Summary
Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht auf festen Substraten ohne Verwendung von Lipidbläschen bilden. Wir zeigen, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Doppelschicht auf Siliciumdioxid und Gold sowie trägergestützten Membranen mit Cholesterin angereicherten Domäne für verschiedene biologische Anwendungen bilden.
Abstract
Um Zellmembranen zu imitieren, ist der unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) eine attraktive Plattform, die In-vitro-Untersuchung von Membranbezogenen Prozesse ermöglicht, während zur Übertragung der Biokompatibilität und Biofunktionalität auf feste Substrate. Die spontane Adsorption und Ruptur Phospholipidvesikel ist die am häufigsten verwendete Methode, um SLBs bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen Vesikelfusion (VF) ist, nur eine Teilmenge der Lipidzusammensetzungen und feste Träger begrenzt. Hier beschreiben wir ein einstufiges allgemeine Verfahren genannten Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Bildungsverfahren um SLBs die nicht Vesikel erfordert bilden. Die SALB Verfahren beinhaltet die Abscheidung von Lipidmolekülen auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (zB Isopropanol) und anschließender Lösungsmittelaustausch mit wßriger Pufferlösung um SLB Bildung auszulösen. Die kontinuierliche Lösungsmittelaustauschschritt ermöglicht Anwendung desVerfahren in einem Durchflusskonfiguration für die Überwachung Doppelschichtbildung und nachfolgende Änderungen unter Verwendung einer Vielzahl von oberflächensensitive Biosensoren. Die SALB Methode kann verwendet werden, um SLBs auf einer Vielzahl von hydrophilen festen Oberflächen, einschließlich derjenigen, die unlösbar zu Vesikelfusion sind herzustellen. Darüber hinaus ermöglicht es die Herstellung von SLBs von Lipidzusammensetzungen zusammengesetzt, die nicht mit der Vesikelfusion Verfahren hergestellt werden können. Hierin vergleichen wir Ergebnisse mit den SALB und konventionellen Vesikelfusion Methoden auf zwei veranschaulichende hydrophile Oberflächen, Siliciumdioxid und Gold erhalten. Um die experimentellen Bedingungen für die Herstellung von hochwertigen Doppelschichten über die SALB Verfahren hergestellt zu optimieren, wird die Wirkung von verschiedenen Parametern ab, einschließlich der Art des organischen Lösungsmittels in der Abscheidungsschritt, die Rate der Lösungsmittelaustausch, und der Lipidkonzentration sowie Tipps zur Problemlösung diskutiert . Bildung unterstützt Membranen, die hohe Anteile an Cholesterin ist auch DämonenFett mit dem SALB Verfahren, Hervorhebung der technischen Möglichkeiten des SALB Technik für eine breite Palette von Membrankonfigurationen.
Introduction
Der Feststoff-unterstützten Lipiddoppelschicht 1 (SLB) ist eine vielseitige Plattform, die die grundlegenden Eigenschaften von Biomembranen wie die Dicke der Doppelschicht, zweidimensionalen Lipiddiffusionsvermögen und die Fähigkeit, membranassoziierten Biomolekülen Host bewahrt. Aufgrund der Komplexität von natürlichen Zellmembranen wurde dieses einfache Plattform wurde gezeigt, als eine effiziente Plattform für in vitro-Untersuchungen von Membranbezogenen Prozesse wie Floßbildung 2, Proteinbindungs 3, Viren und virusartige Partikel Bindungs 4,5 funktionieren und Zellsignal 6. In unmittelbarer Nähe zu einem festen Träger gebildet ist, ist der SLB-Plattform mit einer Vielzahl von Oberflächen-empfindliche Messungen Techniken kompatibel wie Gesamtreflexionsmikroskopie (TIRF), Quarzkristall-Mikrobalance-Dissipation (QCM-D) und die Impedanz-Spektroskopie.
Mehrere Verfahren wurden entwickelt, um verschiedene Arten von SLBs einschließlich Luftblase zu erzeugenZusammenbruch 7 und Dip-Pen-Nanolithographie 8 für Submikrongröße Lipidflecken, Spin-Beschichtung 9 für Doppelschicht-Stacks und Langmuir-Blodgett (LB) 10 und Vesikelfusion (VF) 11 für die vollständige übergreifende, einzelne Lipiddoppelschichten. Die VF-Methode besteht aus der Adsorption von kleinen unilamellaren Vesikeln mit einem festen Träger und nachfolgender spontaner Bruch und Fusion, um eine kontinuierliche Lipid-Doppelschicht zu bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen spontan Vesikel Bruch hauptsächlich auf Silizium basierende Materialien wie Siliziumdioxid, Glas und Glimmer beschränkt. Zusätzlich Vesikel Bruch nicht spontan Vesikel komplexer Lipidzusammensetzungen wie solche, die hohe Anteile an Cholesterin oder negativ geladenen Lipiden auftreten. Je nach System kann Vesikel Bruch durch weiteres Maßschneidern der experimentellen Bedingungen wie Temperatur 12 Lösung pH 13, und der Salzgehalt 14, osmotischen Schock 15 induziert werden Druck 16 oder die Zugabe von zweiwertigen Ionen, wie Ca 2+ 17. Alternativ kann das membranaktive Peptid AH, um eine Schicht von adsorbiertem Vesikel destabilisieren eingeführt werden, was zu einer Vesikel Bruch und die Doppelschichtbildung auf einer Strecke der Flächen 18-22.
Außerdem ist eine erfolgreiche Doppelschichtbildung Herstellung einer gut kontrollierten Population von kleinen unilamellaren Vesikeln, die zeitaufwendig und schwierig, die für bestimmte Membranzusammensetzungen zu erreichen sein kann. Daher ist trotz seiner hohen Effizienz bei der optimalen Fällen (beispielsweise nach umfangreichen Gefrier-Auftau-Vorbehandlung von Vesikeln 23), deren allgemeine Anwendung Vesikelfusion wird durch den Umfang der geeigneten Substrate und Membranzusammensetzungen beschränkt.
Das Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Methode 24-28 ist eine alternative Herstellungsmethode, die nicht Lipidvesikel erfordert. Das Verfahren beruht auf der Abscheidung o basierendf Lipidmoleküle auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, gefolgt von einer allmählichen Austausch dieser Lösemittel mit einer wässrigen Pufferlösung, um SLB Bildung auszulösen. Während des Lösungsmittelaustauschschritt, der ternären Mischung von Lipiden, organischen Lösungsmittel und Wasser durchläuft eine Reihe von Phasenübergängen mit zunehmendem Wasseranteil, der zur Bildung von lamellaren Phasenstrukturen in der Hauptmassenlösung und einer SLB auf dem festen Substrat führt. Wichtig ist, umgeht diese Selbstorganisation Route die Notwendigkeit Vesikel Bruch, die in der Regel ist der limitierende Schritt für die Transformation von adsorbierten Vesikel in ein SLB. Das Protokoll ist anwendbar auf eine große Vielzahl von Oberflächen, einschließlich Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Chrom, Indiumzinnoxid und Gold. In diesem Dokument und in der begleitenden Video wird ein Vergleich von Lipidablagerung durch die SALB und Vesikelfusion Methoden vorgestellt. Insbesondere der Einfluss der experimentellen Parameter, einschließlich Lipidkonzentration, Strömungsgeschwindigkeit, und die Wahl des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels auf die Qualität des von der SALB Verfahren gebildet Bilayer diskutiert. Analytische Charakterisierung der hergestellten SLBs wird von der QCM-D, Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) Techniken durchgeführt. QCM-D-Überwachung ist eine oberflächensensitive Massenmesstechnik, die seit den bahnbrechenden Arbeiten von Keller und Kasemo 29 durchgeführt wird, wurde ausgiebig genutzt, um quantitativ Doppelschichtbildung zu untersuchen. Fluoreszenzmikroskopie erlaubt Inspektion der Membranhomogenität sowie die Visualisierung von Membrandomänen. Die FRAP Technik ist ein Standardwerkzeug, um die seitliche Beweglichkeit der Lipid-Moleküle in einer SLB, die eine wesentliche Eigenschaft des fluidischen Membranen bestimmen.
Der erste Teil dieser Studie beinhaltet QCM-D-Analyse der SALB und Vesikelfusion Methoden angewandt, um Doppelschichtbildung auf Siliziumdioxid und Gold zu versuchen. Im zweiten Teil,Die Herstellung und Charakterisierung dieser Membranen mit einem Bereich von Cholesterinkonzentration mit dem SALB Verfahren demonstriert und die Ergebnisse werden mit den von der Vesikelfusion Verfahren erhaltenen verglichen.
Protocol
1. Bildung der unterstützten Lipiddoppelschicht auf einer hydrophilen festen Träger
- Vorbereitung Lipidstammlösungen von 10 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (Lissamine Rhodamin B sulfonyl) (Rh-PE) durch Lösen der jeweiligen Lipidpulver (entsprechend vorher mit einem analytischen Massenbilanz) in Isopropanol-Lösung eingewogen.
- Und mischen Sie die Stammlösungen in Isopropanol, um das gewünschte Lipidgemisch in der letzten Konzentration herzustellen. Für die Fluoreszenzmikroskopie und FRAP sollte 0,5 Gew% Rh-PE in der Lipidmischung enthalten sein.
- Spritzen Sie das Lipidgemisch in Isopropanol in den mikrofluidischen Kanal, bis sie gefüllt ist.
- Inkubieren der Lipidmischung auf der Glasoberfläche für etwa 10 min.
- Allmählich die Lipid-Lösung mit Wasser oder Pufferlösung unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe bei einer sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeit(10-50 & mgr; l / min). Alternativ, ersetzen Sie das Lipidgemisch durch wiederholtes Pipettieren.
- Spülen Sie den Kanal gründlich mit überschüssigem Puffer, um die restliche Isopropanol zu entfernen.
2. Bildung von Cholesterin-angereicherten Unterstützte Membranen
Hinweis: Die feste Oberfläche (SiO 2) unterstützt Vesikelfusion, aber die Membranzusammensetzung (hoher Cholesterinspiegel) hemmt Vesikelfusion weil Cholesterin angereicherte Vesikel haben eine hohe Biegesteifigkeit 30.
- Wird eine Stammlösung, die 10 mg / ml DOPC Lipid, 10 mg / ml Cholesterin und 1 mg / ml Rh-PE, indem zunächst die jeweiligen Pulver in Isopropanol.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,2 bis 1,6 unter Verwendung der Stammlösungen in Schritt 2.1 vorbereitet.
3. Membranfluidität Assay
- Tauchen Sie die Objektträger in Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung (1%) für 10 Minuten.
- Gründlich waschen Sie die Folien mit VE-Wasser und spülen with Ethanol.
- Föhnen Dias mit einem leichten Stickstoffstrom.
- Setzen Sie die Folien an Sauerstoffplasma für 30 s bei maximaler HF-Leistung in der Sauerstoffplasmakammer.
- Entfernen Sie die Schutzbeschichtung aus dem bodenlosen kommerziellen Mikrofluidkammer (1A) mit einer Pinzette und befestigen Sie den Objektträger auf der Klebeseite der Kammer (1B).
- Montieren Sie die Anschlüsse und Schläuche in die Ein- und Austrittspositionen der Kammer und legen Sie den mikrofluidischen Kanal auf dem Mikroskoptisch (Abbildung 1c).
- Bilden einen fluoreszenzmarkierten unterstützten Lipiddoppelschicht in der mikrofluidischen Kanal [Wiederholen Sie Schritt 1 mit der gewünschten Lipidzusammensetzung (beispielsweise 0,5 mg / ml DOPC), einschließlich 0,5 Gew% Rh-PE in einem organischen Lösungsmittel].
- Suchen Sie den Doppelschicht-Ebene mit einem 60X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,49), um Bilder zu erfassen.
- Nehmen Sie zwei Vorbleichbad Bilder dann Foto-Bleichen 301; m breiten kreisförmigen Fleck mit einem 532 nm, 100 mW Laserstrahls. Vor dem Bleichen, Aufwärmen der Laser, bis seine Intensität stabil geworden ist. Unmittelbar nach Photobleaching, erfassen eine Reihe von Bildern alle 1 Sek 2 min, um die Erholung der Fluoreszenzintensität bei den gebleichten Stelle folgen.
4. Cholesterin Quantification Assay
- Aussetzen Siliciumdioxid beschichtete Quarzkristall-Sensorchip, um Sauerstoffplasma für 30 s bei maximaler HF-Leistung in der Sauerstoffplasmakammer. Entfernen Sie den Chip aus der Kammer und sofort montieren Sie den Chip in der Messkammer.
- Vor dem Experiment wurde zunächst die Frequenz und die Verlustleistung des Sensorchips in der Luft, um eine ordnungsgemäße Montage sicherzustellen, zu erwerben.
- Für die kommerzielle Q-Sense E1 oder E4 QCM-D Gerät, führen Sie den Q-Soft-Software-Programm und klicken Sie auf "Erwerb" und wählen Sie "Setup Measurement".
- In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, überprüfen Sie die 3, 5, 7, 9, 11 und 13 Obertöne und klicken Sie dann auf Find and Run, um die Resonanzspektren zu überprüfen. Stellen Sie die Temperatur auf 24 ° C. Wenn eine oder mehrere Resonanzfrequenzen nicht mit den erwarteten Werten übereinstimmen, überprüfen Sie die Chip-Montage und wieder führen Sie diesen Schritt, bis eine Einigung erzielt wird.
- Beginnen die peristaltische Pumpe und Durchflusspufferlösung (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) in die Messkammer mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul / min.
- In der Software-Programm, klicken Sie auf "Erwerb" und wählen Sie "Neu starten Measurement", um die Resonanzfrequenz und Energieverlust Signale aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine stabile Basislinie für die Frequenz und Verlustverschiebungen erhalten. Anmerkung: Für die Schritte nachfolgend erfolgt eine zusätzliche Frequenz und Dissipation Verschiebungen, die als Funktion der Zeit aufgezeichnet werden kann.
- Injizieren Isopropanol (ohne Lipid) für 10 min.
- Injizieren Sie die Mischung aus DOPC Lipid / Cholesterin bei dergewünschten Molverhältnis mit einer Gesamtlipidkonzentration von 0,5 mg / ml in Isopropanol für 10 min.
- Injizieren Puffer für 20 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul / min.
- Injizieren einer Lösung aus 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) in Puffer (Fließgeschwindigkeit 100 ml / min), bis das Frequenzsignal einen stabilen Wert erreicht, hergestellt.
- Messung der relativen positiven Frequenzverschiebungen, die durch die MßCD Behandlungsschritt hervorgerufen wird, und die Berechnung der Masse von Cholesterin und DOPC Lipide durch Umwandeln der Af cho und Af DOPC Werte Massewerte durch Verwendung des Sauerbrey Gleichung [& Dgr; m = - (C / N) & times; & delta; f, wobei C = 17,7 ng / cm 2, n: Oberton].
- Berechnung der Molfraktion Cholesterin im SLB, unter Berücksichtigung der Molekulargewichte von DOPC Lipid (786,1 g / mol) und Cholesterol (386,6 g / mol).
Representative Results
Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten auf hydrophilen Untergründen.
Der VF und SALB Bildungsmethoden wurden auf Siliciumdioxid und Gold und die Bildungsprozesse in Echtzeit mit der QCM-D-Messtechnik überwacht versucht. Die QCM-D Gerät misst Änderungen in der Resonanzfrequenz (Δ f) einer oszillierenden piezoelektrischen Quarzkristall auf Masse Adsorption auf der Oberfläche des Kristalls. Darüber hinaus misst der QCM-D Instrument die Dissipation der Schwingungsenergie, um die viskoelastischen Eigenschaften (Steifigkeit und Weichheit) der Zusatzschicht zu charakterisieren. Vesikelfusion Experimente wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben 31. Kurz gesagt, wurde eine Basislinie für die erste Frequenz und die Verlustsignale in wässriger Pufferlösung [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5 hergestellt; (2A und B)]. Anschließend wurden kleine unilamellare Lipidvesikel DOPC in dem gleichen Puffer inzogen bei t = 10 min (Pfeil 1) auf Siliziumdioxid (2A) und Gold (2B). 6 jeweils - für Vesikelfusion auf Siliziumdioxid, wurden zweistufige Adsorptionskinetik mit Restfrequenzänderungen und Energieabfuhr von -26 (± 1) Hz und 0,3 (± 0,2) × 10 beobachtet. Diese Werte sind mit der Bildung eines unterstützten Lipiddoppelschicht 29.
Wie in 2B gezeigt, ist die Zugabe des Vesikellösung an die Goldoberfläche zu einer gleichzeitigen Abnahme und Zunahme in Δ f und Δ D Signale jeweils bis ihre Werte erreicht -150 (± 10) Hz (7,5 ± 2) × 10-6 verbunden. Diese Werte entsprechen der Bildung einer adsorbierten Schicht Vesikel. So, wie erwartet, ein SLB nicht auf Gold über die Fusion von Vesikeln gebildet.
QCMD-Analyse für die Doppelschichtbildung auf Siliciumdioxid und Gold durch die SALB Verfahrens ist in 2C und D dargestellt. Auf Siliziumdioxid, endgültige Δ f und Δ D Verschiebungen -25.6 (± 0,55) Hz und 0,4 (± 0,27) × 10 - 6 wurden jeweils erreicht, und diese Werte zeigen die Bildung eines SLB. Ähnliche Bereiche von Δ f und Δ D (Δ f Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10-6) wurden auf Gold beobachtet. Diese Ergebnisse unterstützen, dass die SALB Verfahren ermöglicht die Bildung der unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, die Vesikel Bruch zu verhindern.
Wirkung des Lösungsmittelaustausch Flussrate von der Qualität der unterstützten Lipiddoppelschichten.
Um die optimalen Bedingungen für die Herstellung von hochwertigen unterstützten Lipiddoppelschichten vi bestimmena der SALB Verfahrens wurden der Einfluss der Lipidkonzentration, Lösungsmittel-Wechselkurses und der Wahl des organischen Lösungsmittels untersucht.
Figur 3 zeigt die Veränderung der QCM-D Frequenz während der letzte Schritt des SALB Protokoll wie auf Siliciumdioxid bei zwei verschiedenen Strömungsraten (100 und 600 & mgr; l / min) und zwei verschiedenen Lipidkonzentrationen (0,125 und 0,5 mg / ml) durchgeführt, .
Wenn 0,5 mg / ml DOPC Lipid verwendet wurde (3A), wurde die Doppelschichtbildung nicht durch die Strömungsgeschwindigkeit und einem letzten Af Verschiebung von etwa -26 Hz wurde bei beiden Strömungsraten erhalten beeinflußt.
Wenn im Gegensatz dazu eine geringere Lipidkonzentration verwendet wurde, die Menge des adsorbierten Lipid nach der vollständigen Lösungsmittelaustausch war signifikant von der Durchflussrate (3B) berührt. Bei einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit von 100 ul / min betrug die Doppelschichtbildung vollständig ist (& Dgr; f rund -26 Hz). Jedoch bei einer 6-fach höheren Strömungsrate (600 & mgr; l / min) wurde eine komplette Doppelschicht nicht gebildet (Af rund -17 Hz). Diese Ergebnisse liefern einen Leitfaden zur Auswahl der richtigen experimentellen Bedingungen für eine erfolgreiche Doppelschichtbildung unter Verwendung des SALB Verfahren mit Isopropanol als organisches Lösungsmittel der Wahl.
Charakterisierung der unterstützten Lipiddoppelschichten aus verschiedenen Lipidkonzentrationen in verschiedenen alkoholischen Lösungen gebildet.
Lipidkonzentration ist ein weiterer Parameter, der die Qualität der SLBs durch Verwendung des Verfahrens erhalten SALB betrifft. Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass 0,05 mg / ml Lipidkonzentration nur einzelne, submikroskopische Lipidstrukturen wurden (4A) gebildet ist. Mit steigendem Lipidkonzentration im SALB Prozedur verwendet, die Fluoreszenzintensität der Lipidstrukturen wurde homogener. Bei 0,1 mg / ml Lipidkonzentration gab mikroskopische Lipidflecken wenn diese Strukturen nicht im gesamten f überspannenield Blick (4B). Wenn jedoch 0,25 mg / ml Lipidkonzentration verwendet wurde, eine homogene Lipiddoppelschicht wurde (4C) gebildet ist. Daher gibt es einen Bedarf, um ein vollständiges Vollspannt SLB bilden Mindestlipidkonzentration.
Der Einfluß der Lipidkonzentration auf das Endergebnis der SALB Experimenten wurde ebenfalls über einen weiteren Lipidkonzentrationsbereich (0,01 bis 5 mg / ml) und in verschiedenen organischen Lösungsmitteln (Isopropanol, Ethanol und n-Propanol) untersucht. Die Δ f und Δ D Werte entsprechend dem letzten Schritt der SALB Verfahrens sind in Abbildung 5 dargestellt.
Wir definierten die Doppelschichtbildung auf dem zuletzt Änderungen in der Frequenz und Energieableitung zwischen -25 und -30 Hz und weniger als 0,5 x 10 -6 auf. Basierend auf diesen Kriterien, um die optimale Lipidkonzentrationsbereich bilden einen unterstützten Lipiddoppelschicht war entschlossen, zwischen 0,1 und 0,5 mg/ ml weitgehend unabhängig von der Art des organischen Lösungsmittels. Die Abweichungen in den erfassten Δ f und Δ D verschiebt außerhalb des vorgenannten Bereichs ist aufgrund der Anwesenheit von Zusatzmasse (beispielsweise Doppelschichtstapel), das Auftreten von nicht-Bilayer Morphologien (beispielsweise Bläschen, wurmähnliche Micellen) und die Anwesenheit von fragmentierten Inseln mit Doppelschicht unvollständig Morphologie über das Substrat.
Während die SALB Verfahren erhaltenen unterstützten Lipiddoppelschichten ist relativ robust, kann die optimale Lipidkonzentration für hochwertige Doppelschichtbildung Abstimmung abhängig von der spezifischen experimentellen Konfiguration. Grundsätzlich gibt es nicht nur eine Mindestlipidkonzentration, sondern auch eine optimale Doppelschichtbildung über die SALB Verfahren erforderliche maximale Lipidkonzentration. Der optimale Konzentrationsbereich hängt von der Strömungsgeschwindigkeit und kann auch von dem Substrat und Lipidzusammensetzung beeinflusst werden können. Empirisch in vielen Fällen haben wir found dass eine Lipidkonzentration von 0,5 mg / ml und einer Flussrate von 100 ml / min ist die optimale Menge von Bedingungen für die Bildung eines homogenen unterstützten Lipiddoppelschicht. Jedoch in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung und Strömungszellengeometrie von denen die letztere wirkt das Strömungsprofil während der Lösungsmittelaustausch weitere Optimierung der Lipidkonzentration erforderlich sein. Daher empfehlen wir die Durchführung von Pilot SALB Experimenten unter Verwendung einer 0,5 mg / ml Lipidkonzentration und Beurteilung des Doppelschichtqualität unter Verwendung der QCM-D oder Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Wenn die Doppelschichten unvollständig angezeigt werden, dann sollte die Lipidkonzentration in Schritten von 10% erhöht, bis zufriedenstellende Ergebnisse erreicht werden. Wenn die Doppelschicht scheint koexistieren zusätzliche Lipidstrukturen, dann sollten die Lipidkonzentration in Schritten von 10% verringert, bis zufriedenstellende Ergebnisse erreicht werden.
Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten mit verschiedenen Lipidzusammensetzungen und different Cholesterinfraktionen.
Als nächstes wurden die SALB und VF Methoden, um Cholesterin angereicherten SLBs Form eingesetzt, Fig. 6 zeigt repräsentative Fluoreszenzbilder (100 x 100 um) von Cholesterin enthaltenden Trägermembranen von der SALB Verfahren hergestellt. Die Membranen bestehen aus kreisförmigen Farbstoff ausgeschlossen Domänen durch eine kontinuierliche Phase, die durch gleichförmige Fluoreszenzhelligkeit umgeben. Die dunklen Bereiche erhöhte sich im Bereich mit zunehmender Cholesterinanteil in der Vorstufe Lipidmischung. Als nächstes wurden FRAP Messungen, um die Fluidität der Lipid-Doppelschicht-Filme zu untersuchen geführt. Die FRAP Messungen zeigten fast vollständige Wiederherstellung der Fluoreszenz in der umgebenden Phase, was auf die seitliche Beweglichkeit der Lipide und damit Bildung einer einzigen Lipid-Doppelschicht. Da Rh-PE-Partitionen bevorzugt in die Flüssigphase, werden die dunklen Bereiche sind wahrscheinlich von dichten Cholesterin angereicherten Strukturen. Zum Vergleich wurde auch die Herstellung von DOPC / Chol-Doppelschichten unter Verwendung des VF-Methode ebenfalls versucht. DOPC Vesikel mit zunehmenden Cholesterinfraktionen (10-40 mol%) wurden durch das Vesikel Extrusionsverfahren hergestellt. Rh-PE Lipid (0,5 Gew%) wurde als Fluoreszenzmarker für die Bildgebung verwendet wird. 7 zeigt repräsentative Fluoreszenzbilder (100 x 100 um) von Strukturen bei Inkubation der Glassubstrate mit cholesterinhaltigen Vesikeln erzeugt. FRAP-Analyse zeigte die Bildung eines fluidischen Lipiddoppelschicht mit Bläschen, die 20 Mol-% oder weniger enthalten Chol. Die Proben dagegen mithilfe Vesikel mit höheren Cholesterinfraktionen zeigten keine Rückgewinnung, was das Vorhandensein von adsorbiertem aber nicht aufgebrochenen Vesikel hergestellt.
Der Anteil an Cholesterin, die letztlich in die unterstützten Lipiddoppelschichten eingebracht wurde, wurde als Funktion der Cholesterinfraktion, die in dem Vorläufer Lippe enthalten waren quantifiziertid Gemisch in organischem Lösungsmittel in der SALB Verfahren oder in den Vesikeln in einer wässrigen Lösung in der VF-Methode. Unter Verwendung der QCM-D-Technik, wurde die Doppelschichtbildung überwacht und dann wurde MßCD um gezielt zu extrahieren Chol aus den unterstützten Lipiddoppelschichten 32 aufgenommen. Der Massenverlust auf Grund der Entfernung von Cholesterin führten zu einer Abnahme der Absolutwert der Frequenzverschiebung (| Δ f |) mit der SLB verbunden. Die relativen positiven Frequenzverschiebungen von der MßCD Behandlungsschritt hervorgerufen werden, in 8A gezeigt. Das Mol-Fraktion des Cholesterins wurde basierend auf der Frequenzverschiebung berechnet, wie in 8B dargestellt.
Das Cholesterin-Fraktion in unterstützten Lipiddoppelschichten durch die SALB Verfahren hergestellt eingebaut war fast linear proportional zu der Cholesteringehalte im Vorläuferlipidmischung. Interessant ist, dass der Cholesterinfraktion in Doppelschichten von der VF-Verfahren hergestellt (Vesikel, die bis zu20 Mol-% Chol) war wesentlich geringer als die in den Vorläufer Vesikel enthalten. In der Tat, der höchste Anteil von Cholesterin in der VF-Methode erhalten wurde, war nur etwa 10 mol%.
Beobachtung der Streifenstruktur in β-Zweiphasenkoexistenzregion cholesterin Phospholipid unterstützten Lipiddoppelschichten.
SALB Experimente wurden ferner unter Verwendung einer Lipidmischung mit einem noch höheren Anteil an Cholesterin. Wenn ein 4: 6-Mischung von DOPC und Cholesterin verwendet wurden, eine allmähliche Entmischen eines einheitlichen Flüssigphase in zwei koexistierenden Phasen als helle streifenförmigen Bereichen auf einem dunklen (Farbstoffausschluß) Hintergrund visualisiert wurde beobachtet (Abbildung 9). Festgestellt wird, daß Rh-PE von cholesterinreichen Domänen 33 und damit den vorherrschenden dunklen Bereichen, die als Hintergrund erscheint ausgeschlossen sind Cholesterin angereicherten Regionen. Die Bildung von Mikrometergröße hellen Bereichen auf einem dunklen Hintergrund auf hallogh Cholesterinanteil (> 50 Mol-%) ist konsistent mit der β-Region in der Monophasendiagramm von Cholesterin / Phospholipide Mischungen 34,35. Außerdem ist die Bildung von Streifen-Domänen, die aus einer schwachen Linie Spannung entstehen, legt nahe, dass das Gemisch in der Nähe eines kritischen Punktes Mischbarkeit.
Abbildung 1. Mikrofluidkammer für SALB Bildung in einer geeigneten Konfiguration für Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Gewerbe mikrofluidischen Kammer (B) Deckglas auf die Klebeseite der Kammer angebracht ist, (C) Komplett-Setup auf einem Objekthalter mit Schlauch in Verbindung die Einlass- und Auslassöffnungen der Kammer, und (D) Schlauchpumpe verwendet werden, um die Rate der Lösungsmittelaustausch steuern. Lipide in Isopropanol in das Mess chamb spritzter mit Hilfe der Schlauchpumpe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 QCM-D Analyse Vesikelfusion und SALB Experimente an Siliciumdioxid und Goldsubstraten. QCM-D Frequenz (& Delta; f, blau) und Verlustleistung (& Delta; D, rot) Antworten für die dritte Oberwelle (n = 3) wurden als ein aufgezeichneter Funktion der Zeit während Lipid Adsorption an (A und C) Siliziumdioxid, (B und D) Gold. Platten a und b stellen die Vesikelfusion Methode. DOPC Lipidvesikeln wurden bei t = 10 min injiziert (Pfeil 1). Panels C und D entsprechen dem SALB Bildungsverfahren. Pfeile zeigen die Injektion von Puffer (1), Isopropanol (2), Lipid-Mischung [0,5 mg / ml DOPC Lipid in Isopropanol; (3)] und Buffer Austausch (4). Die gestrichelte Kurve in Diagramm B entspricht einem Kontrollexperiment, in dem Lipid wurde nicht injiziert. Die Endwerte Af und & Delta; D für jede Oberfläche festgelegt. Die Schaltpläne zeigen die vorgeschlagenen montiert Lipidstrukturen, wie aus der letzten Frequenz und Verlust Verschiebungen abgeleitet. Vom Referenz 24 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Einfluss des Lösungsmittels-Wechselkurs am SALB Bildungsprozess. QCM-D Frequenzverschiebungen (& Dgr; f), der dem letzten Schritt (siehe Pfeil 4 in 2C) in der SALB Verfahren wurden auf Siliziumdioxid bei zwei unterschiedlichen Wechselkurse, 100 und 600 & mgr; l / min, u gemessen singen (A) 0,5 mg / ml, und (B) 0,125 mg / ml DOPC Lipid in Isopropanol. Die endgültigen Werte & Delta; f sind ebenfalls festgelegt, verglichen mit der Messung der Basislinie in wässrigen Pufferlösung. Vom Referenz 24 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Betroffene Meldeschwellen von Lipidkonzentration für komplette SALB Formation Epifluoreszenzmikroskopie von Lipidschichten auf Siliziumdioxid durch SALB mit (A) 0,05 mg / ml hergestellt. (B) 0,1 mg / ml; und (C) 0,25 mg / ml Lipidkonzentration. Vom Referenz 26 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5. Einfluss Lipidkonzentration und einem organischen Lösungsmittel zu unterstützten Lipiddoppelschicht durch die SALB Methode. Die letzten Änderungen der QCM-D (A) Frequenz und (B) Energiedissipation für SALB Experimente mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln, als eine Funktion der Lipid Konzentration. Die gestrichelten grünen Linien entsprechen den erwarteten Häufigkeit und Verlustverschiebungen für eine vollständige Doppelschicht (-30 Hz <Af <-25 Hz und & Delta; D <1 x 10 -6). Vom Referenz 26 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi ansehenAbbildung.
Abbildung 6 fluorescence recovery after photo Analyse unterstützte Lipiddoppelschichten mit unterschiedlichen Fraktionen von Cholesterin SALB Verfahren auf einem Glassubstrat hergestellt. (AE) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Doppelschichten mit verschiedenen Cholesterinfraktionen in der Vorstufen-Mischung hergestellt. Bilder wurden sofort (oben) und 1 min (Mitte) after photo aufgezeichnet. Der dunkle Fleck in der Bildmitte entspricht dem fotogebleicht Region. Die Skala Bars sind 20 um. Flächenhistogramme der einzelnen Farbstoff ausgeschlossen Domänen innerhalb jeder Probe sind ebenfalls dargestellt (unten). Vom Referenz 36 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. FRAP Analyse der cholesterinhaltigen unterstützt Doppelschichten von der Vesikelfusion Verfahren hergestellt. (AD) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Doppelschichten unter Verwendung von verschiedenen Cholesterinfraktionen (10-40 Mol-%), in den Vorläuferbläschen. Bilder wurden sofort (oben) und 1 min (unten) after photo aufgezeichnet. Der dunkle Fleck in der Bildmitte entspricht dem fotogebleicht Region. Die Skala Bars sind 20 um. Vom Referenz 36 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Quantification Cholesterinanteil in unterstützten Lipid-Doppelschichten. (A) Die positive QCM-D-Frequenzverschiebung bei der Einspritzung von 1 mM MßCD auf unterstützten Lipiddoppelschichten mit unterschiedlichen Molenbrüche von Cholesterin in der Vorstufen-Mischung (zwischen 0 und 50 Mol-%). (B) Molprozent Cholesterin aus den von der SALB und Vesikelfusion Methoden in Abhängigkeit von der Cholesterinfraktion in den Vorläufergemischen oder Vesikel hergestellt Bilayer verarmt. Vom Referenz 36 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 9. Zeit abhängige Entwicklung der Fluoreszenz-Mikrostruktur in einer Doppelschicht aus DOPC unterstützt / Chol (4: 6 Molverhältnis containing 0,5% Rhodamin-PE) durch den SALB Verfahren hergestellt. Eine gleichmäßige Phasen allmählich Phase sich in einer flüssig-flüssig Koexistenzbereich nach vollständiger Lösungsmittelaustausch. Vom Referenz 37 angepasst und mit Genehmigung der American Chemical Society verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
In dieser Arbeit wird ein Lösungsmittel-Austausch-Protokoll, in dem Lipide in Alkohol (Isopropanol, Ethanol oder n-Propanol) mit einem festen Träger inkubiert werden präsentiert und dann wird der Alkohol nach und nach mit einer wässrigen Pufferlösung, um einen Antrieb der Serien ersetzt von Phasenübergängen schließlich produzieren Lamellenphasen Lipid-Doppelschichten 24. Es wird gezeigt, daß das Verfahren ermöglicht die Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, wie etwa Gold, die unlösbar an den Vesikelfusion Verfahrens geeignet ist.
Eine optimale Lipid-Konzentrationsbereich (0,1 bis 0,5 mg / ml) wurde für die komplette Doppelschichtbildung in experimentellen Standardformate bisher getestet wurde bestimmt. Bei Lipidkonzentrationen von weniger als 0,1 mg / ml, diskrete, mikroskopische Flecken von Doppelschichten gebildet werden. Andererseits wird bei Konzentrationen über 0,1 mg / ml und weniger als 0,5 mg / ml, eine vollständige und einheitliche Doppelschicht gebildet wird. Bei Lipidkonzentrationen oberhalb dieses Bereichs wurde ein Fluid-Doppelschicht noch als verifi gebildetvon FRAP Analyse ed zeigt jedoch, Fluoreszenzmikroskopie auf das Vorhandensein weiterer Lipidstrukturen auf der Oberseite der Doppelschicht. Auffällig ist, die Morphologie dieser zusätzlichen Lipidstrukturen, wie durch QCM-D-Analyse bestimmt, hing von dem Alkohol, der während der Inkubation Schritt verwendet wurde. Im Fall von Ethanol, die relativ hohen Δ f und Δ D verschiebt ähneln der QCM-D Signatur für ein adsorbiertes Vesikel Schicht erhalten. Wenn Isopropanol oder n-Propanol wurde stattdessen verwendet, war der Δ f etwas höher als der Wert für eine Doppelschicht (final Δ f von -30 bis -40 Hz) erwartet, während der Δ D war erheblich höher. Solche QCM-D Antworten würde ausgestreckte Lipidstrukturen (zB wurmähnliche Micellen) nach außen von der Membranoberfläche vorstehenden erwarten (wie durch Fluoreszenzmikroskopie in einigen Fällen sichtbar).
Die Rate der Lösungsmittelaustausch ist ein weiterer wichtiger Parameter, der entscheidend sein kann, especmathematisch bei geringeren Lipidkonzentrationen (zB 0,1 mg / ml) verwendet werden. Schnelle Lösungsmittelaustausch bei niedriger Lipidkonzentration kann zur Bildung von unvollständigen Doppelschichten führen. In der Standard-Messkammer für QCM-D-Messungen in diesem Papier (Q-Sense E4 Messkammer), Durchflussraten von etwa 100 & mgr; l / min verwendet wird, waren geeignet für hoch reproduzierbare komplette Doppelschichtbildung. Für Durchflusszellen mit anderen Geometrien und Volumen kann die optimale Durchflussrate variieren und muss empirisch auf der Grundlage der hier vorgeschlagenen Schritte bestimmt werden.
Zusätzlich zum unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, die unhandhabbar Vesikelfusion sind, kann die SALB eingesetzt werden, um die Notwendigkeit von Lipidvesikeln, die zerreißen kann, wodurch die Tür zur Herstellung dieser Membranen mit komplexen Zusammensetzungen Öffnung zu umgehen. Als illustratives Beispiel Zusammensetzung wurden Lipidmischungen mit einem hohen Anteil von Cholesterin untersucht. Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der mammalian Zellmembranen und ihre Bruch nähern können 45-50 Mol-% der Membranlipidzusammensetzung (beispielsweise in Erythrocyten). So sollte auch ein einfaches Modell einer Lipid-Doppelschicht, die eine menschliche Zelle Membran schließen Cholesterin.
Während Vesikelfusion könnte zur fluidischen Lipiddoppelschichten nur 10-15% Cholesterin enthält, herzustellen, können die Verfahren SALB Bildung fluidischen Lipiddoppelschichten, die hohe Anteile von Cholesterin (bis zu 57 mol%, bestimmt durch QCM-D-Messungen quantifiziert) 36. Wenn jedoch das Niveau des Cholesterins wurde weiter erhöht (bis zu 63 mol%) wurden streifenförmigen Bereichen beobachtet 37. Die Co-bestehenden Domains waren flüssig, erinnern an die im Phasendiagramm des Cholesterin / Phospholipide Monoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche in der β-Region beobachtet.
Insgesamt ist die SALB Methode gezeigt, um eine einfache und effiziente Vorgehensweise sein, unterstützten Lipiddoppelschichten zu bilden, insbesondere in Fällen würde den Rahmen der herkömmlichen Vesikelfusion Methode. Bisher wurden die QCM-D Technik und Fluoreszenz-Mikroskopie hauptsächlich verwendet, um die unterstützten Lipiddoppelschichten durch die SALB Verfahren gebildet charakterisieren. Wir freuen uns, eine breite Palette von oberflächensensitiven analytischen Messungen Techniken, einschließlich der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) 38, Rasterkraftmikroskopie (AFM) 39,40, Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie 41, X-ray 42 und Neutronenreflexionsvermögen 43, kann verwendet werden, um weiter zu charakterisieren und untersuchen einfache und komplexe Doppelschicht-Konfigurationen vorbereitet durch die SALB Verfahren werden. Diese neuen Möglichkeiten öffnen die Tür zu einer größeren Anzahl von Wissenschaftlern, die künstliche Zellmembranen durch die Nutzung eines einfachen und robusten Versuchsprotokoll zu erkunden.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Unterstützung von der National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 und NRF2015NRF-POC0001-19), der National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012) und Nanyang Technological University, um NJC bestätigen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
| QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
| Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
| Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
| cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Isopropanol | Sigma | 673773 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| n-propanol | Sigma | 279544 | |
| Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
| Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
| Silicon tubing 1.6 mm ID | IBIDI | 10842 | |
| Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
| Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |
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