Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode

Published: December 1, 2015 doi: 10.3791/53073
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Vi præsenterer en forsøgsprotokol for at danne en understøttet lipiddobbeltlag på faste substrater uden brug lipidvesikler. Vi demonstrerer en ettrins fremgangsmåde til dannelse af et lipiddobbeltlag på siliciumdioxid og guld samt understøttede membraner med kolesterol-beriget domæne for forskellige biologiske anvendelser.

Abstract

For at efterligne cellemembraner, den understøttede lipiddobbeltlaget (SLB) er en attraktiv platform, som muliggør in vitro undersøgelse af membran-processer samtidig giver biokompatibilitet og biofunctionality til faste substrater. Den spontane adsorption og sprængning af phospholipidvesikler er den mest almindeligt anvendte metode til dannelse SLBs. Men under fysiologiske betingelser, er vesikelfusion (VF) er begrænset til en delmængde af lipidsammensætninger og faste bærere. Her beskriver vi en ettrinsprocedure generelle fremgangsmåde kaldes opløsningsmiddelbaserede assisteret lipiddobbeltlag (Salb) dannelse metode for at danne SLBs som ikke kræver vesikler. Den Salb fremgangsmåde involverer aflejring af lipidmolekyler på en fast overflade i nærværelse af vandblandbare organiske opløsningsmidler (fx isopropanol) og efterfølgende opløsningsmiddel-udveksling med vandig pufferopløsning med henblik på at udløse SLB formation. Den løbende skridt udveksling opløsningsmiddel muliggør anvendelsen af ​​denFremgangsmåde i et flow-through konfiguration er egnet til overvågning dobbeltlag dannelse og efterfølgende ændringer ved hjælp af en lang række overfladeaktive følsomme biosensorer. Den Salb fremgangsmåde kan anvendes til at fremstille SLBs på en bred vifte af hydrofile faste overflader, herunder dem, der er intraktabel til vesikelfusion. Desuden muliggør fremstilling af SLBs sammensat af lipid sammensætninger, som ikke kan fremstilles ved hjælp af vesikelfusion metode. Heri vi sammenlign resultaterne opnået med de Salb og konventionelle vesikelfusion metoder på to illustrative hydrofile overflader, siliciumdioxid og guld. For at optimere de eksperimentelle betingelser for udarbejdelse af kvalitet dobbeltlag høj forberedt via Salb metode effekten af ​​forskellige parametre, herunder typen af ​​organisk opløsningsmiddel i deposition trin, satsen af ​​opløsningsmiddel udveksling, og lipidkoncentrationen diskuteret sammen med tip til fejlfinding . Dannelse af understøttede membraner indeholdende høje fraktioner af cholesterol er også dæmonertreret med Salb metoden, fremhæver de tekniske muligheder i Salb teknik til en bred vifte af membran konfigurationer.

Introduction

Det faste stof-støttede lipiddobbeltlag 1 (SLB) er en alsidig platform, som bevarer de væsentlige egenskaber ved biomembraner såsom dobbeltlaget tykkelse, todimensional lipid diffusivitet, og evnen til at være vært membran-associerede biomolekyler. På grund af kompleksiteten af naturlige cellemembraner, har vist denne enkle platform til at fungere som en effektiv platform for in vitro-undersøgelser af membran-processer såsom klumpdannelse 2, proteinbinding 3, virus og viruslignende partikel binding 4,5 og celle signalering 6. Dannet i umiddelbar nærhed til en fast bærer, SLBs platformen er kompatibel med en række overfladeaktive følsomme målinger teknikker, såsom total indre refleksion mikroskopi (TIRF), kvartskrystalmikrovægt-dissipation (QCM-D), og impedans spektroskopi.

Der er blevet udviklet flere metoder til at fremstille forskellige typer af SLBs, herunder luftboblekollaps 7 og dip-pen nanolithography 8 for submicron mellemstore lipid pletter, spin-belægning 9 til dobbeltlag stakke og Langmuir-Blodgett (LB) 10 og vesikelfusion (VF) 11 for fuld spænder, enkelt lipiddobbeltlag belægninger. VF metode består i adsorption af små unilamellare vesikler til en fast bærer og efterfølgende spontane brud og fusion til dannelse af en kontinuert lipiddobbeltlag. Men under fysiologiske betingelser, spontan vesikel brud er hovedsageligt begrænset til silicium-baserede materialer såsom siliciumdioxid, glas og glimmer. Hertil kommer, at vesikel brud ikke opstå spontant til vesikler af komplekse lipidsammensætninger såsom dem der indeholder høje fraktioner af cholesterol eller negativt ladede lipider. Afhængigt af systemet, kan vesikel brud induceres ved yderligere at skræddersy de eksperimentelle betingelser, såsom temperatur 12, opløsning pH 13, og saltindhold 14, osmotisk chok 15 16, eller tilsætning af divalente ioner, såsom Ca2 + 17. Alternativt kan membranen-aktive AH peptid indføres med henblik på at destabilisere et lag af adsorberede vesikler, hvilket fører til vesikel brud og dobbeltlagsformation på en række overflader 18-22.

Endvidere vellykket dobbeltlagsformation kræver fremstilling af en velkontrolleret population af små unilamellare vesikler, som kan være tidskrævende og vanskelig at opnå for visse membran sammensætninger. Derfor på trods af sin høje effektivitet i optimale tilfælde (f.eks efter omfattende fryse-tø forbehandling af vesikler 23), den generelle anvendelse af vesikelfusion er begrænset af omfanget af egnede substrater og membran sammensætninger.

Opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) metode 24-28 er en alternativ fremstillingsteknik, som ikke kræver lipidvesikler. Metoden er baseret på aflejring of lipidmolekyler på en fast overflade i nærværelse af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel efterfulgt af en gradvis udveksling af dette opløsningsmiddel med en vandig pufferopløsning for at udløse SLB formation. Under opløsningsmiddel-udveksling trin, den ternære blanding af lipider, organisk opløsningsmiddel og vand gennemgår en serie faseovergange med stigende vand fraktion, hvilket fører til dannelsen af ​​lamellare fase strukturer i bulkopløsningen og en SLB på det faste substrat. Vigtigere er det, denne selv-samling rute omgår behovet for vesikel brud, som normalt er det begrænsende trin for omdannelsen af ​​adsorberede vesikler i en SLB. Protokollen er anvendelig til en lang række overflader, herunder siliciumdioxid, aluminiumoxid, krom, indiumtinoxid, og guld. I dette dokument, og i den ledsagende video, er en sammenligning af lipiddeponering af Salb og vesikelfusion metoder fremlagt. Især påvirkning af eksperimentelle parametre, herunder lipidkoncentration, Strømningshastighed, og valget af vand blandbart organisk opløsningsmiddel, om kvaliteten af ​​dobbeltlaget dannet ved Salb fremgangsmåden drøftes. Analytisk karakterisering af færdige SLBs udføres af QCM-D, fluorescensmikroskopi og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) teknikker. QCM-D overvågning er en overflade-sensitive masse måleteknik, som siden pionerarbejde udført af Keller og Kasemo 29, er blevet grundigt anvendes til kvantitativ undersøgelse dobbeltlagsformation. Fluorescensmikroskopi tillader inspektion af membranen homogenitet samt visualisering af membrandomæner. FRAP teknik er et standardværktøj at bestemme den laterale mobilitet lipidmolekyler i et SLB, hvilket er en væsentlig egenskab ved fluide membraner.

Den første del af denne undersøgelse indebærer QCM-D analyse af Salb og vesikelfusion metoder anvendes til at forsøge dobbeltlagsformation på siliciumdioxid og guld. I den anden del,fremstilling og karakterisering af understøttede membraner indeholdende en række kolesterol koncentration i Salb metoden er påvist, og resultaterne sammenlignes med dem, der opnås ved vesikelfusion metode.

Protocol

1. Dannelse af understøttede lipiddobbeltlag på en hydrofil Solid Support

  1. Forbered lipid stamopløsninger på 10 mg / ml 1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) og 1 mg / ml 1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamin rhodamin B sulfonyl) (Rh-PE) ved at opløse de respektive lipid pulvere (passende vejet på forhånd med en analytisk massebalance) i isopropanolopløsning.
  2. Fortynde og blande stamopløsninger i isopropanol med henblik på at forberede den ønskede lipid blandingen ved slutkoncentrationen. Til fluorescens mikroskopi og FRAP forsøg, bør 0,5 vægt% Rh-PE indgå i lipidblandingen.
  3. Injicere lipidblandingen i isopropanol ind i mikrofluid kanal, indtil den er fyldt.
  4. Inkuber lipidblandingen på glasoverfladen i ca. 10 minutter.
  5. Gradvist erstatte lipidopløsningen med vand eller pufferopløsning ved hjælp af en peristaltisk pumpe ved en meget lav strømningshastighed(10-50 pl / min). Alternativt erstatter lipidblandingen ved gentagen pipettering.
  6. Skyl kanalen grundigt med overskydende buffer med henblik på at fjerne den resterende isopropanol.

2. Dannelse af cholesterol-beriget Understøttede Membraner

Bemærk: Det faste overflade (SiO2) støtter vesikelfusion, men membranen sammensætning (højt kolesterol) inhiberer vesikelfusion fordi kolesterol beriget vesikler højt har bøjningsstivhed 30.

  1. Der fremstilles en stamopløsning indeholdende 10 mg / ml lipid DOPC, 10 mg / ml cholesterol og 1 mg / ml Rh-PE ved først at opløse de respektive pulvere i isopropanol.
  2. Gentag trin 1,2-1,6 ved hjælp af stamopløsninger forberedt i trin 2.1.

3. membranfluiditet Assay

  1. Nedsænk objektglasset i natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning (1%) i 10 minutter.
  2. Vask dias grundigt med deioniseret vand og skyl Vidh ethanol.
  3. Blow-tørre dias ved hjælp af en blid strøm af nitrogen.
  4. Expose dias til ilt plasma til 30 sekunder ved maksimal radiofrekvens magt i ilt plasma kammeret.
  5. Fjern den beskyttende film belægning af den bundløse kommercielle microfluidic kammer (figur 1A) ved hjælp af en pincet og vedhæfte objektglasset på den klæbende side af kammeret (figur 1B).
  6. Saml stik og slanger ind i indløbs- og ud- stillinger kammeret og placer mikrofluid kanal på mikroskopbordet (figur 1C).
  7. Danner en fluorescens-mærket understøttet lipiddobbeltlag i mikrofluid kanal [gentage trin 1 under anvendelse af den ønskede lipidsammensætning (f.eks 0,5 mg / ml DOPC), herunder 0,5 vægt% Rh-PE i organisk opløsningsmiddel].
  8. Find dobbeltlaget plan med en 60X oliebestandighedsobjektet (NA 1,49) med henblik på at tage billeder.
  9. Tag to pre-blegemiddel billeder, så foto-blege en 301 m bred cirkelformet stedet med en 532 nm, 100 mW laserstråle. Før fotoblegning, varme op laseren indtil dens intensitet er blevet stabil. Umiddelbart efter fotoblegning, fange en serie af billeder hver 1 sek i 2 min for at følge opsvinget i fluorescensintensiteten på bleget stedet.

4. Kolesterol Kvantificering Assay

  1. Udsætte siliciumdioxid-coatede kvartskrystal sensor chip for oxygen plasma i 30 sekunder ved maksimal radiofrekvens magt i oxygen plasma kammeret. Fjern chippen fra kammeret og straks montere chip i målekammeret.
  2. Før forsøget, først erhverve hyppigheden og bortledning af sensorchippen i luft med henblik på at sikre korrekt montering.
    1. For kommercielle Q-Sense E1 eller E4 QCM-D instrument, køre Q-Soft program og klik på "Acquisition" og vælg "Setup måling".
    2. I det nye vindue, der vises, skal du kontrollere 3, 5, 7, 9, 11 og 13 overtoner, og klik derefter på Søg og Kør for at kontrollere resonans spektre. Indstil temperaturen på 24 ° C. Hvis en eller flere resonansfrekvenser ikke er enig med de forventede værdier, skal du kontrollere chippen montering og re-udføre dette trin, indtil der indgås en aftale.
  3. Start den peristaltiske pumpe og flow pufferopløsning (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) i målekammeret ved en strømningshastighed på 100 ul / min.
  4. I softwareprogrammet, klik på "Acquisition" og vælg "Genstart måling" for at registrere resonansfrekvensen og energispredning signaler. Gentag dette trin, indtil en stabil basislinje opnås for frekvens og spredning skift. Bemærk: trin herefter vil der være yderligere frekvens og spredning forskydninger, der kan registreres som en funktion af tiden.
  5. Injicer isopropanol (uden lipid) i 10 minutter.
  6. Injicer blanding af DOPC lipid / kolesterol påønskede molforhold med en samlet lipidkoncentration på 0,5 mg / ml i isopropanol i 10 minutter.
  7. Injicere buffer i 20 minutter ved en strømningshastighed på 100 ul / min.
  8. Indsprøjte en opløsning af 1 mM methyl-β-cyclodextrin (MβCD) fremstillet i buffer (strømningshastighed 100 pl / min) indtil frekvensen signal når en stabil værdi.
  9. Mål relative positive frekvensskift, der er forårsaget af trin MβCD behandling og beregne massen af kolesterol og DOPC lipider ved at konvertere Af-cho og △ f DOPC værdier til masseværdier ved hjælp af Sauerbrey ligningen [AM = - (C / n) × bf, hvor C = 17,7 ng / cm2, n: overtone].
  10. Beregn molbrøken af ​​kolesterol i SLB under hensyntagen molekylvægtene af DOPC lipid (786,1 g / mol) og cholesterol (386,6 g / mol).

Representative Results

Fremstilling af understøttede lipiddobbeltlag på hydrofile substrater.

VF og Salb dannelse metoder blev forsøgt på siliciumdioxid og guld og dannelsen processer blev overvåget i realtid fra QCM-D måleteknik. QCM-D Instrumentet måler ændringer i resonansfrekvensen (Δ f) i en oscillerende piezoelektrisk kvartskrystal ved masse adsorption på overfladen af krystallen. Hertil kommer, at QCM-D Instrumentet måler spredning af svingningerne energi med henblik på at karakterisere de viskoelastiske egenskaber (stivhed og blødhed) af adlayer. Vesikelfusion eksperimenter blev udført som tidligere beskrevet 31. Kort fortalt blev en basislinie først for frekvens- og dissipation signaler i vandig pufferopløsning [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5; (Figur 2A og B)]. Dernæst små unilamellare lipidvesikler DOPC i den samme buffer var iProjected ved t = 10 min (pil 1) på siliciumdioxid (figur 2A) og guld (figur 2B). For vesikelfusion på siliciumdioxid, blev to-trins adsorptionskinetikforsøget observeret med endelige ændringer i hyppighed og energispredning på -26 (± 1) Hz og 0,3 (± 0,2) × 10 - 6, henholdsvis. Disse værdier er i overensstemmelse med dannelsen af en understøttet lipiddobbeltlag 29.

Som vist i figur 2B, tilsætning af vesiklen løsning på guldoverfladen ført til en samtidig reduktion og forøgelse A f og Δ D-signaler, henholdsvis, indtil deres værdier nåede -150 (± 10) Hz og (7,5 ± 2) × 10-6 hhv. Disse værdier svarer til dannelsen af ​​en adsorberet vesikel lag. Således som forventet, en SLB blev ikke dannet på guld via vesikelfusion metode.

QCMD analyse for dobbeltlagsformation på siliciumdioxid og guld ved Salb fremgangsmåde er vist i figur 2C og D. På siliciumdioxid, afsluttende o f og Δ D forskydninger af -25,6 (± 0,55) Hz og 0,4 (± 0,27) × 10-6 henholdsvis blev nået, og disse værdier indikerer dannelsen af en SLB. Lignende intervaller af Δ f og Δ D (Δ f Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10 - 6) blev observeret på guld. Disse resultater understøtter, at Salb metoden muliggør dannelse af understøttede lipiddobbeltlag på overflader, der forhindrer vesikel brud.

Effekt af opløsningsmiddel-udveksling strømningshastigheden på kvaliteten af understøttede lipiddobbeltlag.

For at bestemme de optimale betingelser for fremstilling af høj kvalitet understøttede lipiddobbeltlag vien den Salb metode blev indflydelsen af ​​lipidkoncentrationen, solvent-kursen og valget af organisk opløsningsmiddel undersøgt.

Figur 3 viser ændringen i QCM-D frekvens i det sidste trin af Salb protokollen, som udføres på siliciumdioxid ved to forskellige strømningshastigheder (100 og 600 pl / min) og to forskellige lipidkoncentrationer (0,125 og 0,5 mg / ml) .

Når 0,5 mg / ml lipid DOPC blev anvendt (figur 3A), blev dobbeltlagsformation ikke påvirket af strømningshastigheden og en endelig Af-forskydning på ca. -26 Hz blev opnået ved begge flowhastigheder.

Derimod når en lavere lipidkoncentration blev anvendt, mængden af adsorberet lipid efter fuldstændig udskiftning af opløsningsmiddel blev væsentligt påvirket af strømningshastigheden (figur 3B). På en gennemsnitlig flowhastighed på 100 ul / min, dobbeltlagsformation var fuldstændig (△ f omkring -26 Hz). Men ved en 6-fold højere strømningshastighed (600 ul / min) blev en komplet dobbeltlag ikke er dannet (△ f omkring -17 Hz). Disse resultater giver en rettesnor for at vælge de rigtige eksperimentelle betingelser for en vellykket dobbeltlagsformation hjælp af Salb metoden med isopropanol som det organiske opløsningsmiddel af valg.

Karakterisering af understøttede lipiddobbeltlag dannet ud fra forskellige lipidkoncentrationer i forskellige alkoholopløsninger.

Lipidkoncentration er en anden parameter, der påvirker kvaliteten af ​​SLBs opnået ved anvendelse af Salb metoden. Fluorescensmikroskopi viste, at ved 0,05 mg / ml lipidkoncentration blev kun isolerede, sub-mikroskopiske lipidstrukturer dannet (figur 4A). Med stigende lipidkoncentration anvendes i Salb procedure fluorescensintensiteten af ​​lipidstrukturer blev mere homogen. Ved 0,1 mg / ml lipidkoncentration, der var mikroskopiske lipid patches selv strukturerne ikke strække sig over hele field af visning (figur 4B). Men når 0,25 mg / ml lipidkoncentration blev anvendt, blev en homogen lipiddobbeltlag dannet (figur 4C). Der er derfor et minimum lipidkoncentration kræves for at danne en komplet, fuld-spænder SLB.

Indflydelsen af ​​lipidkoncentration på det endelige resultat af Salb eksperimenter blev også undersøgt over et bredere lipid koncentrationsinterval (0,01-5 mg / ml) og i forskellige organiske opløsningsmidler (isopropanol, ethanol og n-propanol). Den Δ f og Δ D værdier svarende til det sidste trin i Salb proceduren er vist i figur 5.

Vi definerede dobbeltlagsformation baseret på de endelige ændringer i frekvens og energi dissipation mellem -25 og -30 Hz og mindre end 0,5 x 10 -6 hhv. Baseret på disse kriterier, at den optimale lipid koncentrationsområdet danne en understøttet lipiddobbeltlag blev bestemt til at være mellem 0,1 og 0,5 mg/ ml stort set uafhængig af typen af ​​organisk opløsningsmiddel. Afvigelserne i den erhvervede Δ f og Δ D forskyder uden for førnævnte område skyldes tilstedeværelsen af yderligere masse (f.eks dobbeltlag stakke), forekomsten af ikke-dobbeltlag-morfologier (f.eks vesikler, ormelignende miceller), og tilstedeværelsen af ​​fragmenterede dobbeltlagede øer med ufuldstændig morfologi over substratet.

Mens Salb procedure opnåede understøttede lipiddobbeltlag er relativt robust, kan den optimale koncentration for lipid høj kvalitet dobbeltlagsformation kræver tuning afhængig af den specifikke eksperimentelle konfiguration. Dybest set, er der ikke kun et minimum lipidkoncentration, men også en maksimal lipidkoncentration kræves for optimal dobbeltlagsformation via Salb metoden. Den optimale koncentration afhænger af strømningshastigheden og kan også påvirkes af substratet og lipidsammensætning. Empirisk i mange tilfælde har vi found at en lipidkoncentration på 0,5 mg / ml og en strømningshastighed på 100 ul / min er den optimale sæt af betingelser for dannelse af en homogen understøttet lipiddobbeltlag. Men afhængigt af lipidsammensætningen og flow-celle geometri-hvoraf sidstnævnte påvirker flowprofilen under udskiftning af opløsningsmiddel-yderligere optimering af lipidkoncentration kan være nødvendigt. Således anbefaler vi udfører pilot Salb eksperimenter ved hjælp af en 0,5 mg / ml lipid koncentration og vurdere ved hjælp af QCM-D eller fluorescensmikroskopi teknikker dobbeltlaget kvalitet. Hvis dobbeltlag synes ufuldstændig, så lipidkoncentrationen bør øges i trin på 10%, indtil tilfredsstillende resultater er opnået. Hvis dobbeltlag ser ud til at sameksistere med ekstra lipid strukturer, så lipidkoncentrationen bør reduceres i trin på 10%, indtil tilfredsstillende resultater er opnået.

Fremstilling af understøttede lipiddobbeltlag med forskellige lipidsammensætninger og different kolesterol fraktioner.

Dernæst blev Salb og VF anvendte metoder med henblik på at danne kolesterol beriget SLBs. Figur 6 viser repræsentative fluorescensbilleder (100 × 100 um) af kolesterol-holdige understøttede membraner fremstillet af Salb metode. Membranerne består af cirkulære formede farvestof udelukkede domæner omgivet af en kontinuerlig fase karakteriseret ved en ensartet fluorescerende lysstyrke. De mørke områder steg i området med stigende cholesterol fraktion i pro-lipidblanding. Dernæst blev FRAP målinger udført for at undersøge fluiditet lipiddobbeltlaget film. FRAP målinger afslørede næsten fuldstændig fluorescens opsving i den omgivende fase, hvilket indikerer den laterale mobilitet af lipider og dermed dannelsen af ​​en enkelt lipiddobbeltlag. Da Rh-PE skillevægge fortrinsvis i den flydende fase, er de mørke områder sandsynligvis består af tætte kolesterol beriget strukturer. Til sammenligning blev fremstillingen af ​​DOPC / Chol dobbeltlag ved hjælp af VF metoden også forsøgt. DOPC vesikler med stigende kolesterol fraktioner (10 - 40 mol%) blev fremstillet ved ekstrudering vesikel metode. Rh-PE lipid (0,5 vægt-%) blev anvendt som det fluorescerende mærke til billeddannelse. Figur 7 viser repræsentative fluorescensbilleder (100 × 100 um) af strukturer, der oprettes efter inkubation af glassubstrater med kolesterol-holdige vesikler. FRAP analyse viste dannelsen af ​​en strømningsteknisk lipiddobbeltlag hjælp vesikler, der indeholdt 20 mol-% Chol eller mindre. Men prøver fremstillet ved anvendelse af vesikler med højere kolesterol fraktioner udviste ikke nyttiggørelse, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​adsorberet men uopbrudte vesikler.

Fraktionen af ​​kolesterol som i sidste ende blev indarbejdet i de understøttede lipiddobbeltlagene blev kvantificeret som en funktion af fraktionen kolesterol, som var blevet medtaget i forstadiet læbeid blandingen i organisk opløsningsmiddel i Salb metode eller i vesiklerne i vandig opløsning i VF-metoden. Brug af QCM-D-teknik blev dobbeltlagsformation overvåget og derefter MβCD blev tilsat med henblik på specifikt at udtrække Chol fra de understøttede lipiddobbeltlag 32. Massetabet som følge af fjernelsen af cholesterol førte til et fald i den absolutte værdi af frekvensændringen (| A f |) i forbindelse med SLB. De relative positive frekvensskift forårsaget af trin MβCD behandling er vist i figur 8A. Molbrøken af cholesterol blev beregnet på grundlag frekvensændringen, som beskrevet i figur 8B.

Kolesterol fraktion indarbejdes understøttede lipiddobbeltlag fremstillet ved Salb metoden var næsten lineært proportional med kolesterol indholdet i precursor lipidblanding. Interessant nok cholesterol fraktionen i dobbeltlag fremstillet ved VF-metoden (vesikler indeholdende op til20 mol% Chol) var væsentligt lavere end den, der er indeholdt i precursor vesikler. Faktisk er den højeste del af cholesterol opnået ved VF metode blev kun omkring 10 mol%.

Observation af stribe overbygning i den β-tofaset sameksistens region cholesterol-phospholipid understøttet lipiddobbeltlag.

Salb eksperimenter blev yderligere udført ved anvendelse af en lipidblanding med en endnu højere brøkdel af kolesterol. Når en 4: blev anvendt 6 blanding af DOPC og cholesterol, en gradvis afblanding af en ensartet væskefase i to sameksisterende faser visualiseret som lyse strimmelformede domæner på en mørk (farvestof-eksklusive) baggrund blev observeret (figur 9). Det er fastslået, at Rh-PE er udelukket fra kolesterol-rige domæner 33, og dermed de fremherskende mørke domæner, som optrådte som baggrund er kolesterol-berigede regioner. Dannelsen af ​​mikrometerstore lyse domæner på en mørk baggrund på high kolesterol fraktion (> 50 mol%) er i overensstemmelse med β-regionen i fasediagrammet monolag af kolesterol / phospholipider blandinger 34,35. Desuden dannelsen af ​​stribe domæner, som følger af en svag linje spænding, tyder på, at blandingen er nær en blandbarhed kritisk punkt.

Figur 1
Figur 1. Mikrofluid kammer til Salb dannelse i en passende konfiguration til epifluorescens mikroskopi. (A) Commercial mikrofluid kammer, (B) dækglas fastgjort på den klæbende side af kammeret, (C) Komplet setup på et mikroskop holder med slange tilsluttet ind indløbs- og afgangsåbninger i kammeret, og (D) Peristaltisk pumpe bruges til at styre hastigheden af opløsningsmiddel udveksling. Lipider opløst i isopropanol injiceres i målingen Chais ved hjælp af peristaltikpumpen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. QCM-D analyse af vesikelfusion og Salb eksperimenter på siliciumdioxid og guld substrater. QCM-D frekvens (△ f, blå) og spredning (AD, rød) svar til den tredje overtone (n = 3) blev registreret som en funktion af tiden under lipid adsorption på (A og C) siliciumdioxid, (B og D) guld. Paneler a og b præsentere vesikelfusion metode. DOPC lipidvesikler blev injiceret ved t = 10 min (pil 1). Paneler c og d svarer til Salb dannelsen metode. Pile angiver injektion af puffer (1), isopropanol (2), lipidblanding [0,5 mg / ml lipid DOPC i isopropanol; (3)] ​​og lædertøjER udveksling (4). Den punkterede kurve i panel B svarer til et kontrolforsøg, hvor lipid ikke blev injiceret. De endelige værdier for delta f og AD for hver overflade er angivet. Skema viser de foreslåede samlet lipid strukturer udledes af de endelige frekvens og spredning skift. Tilpasset fra henvisningen 24 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Påvirkning af opløsningsmidlet-kursen på Salb dannelsesproces. QCM-D frekvensskift (△ f) svarende til det sidste trin (se pil 4 i figur 2C) i Salb metode blev målt på siliciumdioxid ved to forskellige vekselkurser, 100 og 600 pl / min, u sing (A) 0,5 mg / ml og (B) 0,125 mg / ml lipid DOPC i isopropanol. De endelige bf værdier er også angivet, i forhold til målingen baseline i vandig pufferopløsning. Tilpasset fra henvisningen 24 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Threshold lipidkoncentrationen for Complete Salb Dannelse epifluorescensmikroskopi af lipid lag på siliciumdioxid fremstilles ved hjælp af Salb (A) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; og (C) 0,25 mg / ml lipid koncentration. Tilpasset fra henvisningen 26 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Indflydelse af lipidkoncentration og organisk opløsningsmiddel om understøttede lipiddobbeltlag dannelsen af Salb fremgangsmåde. De endelige ændringer i QCM-D (A) frekvens og (B) energioptagelse for Salb forsøg under anvendelse af forskellige organiske opløsningsmidler, som en funktion af lipid koncentration. De stiplede grønne linjer svarer til de forventede hyppighed og spredning skift for en komplet dobbeltlag (-30 Hz <△ f <-25 Hz og AD <1 x 10 -6). Tilpasset fra henvisningen 26 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6. Fluorescens bedring efter fotoblegning analyse af understøttede lipiddobbeltlag med varierende fraktioner af cholesterol fremstillet ved Salb metoden på et glassubstrat. (AE) Fluorescens-mikrografer af dobbeltlag fremstillet under anvendelse af forskellige kolesterolfraktioner i pro-blandingen. Billederne blev optaget med det samme (øverst) og 1 min (midten) efter fotoblegning. Den mørk plet i billedets midte svarer til Lysblegede region. Skalaen barer er 20 um. Overfladeareal histogrammer af individuelle farvestofbaserede udelukket domæner i hver prøve er også vist (nederst). Tilpasset fra henvisningen 36 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. FRAP analyse af cholesterol-holdige understøttede dobbeltlag fremstillet ved vesikelfusion metode. (AD) Fluorescens mikrografier af dobbeltlag fremstillet under anvendelse af forskellige kolesterolfraktioner (10 til 40 mol%), i pro-vesikler. Billederne blev optaget med det samme (øverst) og 1 min (nederst) efter fotoblegning. Den mørk plet i billedets midte svarer til Lysblegede region. Skalaen barer er 20 um. Tilpasset fra henvisningen 36 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Quantification af cholesterol fraktion i understøttede lipiddobbeltlag. (A) Den positive QCM-D frekvens skift ved injektion af 1 mM MβCD på understøttede lipiddobbeltlag med varierende molbrøker af kolesterol i pro-blandingen (mellem 0 og 50 mol-%). (B) molprocent cholesterol forsvinder fra dobbeltlagene udarbejdet af Salb og vesikelfusion metoder som en funktion af cholesterol fraktion i pro-blandinger eller vesikler. Tilpasset fra henvisningen 36 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9. Tidsafhængig udviklingen af fluorescens mikrostruktur i en understøttet dobbeltlag af DOPC / Chol (4: 6 molforhold contalingen 0,5% Rhodamin-PE) udarbejdet af Salb metoden. En ensartet fase gradvist fase deles i en væske-væske sameksistens regionen efter fuldstændig opløsningsmiddel udveksling. Tilpasset fra henvisningen 37 og anvendes med tilladelse fra American Chemical Society. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I dette arbejde, er en opløsningsmiddelfri udvekslingsprotokol præsenteret i hvilken lipider i alkohol (isopropanol, ethanol eller n-propanol) inkuberes med en fast bærer og derefter alkoholen gradvist erstattet med en vandig pufferopløsning med henblik på at drive en række faseovergange sidst producerer lamellar fase lipiddobbeltlag 24. Det er vist, at fremgangsmåden muliggør fremstilling af understøttede lipiddobbeltlag på overflader, såsom guld, som er intraktabel til vesikelfusion metode.

En optimal lipid koncentrationsområde (0,1 - 0,5 mg / ml) er blevet bestemt til fuldstændig dobbeltlagsformation i standardeksperimentelle testet hidtil formater. Ved lipid koncentrationer under 0,1 mg / ml, adskilte, mikroskopiske pletter af dobbeltlag dannet. På den anden side, ved koncentrationer over 0,1 mg / ml og lavere end 0,5 mg / ml, er en fuldstændig og ensartet dobbeltlag dannet. Ved lipidkoncentrationer over dette område, blev en flydende dobbeltlag stadig udformet som verifikationed af FRAP analyse imidlertid fluorescensmikroskopi afslører tilstedeværelsen af ​​yderligere lipid strukturer på toppen af ​​dobbeltlaget. Påfaldende, morfologien af ​​disse yderligere lipidstrukturer, som bestemt ved QCM-D-analyse, afhang af alkohol, som blev anvendt under inkubationstrinnet. I tilfælde af ethanol, de relativt høje A f og Δ D skift ligne QCM-D signatur opnået for en adsorberet vesikel lag. Når isopropanol eller n-propanol i stedet anvendt, Δ f var lidt højere end værdien forventet for et dobbeltlag (endelig Δ f mellem -30 til -40 Hz), mens Δ D var mærkbart højere. Sådanne QCM-D reaktioner ville forventes for udvidede lipidstrukturer (f.eks ormelignende miceller), der rager udad fra membranens overflade (så synlig ved fluorescensmikroskopi i nogle tilfælde).

Hastigheden for udskiftning af opløsningsmiddel er en anden vigtig parameter, som kan være kritisk, especially når lavere lipidkoncentrationer (f.eks 0,1 mg / ml) anvendes. Hurtig udveksling opløsningsmiddel ved lav lipidkoncentration kan føre til dannelse af ufuldstændige dobbeltlag. I standard målekammeret bruges til QCM-D målinger i dette papir (Q-Sense E4 måling Afdeling) strømningshastigheder af omkring 100 ul / min, var egnet til meget reproducerbar komplet dobbeltlagsformation. For flow celler med andre geometrier og volumen, kan det optimale flow varierer og skal bestemmes empirisk baseret på de skridt foreslåede heri.

Ud over dannelse af understøttede lipiddobbeltlag på overflader, der er uløselige med vesikelfusion kan Salb anvendes til at omgå behovet for lipidvesikler, som kan gå i stykker og dermed åbne døren til fremstilling af understøttede membraner med komplekse sammensætninger. Som et illustrativt eksempel sammensætning, blev lipid blandinger med en høj fraktion af kolesterol undersøgt. Kolesterol er en vigtig bestanddel af MammAlian cellemembraner, og dens fraktion kan nærme 45-50 mol-% af membranen lipidsammensætning (fx i erytrocytter). Således bør selv en simpel model af et lipiddobbeltlag, der repræsenterer en human celle membran omfatter cholesterol.

Mens vesikelfusion kunne anvendes til at fremstille fluide lipiddobbeltlag, der kun indeholder 10-15% kolesterol, Salb muliggør fremgangsmåden dannelsen af fluide lipiddobbeltlag indeholdende høje fraktioner af cholesterol (op til 57 mol%, som kvantificeret ved QCM-D målinger) 36. Men når niveauet af kolesterol blev yderligere forhøjet (op til 63 mol%), blev stribe-shape domæner observeret 37. De sameksisterende domæner var væske, der minder om dem, der observeres i β-regionen i fasediagrammet af kolesterol / phospholipider monolag ved luft-vand-grænsefladen.

Samlet set er Salb metoden vist sig at være en enkel og effektiv metode til dannelse af understøttede lipiddobbeltlag, især in sager uden for rammerne af den traditionelle vesikel fusion metoden. Hidtil er der QCM-D teknik og fluorescens mikroskopi hovedsageligt anvendes til at karakterisere de understøttede lipiddobbeltlag dannet ved Salb metode. Fremadrettet en bred vifte af overfladeaktive følsomme analytiske målinger teknikker, herunder overflade (SPR) 38, atomic force mikroskopi (AFM) 39,40, Fourier-transform infrarød spektroskopi 41, X-ray 42 og neutron refleksivitet 43, kan anvendes til yderligere at karakterisere og studere simple og komplekse dobbeltlag konfigurationer Fremstilles ved metoden Salb. Disse nye kapaciteter åbner døren til et større antal forskere, der kan udforske kunstige cellemembraner ved at udnytte en enkel og robust forsøgsprotokol.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 og NRF2015NRF-POC0001-19), National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), og Nanyang Technological University til NJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104 (2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).

Tags

Bioengineering Understøttet lipiddobbeltlaget Lipid Vesikel Solvent Exchange kolesterol kvartskrystalmikrovægt-Dissipation lipid Mobilitet Membrane Domæne
Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim,… More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter