Introduction
Veel dieren gebruiken geluiden voor intraspecifieke communicatie. In de muis Mus musculus, een belangrijke vorm van communicatie signaal ultrasone geluiden (USVs), welke frequenties hoger dan 20 kHz. USVs uitgezonden door muizen worden beschouwd als een onderdeel van de sociale erkenning in man-vrouw 1-4, female-female 1, 5, en man-man 1, 6 interacties. USVs worden ook uitgestoten door pups wanneer ze geïsoleerd van hun moeder, die haar-pup ophalen gedrag toeneemt, en dus overleving van de jongen 7. Hoewel veel rapporten hebben geanalyseerd en gecategoriseerd muis USVs 8, 9, de gedragsreacties en neurale mechanismen van de ontvangende dieren zijn minder gedocumenteerd 10, 11. Dit laatste is noodzakelijk om de biologische significantie van de verschillende kenmerken van USVs verduidelijken. Om deze mechanismen onthullen de weergave experiment is een efficiënte methode. Recente afspelen studies hebben aangetoond dat vrouwelijkemuizen worden aangetrokken USVs 12, en dat ze liever USVs van mannetjes die verschillen van hun ouders 13, 14.
Dit artikel legt de playback-test gebruikt om USV voorkeur in muizen te evalueren. Een twee-choice test box ontwikkeld waarbij twee verschillende USVs weer tegelijk kunnen worden gespeeld in twee compartimenten van een test behuizing, zoals weergegeven in figuur 1. Dit type test box voorkomt geluid besmetting door het testgebied verdelen in drie sub-kamers gebruik lead wanden. De ultrasone emitters bevinden zich buiten elke kamer. In de wand tussen de kamers en de ultrasone emitters gaten bedekt met gaas. Muizen kunnen vrij bewegen in de drie kamers, en tonen een "zoeken de mazen" gedrag, als om te reageren op USVs afgespeeld door de ultrasone emitters. In deze test muizen verblijven perioden van verschillende duur dichtbij een geluid emitter of andere. Deze parameters kunnen worden ingelogd zijn om een gevoelige measu verkrijgen re van geluid voorkeur.
Om de USVs afspelen, nanokristallijne silicium thermo-akoestische zenders (dwz "nc-Si emitter") werden gebruikt als in eerdere studies 15-17. Deze apparaten bestaan uit een dunne-film verwarmer elektrode, een nanoporeuze siliciumlaag, en een kristallijne siliciumwafel. De digitaal geluidsbestand wordt geconverteerd naar een analoog signaal en vervolgens door de verwarmingselektrode. Het apparaat zet de resulterende voltage-afhankelijke thermische signalen in aanzienlijke geluidsdruk met een lage vervorming. Deze inrichting is uniek doordat, anders dan gewone geluidsgeneratoren die afhankelijk zijn van mechanische trillingen, kan het geluid reproduceren zonder de noodzaak van een diafragma. De zender vertoont een vlak geluidsdrukniveau bij frequenties 20-160 kHz (figuur 2), en kan digitaal opgenomen muizen USVs reproduceren zeer nauwkeurig in termen van duur, frequentie en geluidsdrukniveau 15, 18, 19.
ve_content "> In een representatief experiment is getoond in figuur 3, werden C57BL / 6 (B6) vrouwtjes kunnen kiezen tussen BALB / c (BALB) mannelijke USVs en achtergrondruis. Bovendien Figuur 4 toont de keuze van B6 en BALB vrouwen tussen gelijktijdige USV playback van een BALB en B6 mannelijke, zoals gerapporteerd in een eerdere studie 14. De kenmerken van de mannelijke USVs verschillen tussen B6 en BALB stammen 20. Zoals blijkt uit deze resultaten, kan de aantrekkelijkheid van USVs worden beoordeeld met het huidige protocol, waarin geluiden worden opgenomen van een live individu, akoestisch geanalyseerd, en afgespeeld met andere individuen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van Azabu University. Alle experimenten werden uitgevoerd in een geluiddichte kamer uitgevoerd.
1. Dierlijke Voorbereiding
- Mannetjes voor opname
- Verkrijgen geslachtsrijpe mannelijke muizen ervaren in paring.
- Vrouwelijke proefpersonen
- Verkrijgen maagdelijke vrouwelijke muizen die werden ondergebracht met 2-5 nestgenoten per kooi (meestal 8-12 weken oud).
- Verkrijgen vaginale uitstrijkjes dagelijks aan de fase van de loopsheid voor de test te bepalen, volgens McLean 21. Zorg moet worden genomen om de vaginale stimulatie minimaliseren schijndracht voorkomen.
- Vlekken de uitstrijkjes met Giemsa en bepalen fase van de loopsheid gebaseerd op de aanwezigheid of afwezigheid van leukocyten, verhoornde epitheelcellen en kernhoudende epitheelcellen volgens Nelson 22.
2. Devices (figuur 1)
_content ">
Figuur 1. Schematische voorstelling van de twee-keuze testbox en apparaten. Muizen toegang kamers A en B door de kleine poort tussen hen en de neutrale zone. De twee keuze doos en twee ultrasone emitters op de vloer van een geluiddichte kamer geplaatst. De microfoon is opgehangen in de geluiddichte kamer. Afkorting:. PC, personal computer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voor opname
- Sluit een ultrasone condensatormicrofoon op een pc met een USB A / D converter.
- Stel de winst niveau van de A / D converter op "7".
- Record akoestische gegevens in 16-bit-bestanden met een sampling rate van 400 kHz met behulp van audio-opname software.
- Voor het afspelen
- Sluit een D / A converter aan de PC viaeen USB-interface.
- Verbind twee versterkers aan de D / A-omzetter via een verzwakker. (Deze inrichting dient overbelasting te voorkomen.)
- Sluit een echo emitter aan elke versterker.
3. USV Opname
- Plaats een mannelijke muis in een kleine (17 x 10 x 11 cm) en middelgrote (21 x 14 x 13 cm) kooi met een gat van 6 cm diameter in de zijwand en het gat afgedekt met een 0,5 cm gaas. Bij gebruik van een middelgrote kooi construct een scheidingswand over het midden van de kooi naar het gebied te verlagen.
- Gebruik geen beddengoed in de kooi te ruisen geluiden die de opnames kunnen besmetten te voorkomen.
- Plaats een microfoon naast de maas.
- Begin ultrasone vocalisatie controle met de opname setup getoond in stap 2.1.
- Plaats een geslachtsrijpe vrouwelijke muis in beide metestrus of diestrus in de kooi met de mannelijke muizen.
- Record USVs voor 3-5 min.
4. Test Box
- Bouw de test box met acryl boord (figuur 1).
Opmerking: De testbox (35 x 20 en x 20 cm hoog) is onderverdeeld in drie compartimenten: een neutrale zone (15 x 20 cm), en de kamers A en B (20 x 10 cm, elk). De kamers A en B elk een 4 cm diameter gat dat is bedekt met een 0,5 cm gaas. De gaten en gaas bevinden zich aan elk uiteinde van de kamers A en B. Maak poorten (5 x 5 cm elk) tussen de neutrale zone en kamers A en B. - Om te voorkomen geluidverlies isoleren elke ultrasone emitter, met uitzondering van de kant van het netwerk, via rubber platen verzegeling aan de doos rond de omtrek van een maas.
- Plaats lead afdichtingen aan beide zijden van de wand tussen de kamers A en B voor geluidsisolatie.
5. Voorbereiden voor Beeld afspelen
- Creatie van Playback Sounds
- Het veroveren van een 20 sec segment van USV uit het opgenomen bestand met behulp van digitale audio-editing software.
- Selecteer en geen vangen achtergrondise (0.35 sec) van de 20 sec USV segment bestand. Maak een 20 sec achtergrondgeluid bestand door het herhalen van het lawaai segment.
- Om gelijktijdig af te spelen de twee geluidsbestanden, ze exporteren als een enkel stereo geluidsbestand, met een bestand voor de "linkeroor" en het andere bestand voor de "rechteroor."
- Filter de geluidsbestanden met als high-pass filter met een cut-off van 40 kHz.
- Vermindering van het geluid met behulp van de ruisonderdrukking functie in post-processing software. Selecteren en het veroveren van een deel van het bestand dat geen USVs als ruisonderdrukking profiel bevat, en lopen ruisonderdrukking met level 40.
- Kalibratie van Playback Sounds
- Zorg ervoor dat de ruimte tussen ultrasone emitters en microfoon is 10 cm.
- Aan geluidsdruk van de ultrasone zenders te kalibreren, voert ultrasone controle met behulp van de in stap 2.1 beschreven configuratie. Meet het geluidsdrukniveau van de microfoon in decibels (dB).
- Using de demper en versterkers, stel het volume van de door de ultrasone zenders op hetzelfde geluidsniveau als de mannelijke USVs opgenomen in stap 3 USVs.
- Bij gebruik van de twee ultrasone zenders en een geluidsbestand bestaat uit USVs en achtergrondgeluiden, bevestigen dat de twee ultrasone emitters vertonen hetzelfde geluidsdrukniveau met behulp van een kalibratie-geluid (bijvoorbeeld een 75-kHz zuivere toon) voor het uitvoeren van de gedragstest.
- Bij het reproduceren van een geluidsbestand uit twee stromen USVs, passen de twee gegenereerde geluidsdruk op hetzelfde niveau voor het testen.
6. Twee-choice test
- Plaats de ultrasone emitters achter de mazen van de test box.
- Sluit de poorten naar kamers A en B met een acryl board en wennen de vrouwelijke onder de neutrale zone 30 min. Bedek de doos met acryl boord te voorkomen dat de muis kan ontsnappen.
- Start video-opname met een CC-D camera boven het vak gemonteerd. De camera (niet in figuur 1 getoond) omvat het gebied van de drie compartimenten.
- Verwijder de poort en deksel boord en laat de vrouwelijke vrij de test box, met inbegrip van het geluid zones te verkennen.
- Nadat het vrouwtje heeft onderzocht zowel mazen en is teruggekeerd naar de neutrale zone, start een 20 sec geluidsbestand afspelen herhaald gedurende 5 of 10 minuten.
- Gedrag gedrags controle voor 5 of 10 minuten.
- Om ongewenste olfactorische signalen afgezet uit het vorige onderwerp verminderen, reinigen proefkooien tussen de tests met 70% ethanol.
- Schakel de plaats van ultrageluid emitters A en B willekeurige inherente vooroordeel effect richting kamers A of B voorkomen
7. Statistische analyses
- Met behulp van gedragsmatige event-scoring software, analyseert de volgende parameters: totale aantal vermeldingen in elke kamer; totale duur van het verblijf in elk middelste zone; totale duur van het verblijf in elk geluid zone; entotale duur van het zoeken van een maas voor ultrasone zender. Figuur 1 laat zien wat wordt bedoeld met "middenzone" en "sound zone."
Opmerking: Wanneer de muis blijft op de scheidingslijn tussen de twee zones (Figuur 1, stippellijn) beslissen over de locatie door de richting van het hoofd. Wanneer het hoofd ziet het gaas kant wordt gescoord als een verblijf in de geluidszone. - Voor elke gedrags parameter, vergelijk antwoorden voor kamers A en B met een rangtekentoets of gepaarde t -testen met een significantie niveau van 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De USVs opgenomen van een BALB-male (161 lettergrepen per 20 sec), en achtergrondgeluid werden als weergave geluiden in de representatief experiment is getoond in figuur 3. In dit experiment werden 7 vrouwelijke B6-muizen gebruikt 9 weken oud . Voor zover duur van het testen van vrouwelijke respons op geluid afspelen bepalen werden de gedragsparameters afzonderlijk geanalyseerd voor de eerste en laatste vijf minuten van het totaal 10 minuten testtijd.
Ten eerste, was er geen significant verschil in de totale duur van het verblijf in kamers A of B tijdens het onderzoek tijd voordat het afspelen (figuur 3A), waaruit blijkt dat er geen kant bias.The resultaten toonden ook aan dat er geen verschil was tussen de achtergrond ruis-side en de mannelijk USVs zijde van het aantal inschrijvingen kamer, het analyseren van de eerste 5 min, de laatste 5 minuten, en de totale testtijd (Figuur 3B). Figuur 3C toont cumulatieve seconden Duration van het verblijf in elke kamer tijdens het afspelen (dat wil zeggen, de totale duur van het verblijf in de middelste zone, en in het geluid zone). De onderwerpen bracht beduidend langere tijd in de BALB mannelijke-USV kant dan op de achtergrond ruis kant bij het analyseren van de eerste 5 min (p = 0,043), of de totale testtijd (p = 0,043). Er waren geen significante verschillen in deze parameters bij de analyse volgens laatste 5 minuten. Er waren geen significante verschillen tussen de achtergrond ruis kant en de mannelijk USVs elkaar in de middenzone (Figuur 3D). Echter, B6 vrouwen brachten significant langere tijd in de geluidszone en opzoeken van de mazen in het BALB mannelijke USV kant, in vergelijking met de achtergrond ruis kant, bij het analyseren van de eerste 5 min (Sound zone, p = 0,018, figuur 3E; Mesh , p = 0,018, figuur 3F) of totaal testtijd (Sound zone, p = 0,028, figuur 3E, Mesh, p = 0,043, figuur 3F). De resultaten tonen duidelijk aan dat een vrouwelijke B6nadert meer de gereproduceerde mannelijk USVs dan de achtergrondruis, met name in de eerste 5 min.
Deze twee-keuze-test is nuttig om de eigenschappen van USVs vergelijken. In een eerdere studie, werd deze test gebruikt om USV voorkeur van de B6 en BALB vrouwelijke muizen voor USVs van mannetjes van deze stammen 11 te bepalen. Bij gebruik van een playback combinatie van USVs uit B6 (133 lettergrepen per 20 sec) en een BALB (108 lettergrepen per 20 sec) mannelijke, vrouwelijke muizen van elk van deze stammen toonde langer zoeken maal de USVs mannetjes andere stam dan hun eigen one (figuur 4).
Figuur 2. gemeten geluidsdrukniveau (SPL) gegenereerd door de nc-Si Emitter als een functie van de frequentie Een bijna constante SPL van ongeveer 80 -. 90 dB is waargenomen tussen 40 en 160 kHz. AC input power is 1,3 W in dit geval. De emitter werd geplaatst op een afstand van 20 mm van een hoogfrequente condensator microfoon en uitgelijnd met het centrum. Dit cijfer is aangepast van Kihara 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. B6 Vrouw Response to Background Noise en BALB Man USVs. (A) Totale duur van het verblijf in kamers A of B tijdens het onderzoek tijd voordat het afspelen. (B) Aantal inschrijvingen kamer tijdens het afspelen. (C) Totale duur van het verblijf in de kamers. (D) Totale duur van het verblijf in de middelste zone . (E) Totale duur van het verblijf in de geluidszone. (F) Totale duur van het zoeken van de mazen. Metingen van elkindividuele worden gegeven in dot plots; horizontale balken in elk perceel geven het gemiddelde; n = 7; * Geven significante verschillen (p <0,05) tussen de achtergrondruis en mannelijke USVs de parameters geanalyseerd; Wilcoxon signed-rank test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Vrouwelijke Reactie op USVs van mannetjes uit een andere stam vs. dezelfde stam. B6 (n = 6) en BALB (n = 10) vrouwtjes diestrus blootgesteld aan mannelijke vervuilde strooisel voor testen toonden langere zoektijden voor andere stam USVs. De weergegeven waarden zijn gemiddelde + standaard fout; * Geven significante verschillen (p <0,05); Wilcoxon signed-rank test. Dit cijfer is aangepast van Asaba
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Steun voor JSPS Fellows AA; door Grants-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek inzake innovatieve gebieden voor JSPS Fellows (nr 4501 en nr 25132712) naar TK; en door een onderzoek subsidie van Azabu University. Figuur 2 is overgenomen uit Kihara, T., Harada, T., & Koshida, N. Wafer-compatibele fabricage en eigenschappen van nanokristallijne silicium thermisch geïnduceerde ultrasone emitters. In: sensoren en actuatoren A: Fysiek, volume 125, Elsevier, p. 426, (2006), met toestemming van Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
References
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
- Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
- Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
- Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
- Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
- Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
- Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
- Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
- Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
- Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
- Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
- Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
- Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
- Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
- Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
- Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).
