Summary
कई कोण का उपयोग कर माउस पिल्ला मस्तिष्क में कटौती करने के लिए, हम प्रमुख श्रवण मध्यमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क संरचनाओं के अधिकांश के बीच कनेक्शन को दर्शाता है जो एक पहले से वर्णित तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा पर सुधार होगा।
Introduction
संवेदी परिधि और अवर colliculus के बीच सूचना के पर्याप्त प्रसंस्करण है, हालांकि वहां यह श्रवण प्रांतस्था तक पहुंचने से पहले श्रवण प्रणाली में, काफी अतिरिक्त संसाधन नहीं है। हम जानते हैं कि प्रसंस्करण किया और कहा कि परिवर्तन मस्तिष्क भेजे गए संवेदी जानकारी की व्याख्या करने के लिए अनुमति देता है के बारे में कैसे इसलिए थोड़ा है के बारे में बहुत कम जानते हैं। महक के अपवाद के साथ, इंद्रियों में से प्रत्येक के शुरू में संकेत कोर्टेक्स के लिए ascends के रूप में गिरावट आती है, जो उच्च निष्ठा के साथ रिले किया जा रहा परिधीय संकेतों के साथ एक बहुत ही इसी संगठन है। कोर्टेक्स तो आगे आने वाली जानकारी को व्यवस्थित करना कम संरचनाओं के अनुमानों को भेजता है। इस जटिल प्रणाली vivo में के रूप में अच्छी तरह के रूप में इन विट्रो तैयारियों की संख्या में तरीकों की एक किस्म में अध्ययन किया गया है। पूर्व में, सभी कनेक्शनों संवेदी इनपुट को नियंत्रित करने और मापने, जबकि कनेक्शन के किसी सेट की जांच के लिए शोधकर्ता, सक्रिय करने बरकरार हैंकिसी भी क्षेत्र में उत्पादन। इस दृष्टिकोण के साथ, एक बेहद जटिल उत्पादन को जन्म दे रही है, अन्य संवेदी आदानों, उत्तेजना, और ध्यान देने सहित अन्य आदानों की बड़ी विविधता का कोई नियंत्रण नहीं करने के लिए कुछ नहीं है। इन विट्रो, मस्तिष्क के स्लाइस एक भी सेट या तो कब्जा करने की कटौती की गई है शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित और afferents या मस्तिष्क क्षेत्रों विभिन्न मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं जो अनुमानों, या दो जुड़े मस्तिष्क क्षेत्रों की। ये अक्सर चेतक के लिए इनपुट या चेतक और कोर्टेक्स के लिए अपनी उत्पादन या तो 2-5 संरक्षित कर रहे हैं, जहां thalamocortical या tectothalamic या तो स्लाइस हैं। इन तैयारियों, औषधीय बिजली, और optogenetic जोड़तोड़ की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि केवल दो मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ, वे मुख्य रूप से सूचना के हस्तांतरण का मूल्यांकन करें और यह चेतक के माध्यम से गुजरता के रूप में जानकारी के परिवर्तन का मूल्यांकन करने की क्षमता की कमी है। यह भी ध्यान देने मॉडुलन में एक भूमिका निभा सकता है जो reticulo-thalamic प्रक्षेपण, 6-9 पीआर हैइस टुकड़ा में ESENT। यहाँ हम कैसे चेतक फाटकों और फिल्टर जानकारी का एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य देने के लिए चेतक के लिए विभिन्न आदानों की अन्वेषक नियंत्रण की अनुमति देता है जो हमारे पिछले तैयारी 1, पर सुधार प्रदर्शित करता है। हम जोड़े को एक एकल कोशिका के स्तर पर विभिन्न आदानों के प्रभाव को मापने के लिए टुकड़ा कनेक्टिविटी और बड़े पैमाने पर सक्रियण विश्लेषण, न्यूरोनल आबादी के विश्लेषण के लिए चेतक में कैल्शियम इमेजिंग, और एकल कक्ष रिकॉर्डिंग का आकलन करने के लिए flavoprotein autofluorescence इमेजिंग के साथ इस उपन्यास टुकड़ा तैयारी।
इन बड़े पैमाने पर कनेक्शन को बनाए रखने में सहायता करने के लिए हम भी बढ़ाया छिड़काव के लिए टुकड़ा तरक्की के लिए जगह में मस्तिष्क टुकड़ा और एक पुल के आयोजन के लिए सामान्य टुकड़ा लंगर (उर्फ "वीणा") के संशोधनों के एक नंबर का विकास किया है। वीणा टुकड़ा चारों ओर और वीणा के तार के लिए अनुकूलन लगाव अंक के लिए अनुमति देने के लिए एक संशोधित घोड़े की नाल के आकार में बनाया गया है। तीन तार कर रहे हैंसंलग्न i) एक ii) एक एसी की दुम किनारे करने के लिए आईसी की दुम किनारे से फैली और iii) एक एक क्षेत्र के लिए टुकड़ा की औसत दर्जे किनारे से तिरछे फैली, टुकड़ा की औसत दर्जे बढ़त के साथ क्षैतिज निहित है कि इस तरह के एसी के लिए व्याख्यान चबूतरे (चित्रा 1 ए देखें)। तार टुकड़ा अखंडता को बनाए रखने में मदद करने के लिए टुकड़ा पर दबाव की एक कम राशि के लिए अनुमति देते हैं वीणा की (cyanoacrylate गोंद के साथ) gluing के लिए फ्रेम में छोटे indentations (चित्रा 1 बी देखें)। तीन आयामी मुद्रण का उपयोग करके, हम ऊतक के ऊपर और नीचे कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के आदर्श प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं जो हमारे अद्वितीय विशेषताओं के साथ-साथ पुलों के लिए कस्टम डिजाइन वीणा करने में सक्षम हैं। यह भी पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए ऊतक घुसना करने के लिए प्रकाश के लिए बड़े क्षेत्रों को बनाए रखता है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं इलिनोइस विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी जानवरों को प्रयोगशाला पशु की देखभाल के प्रत्यायन के लिए अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा अनुमोदित जानवरों की देखभाल सुविधाओं में रखे थे। हर प्रयास प्रयुक्त जानवर की संख्या को कम करने के लिए और अध्ययन के सभी स्तरों पर पीड़ा को कम करने के लिए बनाया गया था।
के लिए और टुकड़ा करने की क्रिया के लिए माउस से मस्तिष्क को हटाने 1. तैयारी
- छिड़काव और टुकड़ा ऊष्मायन के लिए तैयार करें।
- लगभग 30 मिनट टुकड़ा करने की क्रिया से पहले, रिकॉर्डिंग या इमेजिंग के लिए पहले टुकड़ा के ऊष्मायन के लिए उच्च सुक्रोज काटने समाधान और कम कैल्शियम aCSF तैयार करते हैं।
- सभी आवश्यक उपकरण (बड़े कुंद अंत कैंची, छोटे वसंत कैंची, शारीरिक संदंश, बड़ी कैंची या गिलोटिन, आईरिस कैंची, जौहरी संदंश, 27G x 1/2 इंच सुई के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज, 1 सेमी एक्स 2 सेमी फिल्टर का छोटा सा टुकड़ा बाहर करना कागज, और SL के लिए एक टूटी हुई इत्तला दे दी पाश्चर विंदुकछिड़काव और टुकड़ा करने की क्रिया, और छिड़काव ट्रे तैयार के लिए बर्फ हस्तांतरण)।
- एक 32 ओ सेल्सियस पानी के स्नान और समाधान काटने से भरा एक संस्कृति डिश में ऑक्सीजन ACSF के साथ चैम्बर incubating सेट करें।
- टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मंच को काटने के लिए तैयार करें।
- लगभग 1 सेमी 3 एक टक्कर के लिए एक मस्तिष्क के लिए backstop और 1.5 सेमी x 1.5 मिमी x 3 मिमी के रूप में उपयोग करने के लिए 3% अगर का एक छोटा सा टुकड़ा काट आईसी सहारा इस्तेमाल किया जाएगा।
- Cyanoacrylate चिपकने वाला के साथ मंच के रूप में भी वे एक 80 ओ के कोण के रूप में इस तरह कि backstop के सही पक्ष पर टक्कर पर backstop गोंद।
- मस्तिष्क निकालें।
- गहराई से एक P12-P20 ketamine 100 मिलीग्राम / किग्रा और xylaxine 3 मिलीग्राम / किग्रा (या तुलनीय नैतिकता समिति को मंजूरी दी प्रक्रिया) के साथ (आदर्श p14-18) माउस anesthetize।
नोट: पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी के माध्यम से उचित संज्ञाहरण स्तर की पुष्टि करें। पशु संज्ञाहरण संक्षेप में किया जा रहा है के रूप में, नेत्र मरहम अनावश्यक है। - कुंद का प्रयोग, कैंची खत्म गर्दन को असिरूप प्रक्रिया से ribcage बेनकाब।
- असिरूप प्रक्रिया का पता लगाएं, और लगभग 1.5 सेमी की क्षैतिज काट कर।
- कंधों को पिछले क्षैतिज कटौती की छोर से दो खड़ी कटौती, लगभग 1.5 सेमी प्रत्येक बनाओ।
- डायाफ्राम और costochondral जंक्शनों के माध्यम से कट दिल को बेनकाब करने के लिए।
- छोटे वसंत कैंची से, दिल की तरफ पृष्ठीय उदर से, सही प्रांगण में कटौती एक छोटा, 2-5 मिमी बनाते हैं।
- एक 27G x 1/2 इंच सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, बाएं वेंट्रिकल इंजेक्षन और जल्दी उच्च सुक्रोज काटने समाधान के साथ पशु छिड़कना।
- रक्त स्पष्ट चलाता है एक बार, सिर को दूर करने के लिए बड़े कैंची का उपयोग करें।
नोट: हम व्यवस्थित छिड़काव की उपयोगिता का आकलन नहीं किया है। हालांकि, हमारे अनुभव में, इस युवा चूहों में transcardiac छिड़काव लगभग 100% सफलता के साथ किया जा सकता है, और लाल बीएल को नष्ट करने के लाभ के लिए हैप्रतिदीप्ति और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो बाढ़ की कोशिकाओं,। - खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए midline त्वचा के नीचे कट।
- तुला आईरिस कैंची का प्रयोग, तो आंखों के बीच कट, ध्यान से नीचे मस्तिष्क को नुकसान नहीं midline सिवनी ख्याल रखने के साथ पीछे पूर्वकाल से कटौती से शुरू, आंखों के बीच खोपड़ी में कटौती।
नोट: ड्यूरा आमतौर पर खोपड़ी के साथ उतर आता है। यदि आवश्यक हो, ध्यान से मस्तिष्क को हटाने से पहले ड्यूरा हटा दें। - जौहरी संदंश का प्रयोग, जिज्ञासा खोपड़ी खोलने के लिए और ध्यान से मस्तिष्क को हटा दें, तो समाधान काटने में मस्तिष्क जगह है। Cortices हानिकारक से बचने के लिए ध्यान रखना।
- गहराई से एक P12-P20 ketamine 100 मिलीग्राम / किग्रा और xylaxine 3 मिलीग्राम / किग्रा (या तुलनीय नैतिकता समिति को मंजूरी दी प्रक्रिया) के साथ (आदर्श p14-18) माउस anesthetize।
2. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मस्तिष्क की तैयारी
- Vibratome मंच पर बढ़ते के लिए मस्तिष्क की तैयारी।
- 90 ओ में दो लाइनों के साथ चिह्नित एक स्लाइड और नीचे सही करने के लिए छोड़ दिया है ऊपर से 17 ओ में एक विकर्ण लाइन का उपयोग करना, दो लाइनों से मिलने जहां, का उपयोग करते हुए, ऊपर मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष जगह अन्तर्विभाजकएक रेजर ब्लेड, एक सपाट सतह बनाने व्याख्यान चबूतरे अंत मस्तिष्क के 2-4 मिमी हटा दें।
- नव निर्मित सपाट सतह पर मस्तिष्क दुम ऊपर की ओर रखें, और क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइन के साथ मस्तिष्क के midline के साथ मस्तिष्क के पृष्ठीय सतह पंक्ति में।
- 17 ओ लाइन के साथ धार संरेखित एक 30 ओ के कोण पर उस्तरा झुकाव और एक डबल विकर्ण कटौती (राज्याभिषेक से 17 क्षैतिज विमान से ओ और 60 ओ) में सही कॉर्टेक्स के लगभग 3 मिमी हटा दें।
- Vibratome मंच पर मस्तिष्क बढ़ते।
- लंबे आयाम midline के लिए सीधा है कि इतनी फिल्टर पेपर मस्तिष्क के उदर पक्ष पर 1 सेमी एक्स 2 सेमी का एक छोटा सा टुकड़ा रखें।
- ध्यान से backstop (और टक्कर के बाईं ओर) के सामने क्षेत्र के लिए cyanoacrylate चिपकने वाला की एक छोटी राशि लागू होते हैं।
- मस्तिष्क और पश्च मस्तिष्क की दुम हिस्सा हैं, इसलिए है कि जनसंपर्क गोंद करने पर डबल तिरछे कटौती मस्तिष्क का सामना जगहटक्कर पर opped और दिमाग के दाहिने हिस्से backstop के खिलाफ है।
- नाजुक पूरी सतह टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष के साथ संपर्क में है सुनिश्चित करना है कि मस्तिष्क पर नीचे प्रेस।
3. Colliculo-thalamocortical स्लाइस प्राप्त
- जल्दी, vibratome में काटने मंच और जगह लेने के समाधान के काटने के साथ मंच भरें।
- मस्तिष्क के शीर्ष (उदर पक्ष) के साथ ब्लेड संरेखित करें।
- मस्तिष्क के ऊपर से 1-1.5 मिमी हटाये 300-500 माइक्रोन स्लाइस को दूर करने और हटाने के बाद गहराई का आकलन करें।
नोट: आईसी, MGB, और पार्श्व जानुवत नाभिक (LGN) सब दिखाई दे रहे हैं, और दांतेदार गाइरस एक 'सी' आकार दो 600 माइक्रोन स्लाइस को एक ले रूपों। चित्रा 3 देखें। - पकड़े (32 ओ सी) गर्म कक्ष में जगह स्लाइस।
स्लाइस की 4. इमेजिंग
- Flavoprotein autofluorescence इमेजिंग के लिए तैयार करना।
- <li> मानक electrophysiological रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा के छिड़काव के लिए aCSF तैयार, 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुलबुला aCSF।
- उत्तेजना के लिए ग्लास इलेक्ट्रोड खींचो। कि कई अलग अलग उत्तेजक इलेक्ट्रोड और विन्यास (ग्लास, टंगस्टन, कार्बन फाइबर, Monopolar, द्विध्रुवी) flavoprotein autofluorescence इमेजिंग के साथ सभी काम बहुत अच्छी तरह से संयोग में ध्यान दें।
- कम्प्यूटर, कैमरा, micromanipulator, प्रकाश स्रोत, उत्तेजना सॉफ्टवेयर, छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर चालू करें।
- चैम्बर में टुकड़ा तरक्की के लिए कस्टम पुल (पूरक सामग्री में उपलब्ध डिजाइन) जगह, ऑक्सीजन ACSF के साथ रिकार्डिंग कक्ष छिड़कना।
नोट: छिड़काव दर स्थापित किसी भी व्यक्ति के साथ भिन्न हो सकते हैं; 5-15 मिलीग्राम / मिनट का यहां इस्तेमाल किया जाता है। - इंटर के रास्ते भर में वीणा के तार रखने से बचने के लिए, देखभाल करने टुकड़ा भर में विशेष रूप से निर्मित वीणा रखकर जबकि पुल से उठाने से टुकड़ा को रोकने के लिए कक्ष में तरल स्तर को कम, चैम्बर में टुकड़ा रखेंस्था (चित्रा 1 ए)। टुकड़ा ऊपर और नीचे aCSF प्रवाह बनाए रखने के लिए टुकड़ा ऊपर लगभग 1-2 मिमी के लिए तरल स्तर में वृद्धि।
नोट: repositioning के लिए आवश्यक है, टूट अंत पाश्चर विंदुक का उपयोग करें या aCSF का स्तर बढ़ने और चरम देखभाल के साथ संदंश का उपयोग करने के लिए अनुमति देते हैं। - (चित्रा 1 ए देखें), ACSF के साथ भरा गिलास इलेक्ट्रोड में चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड डालें Micromanipulator में कांच इलेक्ट्रोड डालने और अलगाने उत्तेजना से कनेक्ट, और ध्यान से चेतक के लिए अग्रणी आईसी / सफेद पदार्थ में कांच इलेक्ट्रोड जगह है।
- (एक अनंत-सही 2X मैक्रो उद्देश्य का उपयोग (एनए 0.13)) 4 हर्ट्ज पर छवियों और 105 सेकंड के लिए एक कैमरा विद्युत उत्तेजक जबकि (प्रत्येक उत्तेजना 0.05 हर्ट्ज पर 40 हर्ट्ज 2 मिसे दालों ऊतक के 1 सेकंड के पांच बार होते हैं) रोशन जबकि लीजिए नीले प्रकाश 470-490 एनएम और 515 एनएम ऊपर कब्जा करने के साथ ऊतक। छवि के लिए जाता है कि यह सुनिश्चित करेंओ अंधेरे, और न ही बाहर उड़ा देखें चित्र 3 संदर्भ के लिए स्तंभ छोड़ दिया है।
नोट: संग्रह समय, संग्रह आवृत्ति, और उत्तेजना आवृत्ति प्रयोग है, इस तरह के रूप में संशोधित किया जा सकता अनुपूरक सामग्री में शामिल कस्टम कार्यक्रम के अनुरूप बदला जा सकता है। - मैटलैब, और अनुपूरक सामग्री में उपलब्ध कस्टम लिखा प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए निर्यात छवियों 0.05 हर्ट्ज पर छवियों के वर्णक्रम शक्ति का विश्लेषण करने के लिए। परिणामस्वरूप छवि से जुड़ा रास्ते में दिखाई देंगे।
नोट: कस्टम प्रोग्राम छवि का निर्माण करने के लिए एक तेजी से फूरियर समय श्रृंखला में पिक्सेल मूल्यों के बदलने का उपयोग करता है।
- ACSF में लगभग 32 ओ सी का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर शीर्ष और टुकड़ा के नीचे, और जगह दोनों तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए एक 3 सेमी संस्कृति डिश और उठाया संस्कृति झिल्ली का उपयोग कर छोटे ऊष्मायन कक्ष तैयार
- 95% ओ के साथ गर्म aCSF और धीरे धीरे बुलबुला के साथ छोटे ऊष्मायन चैम्बर भरें2/5% सीओ 2।
- 2 Pluronic एफ 127 एसिड की μl और DMSO के 48 μl में भंग Fura-02:00 से 50 ग्राम मिलाएं।
- उठाया झिल्ली और ध्यान से एक micropipette का उपयोग पर छोटे ऊष्मायन कक्ष में रखें टुकड़ा धुंधला सीधे MGB ऊपर मिश्रण (या हित के अन्य संरचना) जोड़ें।
- 1 घंटा - इमेजिंग के लिए पहले विरंजन को रोकने, और स्लाइस 45 मिनट के लिए सेते करने की अनुमति के लिए स्लाइस को कवर किया।
- अतिरिक्त सामग्री को धोने के लिए 10-15 मिनट के लिए गर्म पकड़े चैम्बर के लिए स्लाइस निकालें।
- प्रोत्साहित करने के लिए तैयार करने और छवि colliculo-thalamocortical टुकड़ा के लिए 4.1.6 करने के लिए कदम 4.1.1 का पालन करें।
- 365 एनएम प्रकाश के साथ ऊतक रोशन और 510 एनएम ऊपर प्रतिदीप्ति कब्जा है, जबकि विद्युत 0.2 हर्ट्ज पर (प्रत्येक उत्तेजना एक 2 मिसे नाड़ी के होते हैं) पांच बार ऊतक उत्तेजक जबकि 25 सेकंड के लिए (एक 20x पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग) 10 हर्ट्ज पर छवियों को ले लीजिए। मैटलैब और अनुपूरक सामग्री में उपलब्ध कस्टम लिखा प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए निर्यात छवियों 0.2 हर्ट्ज पर छवियों के वर्णक्रम शक्ति का विश्लेषण करने के लिए। परिणामस्वरूप छवि सक्रिय कोशिकाओं दिखाएगा।
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Representative Results
P15 माउस में प्राप्त colliculo-thalamocortical माउस मस्तिष्क टुकड़ा का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। आदर्श टुकड़ा आईसी प्रेरित किया जाता है जब सभी सक्रिय कर रहे हैं, जो चार प्रमुख मध्यमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क श्रवण संरचनाओं आईसी, MGB, टूर्नामेंट्स, और एसी, शामिल होंगे (2A चित्रा)। फूरियर विश्लेषण का उपयोग करना, वर्णक्रमीय बिजली आवधिक और उत्तेजना आवृत्ति 10 पर entrained है कि गतिविधि दिखा जुड़ा मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ बिजली की उत्तेजना आवृत्ति पर मापा जाता है। इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से मध्यमस्तिष्क और कोर्टेक्स के बीच सांठगांठ के रूप में चेतक में जानकारी के आरोही प्रवाह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। शामिल इस प्रोटोकॉल जुड़ा colliculo-thalamocortical टुकड़ा के उत्पादन में एड्स के रूप में अच्छी तरह से 3 डी प्रिंटिंग के समावेश के साथ हार्डवेयर का एक और अधिक आसानी से अनुकूलन सेट उपलब्ध कराने, कोर्टेक्स को चेतक (चित्रा 2 बी से नहीं जुड़े एक टुकड़ा का एक उदाहरण है, जबकि ), ए चेतक flavoprotein autofluorescence इमेजिंग (चित्रा -2) के साथ गतिविधि प्रदर्शित नहीं करता है, जहां एक कनेक्टिविटी पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से है। इस वजह से flavoprotein autofluorescence इमेजिंग के साथ देखा जाना चाहिए सक्रियण टुकड़ा की सतह पर नहीं है कि इस तरह के टुकड़ा करने के लिए आंतरिक और इसलिए असमर्थ होने के संबंध होने की संभावना है। इस antidromic सक्रियण है कि संभावना नहीं है, हालांकि यह संभव है। हम thalamocortical अनुमानों 11 के सफेद पदार्थ उत्तेजक जब antidromic सक्रियण देखा है, और चेतक में इस उत्तेजना प्रतिमान अन्तर्ग्रथनी नाकाबंदी के साथ cortical संकेत 1 के एक प्रतिवर्ती उन्मूलन का कारण बनता नहीं किया है। इस टुकड़ा का उपयोग करना, यह आईसी की बिजली की उत्तेजना के साथ चेतक में सेल की आबादी गतिविधि को देखने के लिए भी संभव है। एक नमूना कैल्शियम इमेजिंग प्रयोग एक मध्यमस्तिष्क प्रोत्साहन (चित्रा 3) के जवाब में thalamic न्यूरॉन्स की एक छोटी सी आबादी के spiking गतिविधि से पता चलता है।
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3 डी मुद्रित सामग्री के 1. प्रतिपादन चित्रा। (ए) के स्थान पर मुद्रित वीणा के साथ पुल पर बैठे टुकड़ा की छवि प्रदान की गई। तीर aCSF के प्रवाह को इंगित करता है। (बी) प्रदान की छवि मोटा टुकड़ा (हलकों) की अनुमति के लिए वीणा के तार के लिए खांचे पर प्रकाश डाला।
चित्रा 2 टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मस्तिष्क काटना। मस्तिष्क स्थिति के लिए (ए) काटने के मंच पर आगर पोजीशनिंग। (बी) के स्लाइड। पूर्वकाल में कटौती के लिए मस्तिष्क की (सी) स्थिति। (डी) डबल कोणीय कटौती के लिए मस्तिष्क और रेजर की स्थिति। (ई) टुकड़ा करने की क्रिया के लिए मस्तिष्क की अंतिम अवरुद्ध ।
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Colliculo-thalamocortical मस्तिष्क टुकड़ा चित्रा 3. Flavoprotein autofluorescence इमेजिंग। (ए) autofluorescence flavoprotein द्वारा की पुष्टि के रूप में colliculo-thalamocortical मस्तिष्क टुकड़ा जुड़ा हुआ है। आईसी के 0.05 हर्ट्ज पर बिजली की उत्तेजना 4 हर्ट्ज पर imaged और फूरियर उत्तेजना आवृत्ति पर शक्ति दिखाने के लिए कार्रवाई की। MGB, टूर्नामेंट्स और, एसी के साथ-साथ कॉर्पस स्ट्रिएटम (सीएस) की सक्रियता के नोट। (बी) असंबद्ध टुकड़ा। MGB का केवल सक्रियण के साथ आईसी की बिजली की उत्तेजना। पूरे मार्ग। थोड़ा भी खड़ी होने के कारण 17 ओ कोण की संभावना पर कब्जा कर लिया एसी (सी) असामान्य सक्रियण नहीं किया गया था। MGB या टूर्नामेंट्स में दिखाई दे संकेत के बिना एसी की सक्रियता के साथ आईसी की बिजली की उत्तेजना। मार्ग की संभावना बरकरार हालांकि MGB में सक्रिय कोशिकाओं ऊतक के दूसरे पक्ष पर होने की संभावना है।
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चित्रा 4. कैल्शियम इमेजिंग। (ए) कैल्शियम इमेजिंग के लिए प्रबुद्ध उदाहरण टुकड़ा कच्चा छवि। (बी) MGB कच्चा 20X छवि, उज्ज्वल अंक कोशिकाओं रहे हैं। स्केल बार 100μm। आईसी की बिजली की उत्तेजना के साथ (सी) कैल्शियम संकेत। फूरियर प्रसंस्करण दोनों कोशिकाओं सफेद तीर और neuropil काला नोक की सक्रियता का पता चलता है। इनसेट औसतन संकेत (इनसेट पैमाने पर पट्टी प्रतिदीप्ति में 0.5% परिवर्तन, 1 सेकंड) के समय के पाठ्यक्रम।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100 x 15 mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35 x10 mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
References
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