Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Bestemmelse Ultrasonic vokalisation Preferences i mus ved hjælp af en to-valg afspilning Test

Published: September 3, 2015 doi: 10.3791/53074
Automatic Translation
1, 3, 2, 1
1School of Veterinary Medicine, Azabu University, 2Division of Electric and Information Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Kato Acoustics Consulting Office

Introduction

Mange dyr bruger vokaliseringer for intraspecifikke kommunikation. Hos mus Mus musculus, en vigtig type kommunikation signal er ultralyd vokaliseringer (USVs), som har frekvenser højere end 20 kHz. USVs udsendes af mus betragtes som en del af social anerkendelse i han-hun 1-4, hun-hun 1, 5, og han-han 1, 6 interaktioner. USVs også udsendes af unger, når de er isoleret fra deres mor, hvilket øger hendes Ungen-hentning adfærd, og derfor ungernes overlevelse 7. Selv om mange rapporter har analyseret og kategoriseret mus USVs 8, 9, de adfærdsmæssige responser og neurale mekanismer i modtager animalske blevet mindre dokumenteret 10, 11. Sidstnævnte er nødvendigt at præcisere den biologiske betydning af de forskellige kendetegn ved USVs. At afsløre disse mekanismer, afspilningen eksperiment er en effektiv metode. Nylige playback undersøgelser har afsløret, at kvindeligemus er tiltrukket USVs 12, og at de foretrækker USVs fra mænd, der er forskellige fra deres forældre 13, 14.

Denne artikel forklarer afspilningen test, der anvendes til at evaluere USV præference i mus. En to-choice test box blev udviklet, hvor to forskellige USVs kan afspilles samtidigt i to rum af en test kabinet, som vist i figur 1. Denne type test box forhindrer lyd forurening ved at dividere testområdet i tre delkamre ved anvendelse af bly vægge. Ultralyd udledere er placeret udenfor hvert værelse. I væggen mellem værelser og ultralyd udledere er huller dækket med trådnet. Mus kan bevæge sig frit i de tre værelser, og vise en "søge masken" adfærd, som om at reagere på USVs afspilles af ultralyd udledere. I denne test, mus bo for perioder af forskellig varighed tæt på en lyd emitter eller den anden. Disse parametre kan logges for at opnå en følsom measu re af lyd præference.

For at afspille USVs tilbage, nanokrystallinske silicium termo-akustiske udledere (dvs. "nc-Si emitter") blev anvendt som i tidligere undersøgelser 15-17. Disse indretninger er sammensat af en tynd-filmopvarmeren elektrode, en nano-porøst silicium lag, og en enkelt-krystallinsk siliciumskive. Den digitale lyd-filen konverteres til et analogt signal og ledes derefter gennem varmeren elektrode. Enheden konverterer de resulterende spændingsafhængige termiske signaler til betydeligt lydtryk med lav forvrængning. Denne enhed er unik ved, at i modsætning til almindelige lydgeneratorer der er afhængige af mekaniske vibrationer, kan den reproducere lyd uden brug af en membran. Den emitter udviser en flad lydtrykniveau ved frekvenser fra 20 til 160 kHz (figur 2), og kan gengive digitalt indspillede murine USVs meget præcist med hensyn til varighed, frekvens og lydtryk 15, 18, ​​19.

ve_content "> I et repræsentativt eksperiment vist i figur 3, blev C57BL / 6 (B6) kvinder lov til at vælge mellem BALB / c (BALB) mandlige USVs og baggrundsstøj. Derudover viser figur 4 valget af B6 og BALB kvinder mellem samtidige USV afspilninger fra en BALB og en B6 mandlig, som rapporteret i en tidligere undersøgelse 14. adskiller karakteristika mandlige USVs mellem B6 og BALB stammer 20. Som det fremgår af disse resultater, kan tiltrækningskraft USVs vurderes med den nuværende protokol, hvor lydene er optaget fra en live individ, akustisk analyseret, og afspilles på andre personer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af den etiske komité i Azabu Universitet. Alle forsøg blev udført i et lydisoleret kammer.

1. Dyrepræparation

  1. Hanner for optagelse
    1. Opnå kønsmodne hanmus oplevet i parring.
  2. Kvindelige forsøgspersoner
    1. Opnå jomfru hunmus, der er blevet opstaldet med 2 til 5 kuldsøskende pr bur (normalt 8 - 12 uger gamle).
    2. Opnå vaginale udstrygninger dagligt for at bestemme fasen af østrale cyklus før prøvningen ifølge McLean 21. Der bør udvises forsigtighed for at minimere vaginal stimulation for at undgå pseudodrægtighed.
    3. Plette smears med Giemsa, og bestemme fase af østrale cyklus på basis af tilstedeværelsen eller fraværet af leukocytter, forhornede epitelceller, og kerneholdige epitelceller, ifølge Nelson 22.

2. Enheder (figur 1)

_content "> Figur 1
Figur 1. Skematisk af To valg Test Box og enheder. Mus kan få adgang til lokaler A og B gennem de små porte placeret mellem dem og den neutrale zone. De to-valg boksen og to ultralyd udledere er placeret på gulvet i et lydisoleret kammer. Mikrofonen er ophængt inde i lydisoleret kammer. Forkortelse:. Pc, personlig computer Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Til optagelse
    1. Tilslut en ultralyds kondensatormikrofon til en pc ved hjælp af et USB-A / D-konverter.
    2. Indstille forstærkningen af ​​den A / D-konverter til "7".
    3. Optag akustiske data i 16-bit format filer med en samplingfrekvens på 400 kHz ved hjælp af lyd capture software.
  2. For afspilning
    1. Tilslut en D / A-konverter til pc'en ved hjælpet USB-interface.
    2. Forbind to forstærkere til D / A-konverter gennem en lyddæmper. (Sidstnævnte enhed tjener til at forhindre overbelastning.)
    3. Tilslut en ultralyd emitter til hver forstærker.

3. USV Optagelse

  1. Placer en hanmus i en små (17 x 10 x 11 cm) eller mellemstore (21 x 14 x 13 cm) bur med et hul 6 cm diameter i sidevæggen og hullet dækket med et 0,5 cm trådnet. Ved brug af en mellemstor bur, konstruere en partition på tværs af midten af ​​buret for at reducere området.
  2. Brug ikke strøelse i buret for at undgå raslende lyde, der kunne forurene optagelserne.
  3. Placer en mikrofon ved siden masken.
  4. Begynd ultralyd vokalisering overvågning med optagelsen opsætningen vist i trin 2.1.
  5. Placer en kønsmoden hunmus i enten metestrus eller diøstrus i buret med den mandlige mus.
  6. Optag USVs i 3 - 5 min.

4. Test Box

  1. Byg testen boksen ved hjælp af akryl bord (figur 1).
    Bemærk: Testen boks (35 x 20, og x 20 cm høj) er inddelt i tre rum: en neutral zone (15 x 20 cm), og værelser A og B (20 x 10 cm, hver). Værelser A og B har hver et hul 4 cm diameter, som er dækket med et 0,5 cm trådnet. Hullerne og mesh er placeret ved hver ende af værelser A og B. Gør porte (5 x 5 cm hver) mellem den neutrale zone og værelser A og B.
  2. For at forhindre lydudslip isolere hvert ultralyd emitter, bortset fra den side der vender masken, ved hjælp af gummiplader, forsegling dem til boks omkring omkredsen af ​​hver maske.
  3. Placer bly tætninger på begge sider af muren mellem rum A og B til lydisolering.

5. Forberedelse til Afspilning af lyd

  1. Oprettelse af Playback Sounds
    1. Fang en 20 sek segment af USV fra den optagede fil ved hjælp af digital lyd redigeringssoftware.
    2. Vælg og fange baggrunden nejise (0,35 sek) fra 20 sek USV segment fil. Opret en 20 sek baggrundsstøj fil ved at gentage støj segment.
    3. For at afspille de to lydfiler samtidigt, eksportere dem som en enkelt stereolyd fil, med en fil til "venstre øre", og den anden fil til "højre øre."
    4. Filter lydfiler ved hjælp af high-pass filter med en afskæring på 40 kHz.
    5. Reducere støj ved hjælp af støj-reduktion værktøj i post-behandling software. Vælg og fange et segment af den fil, der ikke indeholder USVs som støj-reduktion profil, og køre støjreduktion med niveau 40.
  2. Kalibrering af Playback Sounds
    1. Sørg for, at rummet mellem ultralyd udledere og mikrofon er 10 cm.
    2. Sådan kalibreres lydtryk fra ultralyd udledere, udføre ultralyd overvågning ved hjælp af konfigurationen beskrevet i trin 2.1. Mål lydtryksniveauet af mikrofonen i decibel (dB).
    3. Using dæmperen og forstærkere, justere lydstyrken på de USVs genereret af ultralyd udledere til samme lydtrykniveau som de mandlige USVs optaget i trin 3.
    4. Når du bruger to ultralyd emittere og en lydfil bestående af USVs og baggrundsstøj, bekræfter, at de to ultralyd udledere udviser samme lydtrykniveau ved hjælp af en kalibrering lyd (fx en 75-kHz ren tone), før du udfører adfærdsmæssige test.
    5. Når gengivelse en lydfil bestående af to strømme af USVs, justere de to genererede lydtrykniveauer til det samme niveau, før testning.

6. To-choice test

  1. Placer ultralyd udledere bag maskerne i testen kassen.
  2. Luk portene til værelserne A og B med en akryl bord, og vænne den kvindelige underlagt den neutrale zone i 30 min. Dæk kassen med akryl bord for at undgå, at musen kan undslippe.
  3. Start videooptagelse ved hjælp af en CCD kamera monteret over feltet. Kameraet (ikke vist i figur 1) dækker arealet af alle tre rum.
  4. Fjern porten og cover-bord og lad den kvindelige at udforske frit testen boksen, herunder lyd zoner.
  5. Når hunnen har undersøgt både masker, og er vendt tilbage til den neutrale zone, begynde at spille en 20 sek lydfil gentagne gange i 5 eller 10 min.
  6. Gennemføre adfærdsmæssige overvågning af 5 eller 10 min.
  7. For at reducere uønskede olfaktoriske tidskoder deponeret fra den tidligere emne rengøres test bure mellem forsøgene med 70% ethanol.
  8. Skift sted, ultralyd udledere A og B tilfældigt at undgå iboende side skævhed effekt mod rum A eller B.

7. Statistiske analyser

  1. Brug adfærdsmæssige event-scoring software, analysere følgende parametre: det samlede antal poster i hvert rum; samlede varighed af ophold i hver midterste zone; samlede varighed af ophold i hver lyd zone; ogsamlede varighed af jagten på hver maske foran ultralyd emitter. Figur 1 illustrerer, hvad der menes med "midterste zone" og "lyd zone."
    Bemærk: I tilfælde hvor musen bliver på skillelinjen mellem de to zoner (figur 1, stiplet linje) bestemme placeringen af retningen af hovedet. Når hovedet vender masken side er det scorede som et ophold i lyttezone.
  2. For hver adfærdsmæssige parametre, sammenligne svarene for værelser A og B ved hjælp af en Wilcoxon logget rank test, eller parrede t -tests med et signifikansniveau på 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De USVs optaget fra en BALB-mænd (161 stavelser pr 20 sek), samt baggrundsstøj blev anvendt som afspilningslydstyrkerne i repræsentativt eksperiment vist i figur 3. I dette eksperiment blev 7 kvindelige B6 mus anvendes ved 9 ugers alderen . At bestemme den bedste varighed afprøvning af kvindelige respons at afspille lyde, blev de adfærdsmæssige parametre analyseret separat for den første og sidste fem minutter af den samlede 10 min testtid.

Først var der ingen signifikant forskel i samlede varighed af ophold i rum A eller B under efterforskningen tid, før afspilningen (figur 3A), hvilket viser, at der ikke var nogen side bias.The Resultaterne viste også, at der ikke var nogen forskel mellem baggrunden støj-side og han-USVs side i antallet af indgange værelse, analysere de første 5 minutter, de sidste 5 min, og den samlede testtid (figur 3B). Figur 3C viser kumulative sekunders Varighion af opholdet i hvert rum under afspilning (dvs. samlede varighed af opholdet i midten zone og i lyden zone). Forsøgspersonerne tilbragte signifikant længere tid i BALB han-USV side end i baggrunden støj-side, når man analyserer de første 5 min (p = 0,043) eller de samlede testtid (p = 0,043). Der var ingen signifikante forskelle i disse parametre, når man analyserer ved sidste 5 min. Der var ingen signifikante forskelle mellem baggrunden støj-side og mandlige-USVs side i midten zone (figur 3D). Men B6 hunner brugt signifikant længere tid i lyden zone og søge masken i BALB mandlige-USV side, i forhold til baggrunden støj-side, når man analyserer de første 5 min (Sound zone, p = 0,018, figur 3E; Mesh , p = 0,018, figur 3F) eller total testtid (Sound zone, p = 0,028, figur 3E, Mesh, p = 0,043, figur 3F). Resultaterne viser klart, at en B6 kvindeligtilgange flere gengivelsen mandlige-USVs end baggrundsstøjen, især i de første 5 min.

Denne to-choice test er nyttigt at sammenligne egenskaberne af USVs. I en tidligere undersøgelse blev denne test anvendes til at bestemme USV præference for B6 og BALB hunmus for USVs fra hanner af disse stammer 11. Ved brug af en afspilning kombination af USVs fra en B6 (133 stavelser pr 20 sek) og en BALB (108 stavelser pr 20 sek) mænd, hunmus af hver af disse stammer udviste længere søgetiden for USVs af hanner i den anden stamme end af deres egne én (figur 4).

Figur 2
Figur 2. Målt Lydtryksniveau (SPL) Dannet med NC-Si Emitter som en funktion af frekvens En næsten konstant SPL på ca. 80 -. Observeres 90 dB mellem 40 og 160 kHz. AC input powis er 1,3 W i dette tilfælde. Emitter blev anbragt i en afstand på 20 mm fra en højfrekvent kondensatormikrofon og på linie med centrum. Dette tal har været ændret siden Kihara 19. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. B6 Kvindelige Reaktion på baggrundsstøj og BALB Mand USVs. (A) Samlet varighed af ophold i rum A eller B under efterforskningen tid, før afspilning. (B) Antal rum poster under afspilning. (C) Samlet varighed af opholdet i værelserne. (D) Samlet varighed af opholdet i midten zone . (E) Samlet varighed af opholdet i lyden zonen. (F) Samlet varighed af søge maskerne. Målinger af hverindivid er givet i dot plots; vandrette linjer i hvert plot angiver middelværdien; n = 7; * Angiver signifikante forskelle (p <0,05) mellem baggrundsstøj og mandlige USVs for parametrene analyserede; Wilcoxon signed-rank test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Kvindelige Reaktion på USVs af Hanner fra en anden stamme vs. den samme stamme. B6 (n = 6) og BALB (n = 10) hunner i diøstrus udsat for mandlig snavset sengetøj før testning viste længere varighed søgning tider for anden stamme USVs. De viste værdier er middelværdi + standardfejl; * Angiver signifikante forskelle (p <0,05); Wilcoxon signed-rank test. Dette tal er blevet ændret fra Asaba Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Støtte til JSP'er Fellows til AA; af Grants-in-Aid for Videnskabelig Forskning på innovative områder for JSP'er Fellows (No. 4501 og nr 25132712) til TK; og af et forskningsprojekt tilskud af Azabu Universitet. Figur 2 er genoptrykt fra Kihara, T., Harada, T., & Koshida, N. Wafer-kompatible fabrikation og karakteristika nanokrystallinsk silicium termisk inducerede ultralyd udledere. I: Sensorer og aktuatorer A: Fysiske, volumen 125, Elsevier, s. 426, (2006), med tilladelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soundproof chamber Muromachi Kikai
Small cage CLEA Japan CL-0113-1
Middle cage CLEA Japan CL-0103-1
Ultrasound condenser microphones Avisoft Bioacoustics CM16/CMPA
A/D converter Avisoft Bioacoustics UltraSoundGate116H
Audio software Avisoft Bioacoustics RECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing software Adobe Systems Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter Original not commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converter National Instruments NI USB-6251 BNC
Attenuator Original
Amplifier Yamatake
PC Windows 7 professional Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring software original Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin) Tokyo bouon TI-75BK B4 Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
  2. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
  3. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  4. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
  5. Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
  6. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  7. Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
  8. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
  9. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
  10. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
  11. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
  12. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  13. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  14. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
  15. Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
  16. Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
  17. Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
  18. Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
  19. Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
  20. Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
  21. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
  22. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  23. Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
  24. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
  25. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  26. Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
  27. Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  28. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
  29. Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
  30. Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
  31. Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
  32. Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
  33. Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).

Tags

Adfærd Ultrasonic vokalisering Mate valg seksuel selektion social anerkendelse pup isolation opkald BALB / c mus C57BL / 6 mus ultralyd emitter
Bestemmelse Ultrasonic vokalisation Preferences i mus ved hjælp af en to-valg afspilning Test
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asaba, A., Kato, M., Koshida, N.,… More

Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback Test. J. Vis. Exp. (103), e53074, doi:10.3791/53074 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter