極は、多くの場合、DBS ^18,19のために使用されているが、白金/イリジウム白金（Pt / Ir）から製の単極電極は、約1MΩのインピーダンスを持っていたことを採用しました。 Pt / Irの電極はまた、それらの好ましい特性のパーキンソン病の患者に使用されている：彼らは、最小限の浸食^{20を示し、}何の高電荷密度が使用されていない場合は、関連する組織損傷^{21を生成しません} 。本研究の目的は、長期刺激のセットアップであり、翻訳のアプローチを実現するために、上記の仕様の電極を本実験に適用された。以来電極先端の局在を示した脳切片の組織学的検査では、この実験でのPt / Irの²²の弱毒異物反応を裏付け。

ENT ">本研究では、1MΩのインピーダンスとのPt / Irは電極を使用した。低い、またはより高いインピーダンスを有する電極、記録脳活性のいずれかまたは脳の構造を刺激するためにのみ適していますが、両方ではない。でこれに対し、1MΩの電極インピーダンス、我々の研究で使用されるように、両方のために適しており、深部脳領域の活動を記録し、例えば、STNなどの脳の構造を刺激する。記録の主な利点は、STNでの位置の同定であります短い時間の録音が我々の結果は示しているように、STNの信頼性の局在を可能にする：組織学的制御は（10匹の動物の8）STNを標的に高い成功率が得られた電極先端が背の上部セル層に移植しました運動皮質^23から主にモータの入力を受信することが知られている：STN（7.7ミリメートルDV）のラテラル・一部。

DBSのための配線システムを使用することの潜在的なcompliによって制限され得ますこのような配線の断線や動物の移動の自由度が低いような陽イオン。しかし、我々のセットアップでは、ワイヤは、動物が自由に移動することができるスイベルに接続しました。ワイヤレスin vivoで刺激システム（多くの場合、先頭に固定または動物のトランクに移植）も、電池の要件によって制限されています。電池は小さくする必要があるように、電圧は、従って低いです。 1MΩの電極を使用する場合、高電圧は、所望の刺激強度を達成するために必要とされると、今度は、より大きな電池または電池の頻繁な交換をもたらします。しかし、本研究で使用した刺激システムの利点は、刺激と定電流刺激の選択肢の大きな電圧コンプライアンスの範囲です。このモードでは、刺激装置は、電極に一定の電流出力を提供するために、組織インピーダンスの変化に電圧を調整します。インピーダンス変化をなどの形成とDBSの長期にわたって期待されていますテーブル組織-電極界面、 例えば、電極チップ²²のグリアカプセル化。

要約すると、電極注入の提示方法は、移動の自由を制限する、あるいは長期の過程で動物を傷つけることなく、ラットでSTNの正確かつ安全な刺激を可能にする、技術的には、実行するのが簡単で信頼性が高く、堅牢です。小さ ​​な修飾 （例えば、追加の電気出力とプラグを使用して）で、このプロトコルは、STNsまたは他の脳の構造、長期的な録音や、脳深部構造の刺激や他の脳の領域の記録活性の両方ともに微小電極を移植することによって適用されます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pt/Ir electrode	FHC Inc.	UE	Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs	GT Labortechnik (Arnstein/Germany)		Custom-made
Pin header	DISTRELEC	143-95-324	single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket	DISTRELEC	143-95-621	single-row,straight 2 mm pole no.1 x 3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring	Plastics ONE	SS0102	Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Powder, rose, 500 g
Head screw	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinephrine	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochloride	Rotexmedica		38449.00.00