Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Biomembran Fabrication av lösningsmedel assisterad lipiddubbelskiktet (SALB) Metod

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

Vi presenterar ett experimentellt protokoll för att bilda en uppburen lipiddubbelskikt på fasta substrat utan att använda lipidvesiklar. Vi visar en en-stegsmetod för att bilda ett lipiddubbelskikt på kiseldioxid och guld samt membran som stöds med kolesterol-anrikad domän för olika biologiska tillämpningar.

Abstract

För att efterlikna cellmembranen, är den uppburna lipiddubbelskiktet (SLB) en attraktiv plattform som möjliggör in vitro undersökning av membranrelaterade processer samtidigt ge biokompatibilitet och biofunctionality till fasta substrat. Den spontana adsorption och ruptur av fosfolipidvesiklar är den mest använda metoden för att bilda SLBs. Men under fysiologiska betingelser, är vesikelfusion (VF) begränsad till endast en delmängd av lipidkompositioner och fasta bärare. Här beskriver vi ett steg allmänna förfarande kallas lösningsmedelsassisterad lipiddubbelskikt (SALB) bildande metoden för att bilda SLBs som inte kräver blåsor. Den SALB metoden involverar avsättning av lipidmolekyler på en fast yta i närvaro av vattenblandbara organiska lösningsmedel (t.ex. isopropanol) och efterföljande lösningsmedelsutbyte med vattenhaltig buffertlösning för att utlösa SLB bildning. Den kontinuerliga lösningsmedelsväxlingssteg möjliggör tillämpning avmetod i ett genomflödes konfiguration som är lämplig för övervakning dubbelskiktsbildning och efterföljande förändringar med användning av ett brett spektrum av ytkänsliga biosensorer. Den SALB metod kan användas för att tillverka SLBs på ett brett spektrum av hydrofila fasta ytor, inklusive sådana som är svår till vesikelfusion. Dessutom möjliggör det framställning av SLBs sammansatta av lipidkompositioner som inte kan framställas med användning vesikeln fusionsmetoden. Häri vi jämför resultat erhållna med de SALB och konventionella vesikel fusionsmetoder på två illustrativa hydrofila ytor, kiseldioxid och guld. För att optimera de experimentella betingelserna för beredning av högkvalitativa bilayers framställda via SALB metoden effekten av olika parametrar, bland annat vilken typ av organiska lösningsmedel i avsättningssteget, graden av lösningsmedelsutbyte, och lipidkoncentrationen diskuteras tillsammans med felsökningstips . Bildandet av stöds membran innehållande höga fraktioner av kolesterol är också demonerkoncentrerat med SALB metoden, med fokus på tekniska kapacitet SALB tekniken för ett brett spektrum av membrankonfigurationer.

Introduction

Den fasta stödda lipidbiskiktet 1 (SLB) är en mångsidig plattform som bevarar de grundläggande egenskaperna hos biomembraner såsom biskiktet tjocklek, tvådimensionell lipid diffusivitet, och förmågan att vara värd för membranassocierade biomolekyler. På grund av komplexiteten av naturliga cellmembran, har denna enkla plattform visats fungera som en effektiv plattform för in vitro-studier av membranrelaterade processer såsom flotte bildning 2, proteinbindning 3, virus och virusliknande partikelbindning 4,5 , och cellsignalering 6. Bildat i nära anslutning till en fast bärare, är SLB plattformen kompatibel med en rad av ytkänsliga mätningar tekniker såsom total inre reflektion mikroskopi (TIRF), kvartskristallmikrovåg upptagnings (QCM-D), och impedans-spektroskopi.

Flera metoder har utvecklats för att producera olika typer av SLBs, inklusive luftbubblakollaps 7 och dopp penna nanolithography 8 för submicron stora lipid fläckar, spin-beläggning 9 för dubbelskikts stackar och Langmuir-Blodgett (LB) 10 och vesikelfusion (VF) 11 för full-spänner, enstaka lipiddubbelskikt beläggningar. VF metod består i adsorption av små unilamellära vesiklar till en fast bärare och efterföljande spontan bristning och fusion till bildning av en kontinuerlig lipiddubbelskikt. Men under fysiologiska förhållanden, spontan vesikler bristning huvudsakligen begränsad till kiselbaserade material, såsom kiseldioxid, glas och glimmer. Dessutom har vesikel bristning inte ske spontant för vesiklar av komplexa lipid-kompositioner, såsom de som innehåller höga andelar av kolesterol eller negativt laddade lipider. Beroende på systemet, kan vesikel bristning induceras genom ytterligare skräddarsy de experimentella betingelserna såsom temperatur 12, lösningens pH 13, och salthalt 14, osmotisk chock 15 16, eller tillägg av tvåvärda joner, såsom Ca2 + 17. Alternativt kan den membran aktiva AH-peptiden införas för att destabilisera ett skikt av absorberade blåsor, vilket leder till vesikler bristning och tvåskikts bildning på en rad ytorna 18-22.

Dessutom kräver en framgångsrik dubbellager bildning framställning av en välkontrollerad population av små unilamellära vesiklar som kan vara tidskrävande och svårt att uppnå för vissa membrankompositioner. Därför, trots dess höga effektivitet i optimala fall (t.ex. efter omfattande frysning-tining förbehandling av vesiklar 23), den allmänna tillämpningen av vesikelfusion begränsas av omfattningen av lämpliga substrat och membrankompositioner.

Lösningsassisterade lipiddubbelskikt (SALB) metod 24-28 är en alternativ tillverkningsteknik, som inte kräver lipidvesiklar. Metoden bygger på deponerings of lipidmolekyler på en fast yta i närvaro av ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel, följt av gradvis utbyte av detta lösningsmedel med en vattenhaltig buffertlösning för att utlösa SLB bildning. Under den lösningsmedelsväxlingssteg, den ternära blandningen av lipider, organiskt lösningsmedel och vatten undergår en serie fasövergångar med ökande vattenfraktionen, vilket leder till bildningen av lamellära fasstrukturer i bulklösningen och en SLB på det fasta substratet. Viktigt är detta självmontering rutt kringgår behovet av vesikel bristning, som vanligtvis är den begränsande steget för omvandlingen av adsorberade vesiklar i en SLB. Protokollet är tillämpbar på en mängd olika ytor, inklusive kiseldioxid, aluminiumoxid, krom, indiumtennoxid, och guld. I detta dokument och i den medföljande videon, är en jämförelse av lipid nedfall av SALB och vesikelfusion metoder presenteras. I synnerhet påverkan av experimentella parametrar, inklusive lipidkoncentration, Flödeshastighet, och valet av vattenblandbart organiskt lösningsmedel, på kvaliteten av dubbelskiktet som bildas av SALB metoden diskuteras. Analytisk karakterisering av de fabricerade SLBs utförs av QCM-D, fluorescensmikroskopi, och fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) tekniker. QCM-D övervakning är en yta känslig teknik mass mätning som sedan den banbrytande arbete som utförts av Keller och Kasemo 29, har i stor utsträckning använts för att kvantitativt undersöka biskiktet bildning. Fluorescensmikroskopi medger inspektion av membranets homogenitet samt visualisering av membrandomäner. FRAP tekniken är ett standardverktyg för att bestämma den laterala rörligheten hos lipidmolekyler i en SLB, vilket är en väsentlig egenskap hos fluid membran.

Den första delen av denna studie omfattar QCM-D analys av SALB och vesikelfusion metoder som används för att försöka dubbelskiktsbildning på kiseldioxid och guld. I den andra delen,framställning och karakterisering av stöd membran innehållande en rad av kolesterolkoncentrationer med SALB metoden demonstreras och resultaten jämförs med de som uppnås genom vesikelfusion metoden.

Protocol

1. Bildning av stöds lipiddubbelskikt på en hydrofil fast bärare

  1. Bered lipid stamlösningar av 10 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) och 1 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissaminrodamin B sulfonyl) (Rh-PE) genom att lösa respektive lipid pulver (lämpligt vägd i förväg med en analytisk massbalans) i isopropanol lösning.
  2. Späd och blanda förrådslösningar i isopropanol i syfte att framställa den önskade lipidblandningen vid den slutliga koncentrationen. För fluorescensmikroskopi och FRAP experiment bör 0,5 vikt-% Rh-PE inkluderas i lipidblandningen.
  3. Injicera lipidblandningen i isopropanol i mikroflödessystem kanal tills den är fylld.
  4. Inkubera lipidblandningen på glasytan under ca 10 minuter.
  5. Gradvis ersätta lipidlösningen med vatten eller buffertlösning med användning av en peristaltisk pump med en mycket låg flödeshastighet(10-50 | j, l / min). Alternativt, byt lipidblandningen genom upprepad pipettering.
  6. Skölj kanalen noggrant med överskott av buffert för att avlägsna kvarvarande isopropanol.

2. Bildning av kolesterol-berikad Membran stöds

Obs: Den fasta ytan (SiO 2) stöder vesikelfusion, men membrankompositionen (högt kolesterol) hämmar vesikelfusion eftersom kolesterolberikade vesiklar har hög böjstyvhet 30.

  1. Bered en stamlösning innehållande 10 mg / ml DOPC lipid, 10 mg / ml kolesterol, och ett mg / ml Rh-PE genom att först lösa de respektive pulvren i isopropanol.
  2. Upprepa steg 1,2-1,6 med hjälp av stamlösningarna som framställts i steg 2.1.

3. membranfluiditet analys

  1. Doppa glasskiva i natriumdodecylsulfat (SDS) -lösning (1%) under 10 min.
  2. Tvätta bilderna noggrant med avjoniserat vatten och skölj intelligenstim etanol.
  3. Föna diabilder med hjälp av en svag ström av kväve.
  4. Exponera glasen till syreplasma under 30 sekunder vid maximal högfrekvent effekt i den syreplasmakammaren.
  5. Ta bort skyddsfilmen beläggning av botten kommersiella mikroflödessystem kammare (Figur 1A) med hjälp av en pincett och bifoga glasskiva på den klibbiga sidan av kammaren (Figur 1B).
  6. Montera kontaktdonen och slangar till inlopps- och utloppslägen hos kammaren och placera mikroflödeskanalen på mikroskopsteget (Figur 1C).
  7. Bilda en fluorescensmärkt stöd lipiddubbelskikt i mikroflödessystem kanal [upprepa steg 1 med önskad lipidkompositionen (t.ex. 0,5 mg / ml DOPC) inklusive 0,5 vikt% Rh-PE i organiskt lösningsmedel].
  8. Leta reda på dubbelskiktet planet med en 60X oljeimmersion mål (NA 1,49) för att ta bilder.
  9. Ta två pre-blekmedels bilder, då foto bleka en 301; m bred cirkulär fläck med en 532 nm, 100 mW laserstråle. Innan fotoblekning, värma upp lasern tills dess intensitet har blivit stabil. Omedelbart efter fotoblekning, ta en serie bilder varje 1 sekund under 2 minuter för att följa återhämtningen i fluorescensintensiteten på blekt plats.

4. Kolesterol Kvantifiering Analys

  1. Exponera kiseldioxiden belagda kvartskristall sensorchipet till syrgasplasma under 30 s vid maximal högfrekvent effekt i den syreplasmakammaren. Avlägsna chipet från kammaren och omedelbart montera chip i mätkammaren.
  2. Före experiment, först förvärvar frekvensen och försvinnande av sensorchip i luft för att säkerställa korrekt montering.
    1. För den kommersiella Q-Sense E1 eller E4 QCM-D instrument, kör Q-Soft program och klicka på "Förvärv" och välj "Setup Measurement".
    2. I det nya fönstret som visas, kontrollera 3, 5, 7, 9, 11 och 13 övertoner och klicka på Sök och springa för att kontrollera resonansspektra. Ställ in temperaturen på 24 ° C. Om en eller flera resonansfrekvenser inte överens med de förväntade värdena, kontrollera chip montering och åter utföra detta steg tills en överenskommelse har nåtts.
  3. Starta den peristaltiska pumpen och flödesbuffertlösning (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) in i mätkammaren med en flödeshastighet av 100 ul / min.
  4. I programmet, klicka på "Förvärv" och välj "Starta mätning" för att registrera resonansfrekvensen och energiupptagning signaler. Upprepa detta steg tills en stabil baslinje erhålls för frekvens och avlednings skift. Obs: För steg nedan, kommer det att finnas ytterligare frekvens och försvinnande skift som kan registreras som en funktion av tiden.
  5. Injicera isopropanol (utan lipid) under 10 min.
  6. Injicera blandning av DOPC lipid / kolesterol påönskade molförhållandet med en total lipidkoncentration av 0,5 mg / ml i isopropanol under 10 min.
  7. Injicera buffert under 20 min vid en flödeshastighet av 100 ul / min.
  8. Injicera en lösning av 1 mM metyl-β-cyklodextrin (MβCD) framställd i buffert (flödeshastighet 100 ul / min) tills frekvenssignalen når ett stabilt värde.
  9. Mät den relativa positiva frekvensskift som orsakas av MβCD behandlingssteget och beräkna massan av kolesterol och DOPC lipider genom att omvandla Af cho och Af DOPC värden till mass värden med hjälp av Sauerbrey ekvationen [AM = - (C / n) × Af, där C = 17,7 ng / cm 2, n: överton].
  10. Beräkna molfraktionen av kolesterol i SLB, med hänsyn till molekylvikterna för DOPC lipid (786,1 g / mol) och kolesterol (386,6 g / mol).

Representative Results

Tillverkning av stöd lipidbiskikt på hydrofila substrat.

VF och SALB bildningsmetoder försöktes på kiseldioxid och guldet och bildningsprocesser övervakades i realtid av QCM-D mätningsteknik. QCM-D instrumentet mäter förändringar i resonansfrekvensen (Δ f) av en oscillerande piezoelektrisk kvartskristall vid mass adsorption på ytan av kristallen. Dessutom QCM-D instrumentet mäter avledning av svängningsenergi i syfte att karakterisera de viskoelastiska egenskaperna (styvhet och mjukhet) hos utanpåskikt. Vesikelfusion Experiment utfördes såsom tidigare beskrivits 31. I korthet framställdes en baslinje först för frekvens- och försvinnande signaler i vattenhaltig buffertlösning [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5; (Figur 2A och B)]. Nästa, små unilamellära DOPC lipidvesiklarna i samma buffert var iprojicerade vid t = 10 minuter (pil 1) på kiseldioxid (Figur 2A) och guld (Figur 2B). För vesikelfusion på kiseldioxid, var två-stegs adsorptionskinetik observerats med finaländringar i frekvens och energiupptagning av -26 (± 1) Hz och 0,3 (± 0,2) × 10-6 respektive. Dessa värden överensstämmer med bildningen av en uppburen lipiddubbelskikt 29.

Såsom visas i fig 2B, tillsatsen av vesikel lösningen på guldytan ledde till en samtidig minskning och ökning av A f och Δ D-signaler, respektive, tills deras värden nådde -150 (± 10) Hz och (7,5 ± 2) × 10 - sex, respektive. Dessa värden anger bildningen av en adsorberad vesikel skikt. Sålunda, såsom förväntat, en SLB bildades inte på guld via vesikelfusion metoden.

QCMD Analys för tvåskikts bildning på kiseldioxid och guld genom SALB metod presenteras i figur 2C och D. På kiseldioxid, slutliga A f och Δ D förskjutningar av -25,6 (± 0,55) Hz och 0,4 (± 0,27) × 10-6 respektive uppnåddes och dessa värden indikerar bildandet av en SLB. Liknande serier av Δ f och Δ Df Au: -27,3 ± 2,7 Hz, Δ D Au: 0,48 (± 0,26) × 10 - 6) observerades på guld. Dessa resultat stödjer att SALB Metoden möjliggör bildandet av stöd lipidbiskikt på ytor som förhindrar vesikler bristning.

Effekt av flödeshastighet lösningsmedelsutbyte om kvaliteten på stöd lipidbiskikt.

För att bestämma de optimala förhållandena för tillverkning av högkvalitativa stöds lipiddubbelskikt viA SALB metoden, var påverkad av lipidkoncentration, lösningsmedels växelkurs och valet av organiska lösningsmedel undersöktes.

Figur 3 visar förändringen i QCM-D frekvensen under det sista steget i den SALB-protokollet, som utförs på kiseldioxid vid två olika flödeshastigheter (100 och 600 | j, l / min) och två olika lipidkoncentrationer (0,125 och 0,5 mg / ml) .

När 0,5 mg / ml DOPC lipid användes (figur 3A), var dubbelskiktsbildningen inte påverkas av flödeshastigheten och en slutlig Af förskjutning av ca -26 Hz erhölls vid båda flödeshastigheter.

Däremot när en lägre lipidkoncentration användes, mängden adsorberat lipid efter fullständig lösningsmedelsutbyte signifikant påverkas av flödet (Figur 3B). Vid en genomsnittlig flödeshastighet av 100 ul / min, dubbelskiktsbildningen var fullständig (Af omkring -26 Hz). Men vid en 6-faldig högre flödeshastighet (600 pl / min), var en komplett dubbelskikt bildas inte (Af omkring -17 Hz). Dessa resultat ger en riktlinje för att välja rätt experimentella förutsättningar för en framgångsrik dubbelskiktsbildning med hjälp av SALB metoden med isopropanol som organiskt lösningsmedel val.

Karakterisering av stöds lipiddubbelskikt bildade från olika lipidkoncentrationer i olika alkohollösningar.

Lipidkoncentration är en annan parameter som påverkar kvaliteten på SLBs erhållits genom användning av SALB metoden. Fluorescensmikroskopi visade att vid 0,05 mg / ml lipid koncentration, var endast enstaka, under mikroskopiska lipidstrukturer bildas (figur 4A). Med ökande lipidkoncentration används i SALB förfarandet, fluorescensintensiteten hos de lipidstrukturer blev mer homogen. Vid 0,1 mg / ml lipidkoncentration, fanns mikroskopiska lipid patchar fastän strukturerna inte spänna över hela field perspektiv (Figur 4B). När emellertid 0,25 mg / ml lipidkoncentration användes, var en homogen lipiddubbelskikt bildas (figur 4C). Därför finns det en minimal lipid koncentration som krävs för att bilda en komplett, full överbryggande SLB.

Inverkan av lipidkoncentration på det slutliga resultatet av de SALB experiment undersöktes också över ett bredare lipidkoncentration intervall (0,01 till 5 mg / ml) och i olika organiska lösningsmedel (isopropanol, etanol och n-propanol). Den Δ f och Δ D-värden som motsvarar det slutliga steget i SALB förfarandet presenteras i figur 5.

Vi definierade tvåskikts bildning baserat på finaländringar i avledning frekvens och energi mellan -25 och -30 Hz och mindre än 0,5 x 10 -6, respektive. Baserat på dessa kriterier, att den optimala lipidkoncentrationen intervall bilda en uppburen lipiddubbelskikt bestämdes vara mellan 0,1 och 0,5 mg/ ml i hög grad oberoende av typen av organiskt lösningsmedel. Avvikelserna i den förvärvade Δ f och Δ D skiftar utanför det tidigare nämnda intervallet är beroende på närvaron av ytterligare massa (t.ex. tvåskiktsmembran stackar), förekomsten av icke-dubbelskikts morfologier (t.ex. vesiklar, maskliknande miceller), och förekomsten av fragmenterade dubbelskikts öar med ofullständig morfologi över substratet.

Medan SALB förfarandet erhållna stöds lipiddubbelskikt är relativt robust, kan den optimala lipidkoncentrationen för högkvalitativ dubbelskiktsbildning kräver inställning beroende på den specifika experimentella konfigurationen. I grund och botten, det finns inte bara en minimal lipidkoncentration men också en maximal lipidkoncentration krävs för optimal biskikt bildning via SALB metoden. Den optimala koncentrationsområdet är beroende av flödeshastigheten och kan också påverkas av substratet och lipidkompositionen. Empiriskt i många fall har vi found att en lipidkoncentration av 0,5 mg / ml och en flödeshastighet av 100 ul / min är den optimala uppsättningen av villkor för bildning av en homogen stöds lipiddubbelskikt. Men beroende på lipidsammansättningen och flödescellgeometrin-den senare som påverkar flödesprofilen under lösningsmedelsutbyte-ytterligare optimering av lipidkoncentration kan vara nödvändigt. Därför rekommenderar vi att utföra pilot SALB experiment med hjälp av en 0,5 mg / ml lipid koncentration och bedöma biskiktet kvaliteten med hjälp av QCM-D eller fluorescenstekniker mikroskopi. Om biskikten verkar ofullständig, bör ökas lipidkoncentrationen i steg om 10% tills tillfredsställande resultat uppnås. Om dubbelskiktet tycks samexistera med ytterligare lipidstrukturer, då lipidkoncentrationen bör minskas i steg om 10% tills tillfredsställande resultat uppnås.

Tillverkning av stöd lipidbiskikt med olika lipidkompositioner och different kolesterolfraktioner.

Därefter tillsattes de SALB och VF metoder som används för att bilda kolesterolberikad SLBs. Figur 6 visar representativa fluorescensbilder (100 x 100 pm) av kolesterolinnehållande supported membran framställda av SALB metoden. Membranen består av cirkulära formade färgämnes uteslutna domäner omgivna av en kontinuerlig fas som kännetecknas av en enhetlig fluorescerande ljusstyrka. De mörka domäner ökade med ökande kolesterolfraktionen i föregångaren lipidblandningen. Därefter tillsattes FRAP mätningar som utförs i syfte att undersöka fluiditet lipiddubbelskiktet filmerna. Mätningarna FRAP avslöjade nästan fullständig fluorescens återhämtning i den omgivande fasen, vilket tyder på sido rörlighet av lipider och därmed bildandet av en enda lipiddubbelskikt. Eftersom Rh-PE partitioner företrädesvis i vätskefasen, de mörka domänerna troligen bestående av täta kolesterol berikade strukturer. För jämförelse framställdes tillverkning av DOPC / Chol dubbelskikt med hjälp av VF-metoden också försökts. DOPC blåsor med ökande kolesterolfraktioner (10-40 mol%) framställdes genom vesikelns extrudering metoden. Rh-PE lipiden (0,5 vikt-%) användes som den fluorescerande märkningen för avbildning. Figur 7 visar representativa fluorescensbilder (100 x 100 pm) av strukturer som skapas vid inkubation av glassubstraten med kolesterolinnehållande vesiklar. FRAP-analys visade bildandet av en fluid lipiddubbelskikt med användning vesiklar som innehöll 20 mol-% Chol eller mindre. Emellertid prover framställes genom användning av vesiklar med högre fraktioner kolesterol uppvisade inte återhämtning, vilket indikerar närvaron av adsorberat men ouppbrutna vesiklar.

Den fraktion av kolesterol som slutligen införlivades stöds lipiddubbelskikten kvantifierades som en funktion av kolesterolfraktion som hade inkluderats i föregångaren läppenid blandningen i organiskt lösningsmedel i SALB metoden eller i vesiklar i vattenhaltig lösning i VF-metoden. Använda QCM-D-tekniken, var dubbelskiktsbildning övervakas och därefter MβCD tillsattes för att specifikt extrahera Chol från stöds lipiddubbelskikten 32. Massan förlusten på grund av avlägsnandet av kolesterol ledde till en minskning av det absoluta värdet av frekvensförskjutningen (| A ^ f |) associerad med SLB. De relativa positiva frekvensskift som orsakas av MβCD behandlingssteget visas i fig 8A. Molfraktionen av kolesterol beräknades baserat på frekvensförskjutningen, såsom presenteras i figur 8B.

Kolesterol fraktion införlivas stöds lipiddubbelskikt framställda genom SALB metoden var nästan linjärt proportionell mot kolesterolhalter i prekursorn lipidblandningen. Intressant, kolesterolfraktionen i bilayers utarbetats av VF-metoden (vesiklar innehållande upp till20 mol% Chol) var väsentligt lägre än den som finns i utgångs blåsor. I själva verket, den högsta delen av kolesterol som erhålls med VF-metoden var endast ca 10 mol-%.

Observation av rand överbyggnad i den β-två-fas samexistens regionen hos kolesterol-fosfolipid stöds lipiddubbelskikt.

SALB experiment vidare utförs med användning av en lipidblandning med en ännu högre fraktion av kolesterol. När en 4: 6 blandning av DOPC och kolesterol användes, en gradvis demixing av en enhetlig flytande fas i två samexisterande faser visualiseras som ljusa remsformade domänerna på en mörk (färgämne-exkluderande) bakgrund observerades (figur 9). Det är klarlagt att Rh-PE är undantagen från kolesterolrika domänerna 33, och därmed de dominerande mörka områden som dök upp som bakgrund är kolesterolberikade områden. Bildandet av mikrometerstorlek ljusa områden på en mörk bakgrund på high kolesterolfraktion (> 50 mol-%) överensstämmer med den β regionen i monolagret fasdiagrammet av kolesterol / fosfolipider blandningar 34,35. Dessutom, antyder bildningen av rand-domäner, som uppstår från en svag linje spänning att blandningen är nära en blandbarhet kritisk punkt.

Figur 1
Figur 1. Mikroflödes kammare för SALB bildning i en lämplig konfiguration för epifluorescensmikroskopi. (A) Kommersiell mikroflödeskammare, (B) Glastäck monterad i självhäftande sidan av kammaren, (C) Komplett installation på ett objekthållare med slang ansluten till inlopps- och utloppsportar i kammaren, och (D) Peristaltisk pump som används för att kontrollera hastigheten för lösningsmedelsutbyte. Lipider lösta i isopropanol injiceras i mätningen Chamber med hjälp av den peristaltiska pumpen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. QCM-D-analys av vesikelfusion och SALB experiment på kiseldioxid och guld substrat. QCM-D frekvens (Af, blå) och försvinnande (AD, röd) svar för tredje överton (n = 3) registrerades som ett funktion av tiden under lipid-adsorption på (A och C) kiseldioxid, (B och D) guld. Paneler A och B fram vesikeln fusionsmetoden. DOPC lipidvesiklar injicerades vid t = 10 minuter (pil 1). Paneler c och d överensstämmer med SALB bildningsmetoden. Pilar indikerar injiceringen av buffert (1), isopropanol (2), lipidblandningen [0,5 mg / ml DOPC lipid i isopropanol; (3)] ​​och poleraer utbyte (4). Den streckade kurvan i panel B motsvarar ett kontrollexperiment i vilket lipiden inte injicerades. De slutliga värdena för Af och AD för varje yta anges. Schemat visar de föreslagna monterade lipidstrukturer som framgår av den slutliga frekvens och avlednings skift. Anpassad från 24 referens och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Inverkan av lösningsmedels växelkursen på bildningsprocessen SALB. QCM-D frekvensskift (Af) som motsvarar det slutliga steget (se pil 4 i fig 2C) i SALB metoden mättes på kiseldioxid vid två olika växelkurser, 100 och 600 | j, l / min, u sjunga (A) 0,5 mg / ml och (B) 0,125 mg / ml DOPC lipid i isopropanol. De slutliga Af värdena också anges, jämfört med baslinjemätningen i vattenbuffertlösning. Anpassad från 24 referens och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Tröskel av lipidkoncentration för Complete SALB Bildning epifluorescensmikroskopi av lipidskikt på kiseldioxid framställd genom SALB med användning av (A) 0,05 mg / ml.; (B) 0,1 mg / ml; och (C) 0,25 mg / ml lipidkoncentration. Anpassad från referens 26 och används med tillstånd av American Chemical Society./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Inverkan av lipidkoncentration och organiskt lösningsmedel på stöds lipiddubbelskikt bildning genom den SALB metoden. De slutliga förändringar i QCM-D (A) frekvens och (B) energiavledning för SALB experiment med användning av olika organiska lösningsmedel, som en funktion av lipid koncentration. De streckade gröna linjerna motsvarar den förväntade frekvensen och försvinnande skift för en komplett dubbelskikt (-30 Hz <Af <-25 Hz och AD <1 x 10 -6). Anpassad från referens 26 och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6
Figur 6. Fluorescens återhämtning efter fotoblekning analys av stöd lipidbiskikt med varierande fraktioner av kolesterol som utarbetats av SALB metoden på ett glassubstrat. (AE) Fluorescence mikrografer av dubbelskikt framställes med användning av olika kolesterolfraktionerna i prekursorblandningen. Bilder registrerades omedelbart (överst) och 1 minut (mitten) efter fotoblekning. Den mörk fläck i bildens centrum motsvarar den photobleached regionen. Skal barer är 20 nm. Yta histogram enskilda färgämnes uteslutna domäner inom varje prov presenteras också (botten). Anpassad från referens 36 och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. FRAP analys av kolesterolinnehållande stöds bilayers utarbetats av vesikelfusion metoden. (AD) Fluorescence mikrofotografier av dubbelskikt framställas med användning av olika kolesterolfraktioner (10 till 40 mol%), i utgångs blåsor. Bilder registrerades omedelbart (överst) och 1 minut (botten) efter fotoblekning. Den mörk fläck i bildens centrum motsvarar den photobleached regionen. Skal barer är 20 nm. Anpassad från referens 36 och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Quantification av kolesterol-fraktionen i kompatibla lipiddubbelskikt. (A) Den positiva QCM-D frekvensskift vid injektion av 1 mM MβCD på stödda lipidbiskikt med varierande molfraktionerna av kolesterol i prekursorblandningen (mellan 0 och 50 mol-%). (B) molprocent kolesterol utarmat från de dubbla skikten framställda av SALB och vesikel fusion metoder som en funktion av kolesterolfraktionen i förblandningarna eller vesiklar. Anpassad från referens 36 och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figur 9. Tidsberoende utveckling av fluorescens mikro i en uppburen dubbelskikt av DOPC / Chol (4: 6 molförhållande containing 0,5% rodamin-PE) framställd genom SALB metoden. En enhetlig fas gradvis fasen separerar till en vätska-vätska samexistens region vid fullständig lösningsmedelsutbyte. Anpassad från referens 37 och används med tillstånd av American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta arbete, är ett lösningsmedel-utbytesprotokollet presenterades i vilka lipider i alkohol (isopropanol, etanol eller n-propanol) inkuberas med en fast bärare och därefter alkoholen ersattes gradvis med en vattenhaltig buffertlösning för att driva en serie av fasövergångar så småningom producera lamellär fas lipiddubbelskikt 24. Det är visat att metoden möjliggör tillverkning av uppburna lipidbiskikt på ytor såsom guld, vilket är svår till vesikelfusion metoden.

En optimal lipidkoncentration intervall (0,1 - 0,5 mg / ml) har bestämts för fullständig dubbelskiktsbildning i experimentella standardformat som testats hittills. Vid lipidkoncentrationer under 0,1 mg / ml, diskreta, mikroskopiska fläckar av dubbellager bildas. Å andra sidan, vid koncentrationer över 0,1 mg / ml och lägre än 0,5 mg / ml, är en komplett och enhetlig dubbelskikt bildas. Vid lipidkoncentrationer över detta intervall, var en fluid biskikt fortfarande formade som verifikationed av FRAP analys, men avslöjar fluorescensmikroskopi närvaron av ytterligare lipidstrukturer ovanpå dubbelskiktet. Påfallande, morfologin för dessa ytterligare lipidstrukturer, bestämt genom QCM-D-analys, beroende på alkoholen som användes under inkubationssteget. I fallet med etanol, de relativt höga ö f och Δ D skift likna QCM-D signatur erhålls för en adsorberad vesikel skikt. När isopropanol eller n-propanol i stället används, Δ f var något högre än det värde som förväntas för ett dubbelskikt (slut Δ f mellan -30 till -40 Hz), medan Δ D var betydligt högre. Sådana QCM-D responser skulle förväntas under längre lipidstrukturer (t.ex. maskliknande miceller) utskjutande utåt från membranytan (som synligt genom fluorescensmikroskopi i vissa fall).

Hastigheten för lösningsmedelsutbyte är en annan viktig parameter, som kan vara kritisk, especially när lägre lipidkoncentrationer (t.ex., 0,1 mg / ml) används. Snabb lösningsmedelsutbyte vid låg lipidkoncentration kan leda till bildandet av ofullständiga biskikt. I standard mätkammaren används för QCM-D mätningar i detta dokument (Q-Sense E4 mätkammare), flödeshastigheter på cirka 100 pl / min, var lämpliga för mycket reproducerbara komplett dubbelskiktsbildning. För flödesceller med andra geometrier och volym, kan den optimala flödeshastigheten variera och måste bestämmas empiriskt baserat på trappan föreslås häri.

Förutom att bilda stöds lipiddubbelskikt på ytor som är svår till vesikelfusion kan SALB användas för att kringgå behovet lipidvesiklar som kan brista, vilket öppnar dörren för tillverkning av stöd membran med komplexa kompositioner. Som ett illustrativt exempel komposition, var lipidblandningar med hög fraktion av kolesterol undersöktes. Kolesterol är en viktig del av MammAlian cellmembran, och dess fraktion kan närma 45-50 mol-% av membranets lipidsammansättning (t.ex., i erytrocyter). Sålunda bör även en enkel modell av ett lipiddubbelskikt som representerar en human cellmembran innefattar kolesterol.

Medan vesikelfusion skulle kunna användas för att tillverka fluidiska lipiddubbelskikt innehållande endast 10-15% kolesterol, möjliggör SALB metoden bildandet av fluid lipiddubbelskikt innehållande höga fraktioner av kolesterol (upp till 57 mol-%, såsom kvantifierades genom QCM-D måtten) 36. När emellertid nivån av kolesterol var ytterligare förhöjd (upp till 63 mol-%), var rand-form domäner observer 37. De samexisterande domäner var vätska, som påminner om dem som observerats i β-regionen i fasdiagrammet av kolesterol / fosfolipider monolager vid luft-vattengränsytan.

Sammantaget är SALB metoden visat sig vara ett enkelt och effektivt sätt att bilda stöds lipiddubbelskikt, särskilt in fall utanför ramen för konventionell vesikelfusion metod. Hittills var mikroskopi QCM-D Teknik och fluorescens främst används för att karakterisera de stöds lipiddubbelskikt bildade genom SALB metoden. Ser fram emot, ett brett utbud av ytkänsliga analytiska mätningar tekniker, inklusive ytplasmonresonans (SPR) 38, atomkraftsmikroskopi (AFM) 39,40, Fourier-transform infraröd spektroskopi 41, röntgen 42 och neutron reflektivitet 43, kan användas för att ytterligare karakterisera och studera enkla och komplexa dubbelskiktskonfigurationer Ställdes enligt SALB metoden. Dessa nya funktioner öppnar dörren till ett större antal forskare som kan utforska artificiella cellmembran genom att dra nytta av en enkel och robust försöksprotokoll.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna stöd från National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 och NRF2015NRF-POC0001-19), National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), och Nanyang Technological University till NJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104 (2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).
Biomembran Fabrication av lösningsmedel assisterad lipiddubbelskiktet (SALB) Metod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter