Introduction
Molti animali usano vocalizzazioni per la comunicazione intraspecifica. Nel topo Mus musculus, uno importante tipo di segnale di comunicazione è vocalizzazioni ultrasoniche (USV), che hanno frequenze superiori a 20 kHz. USV emessi dai topi sono considerati una componente di riconoscimento sociale in maschio-femmina 1-4, femmina-femmina 1, 5, e maschio-maschio 1, 6 interazioni. USV vengono emessi anche da cuccioli quando sono isolate dalla loro madre, che aumenta il suo comportamento-pup recupero, e di conseguenza la sopravvivenza Pup 7. Anche se molti studi hanno analizzato e classificato USV del mouse 8, 9, le risposte comportamentali e meccanismi neurali dell'animale ricevente sono stati meno documentati 10, 11. Quest'ultimo è necessario per chiarire il significato biologico delle diverse caratteristiche di USV. Per rivelare questi meccanismi, l'esperimento di riproduzione è un metodo efficiente. Studi di riproduzione recenti hanno rivelato che femminilei topi sono attratti da USV 12, e che preferiscono USV da maschi che sono diversi dai loro genitori 13, 14.
Questo articolo spiega il test di riproduzione utilizzato per valutare USV preferenza nei topi. Una scatola test a due scelta è stata sviluppata in cui due USV differenti possono essere riprodotte contemporaneamente in due compartimenti di un contenitore di prova, come illustrato in Figura 1. Questo tipo di scatola di prova impedisce la contaminazione suono dividendo l'area di prova in tre sottocamere , con muri di piombo. Gli emettitori di ultrasuoni si trovano al di fuori di ogni stanza. Nel muro tra le camere e emettitori di ultrasuoni sono buchi coperti di rete metallica. Topi può muoversi liberamente nelle tre sale, e mostra una "ricerca della rete" comportamento, come se per rispondere a USV riprodotte dagli emettitori di ultrasuoni. In questo test, i topi soggiornare per periodi di durata diversa vicino a un emettitore sonoro o l'altro. Questi parametri possono essere registrati per ottenere un sensibile misu re di preferenza suono.
Per riprodurre i USV indietro, silicio nanocristallino emettitori termo-acustico (cioè, "emettitore nc-Si"), sono stati utilizzati come in studi precedenti 15-17. Questi dispositivi sono composti da un elettrodo a film sottile riscaldatore, uno strato di silicio poroso nano, e un wafer di silicio monocristallino. Il file audio digitale viene convertito in un segnale analogico e poi fatto passare attraverso l'elettrodo riscaldatore. Il dispositivo converte i segnali termici derivanti voltaggio-dipendenti in significativo di pressione sonora con bassa distorsione. Questo dispositivo è unico in quanto, a differenza di generatori di suoni comuni che dipendono da vibrazioni meccaniche, può riprodurre il suono senza la necessità di un diaframma. L'emettitore presenta un livello di pressione sonora piatta a frequenze da 20 a 160 kHz (figura 2), e può riprodurre USV murini digitalmente registrate molto accuratamente in termini di durata, frequenza e livello sonoro di pressione 15, 18, 19.
ve_content "> In un esperimento rappresentativo mostrato in Figura 3, C57BL / 6 (B6) femmine hanno permesso di scegliere tra BALB / c (BALB) USV maschi e rumore di fondo. Inoltre, la Figura 4 mostra la scelta delle femmine B6 e BALB tra riproduzioni USV simultanee da un topo BALB e un maschio B6, come riportato in un precedente studio 14. Le caratteristiche di USV maschili differiscono B6 e BALB ceppi 20. Come mostrato da questi risultati, l'attrattiva di USV può essere valutata con il presente protocollo, in cui i suoni sono registrati da un individuo dal vivo, acusticamente analizzati e riprodotti ad altri individui.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico di Azabu University. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una camera insonorizzata.
1. Preparazione degli animali
- Maschi per la registrazione
- Ottenere topi maschi sessualmente maturi esperienza in accoppiamento.
- Soggetti di sesso femminile
- Ottenere vergine topi femmina che hanno ospitato da 2 a 5 fratellini per gabbia (di solito 8 - 12 settimane).
- Ottenere striscio vaginale giornaliero per determinare la fase del ciclo estrale prima della prova, secondo McLean 21. Si deve prestare attenzione a ridurre al minimo la stimolazione vaginale per evitare pseudogravidanza.
- Stain gli strisci con Giemsa, e determinare fase del ciclo estrale in base alla presenza o assenza di leucociti, cellule epiteliali cornified e cellule epiteliali nucleate, secondo Nelson 22.
2. Dispositivi (Figura 1)
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Figura 1. Schema del due scelta Box Test e dispositivi. I topi possono accedere sale A e B attraverso i piccoli cancelli situati tra loro e la zona neutra. La scatola due scelta e due emettitori ultrasuoni sono posti sul pavimento di una camera insonorizzata. Il microfono è sospeso all'interno della camera insonorizzata. Abbreviazione:. PC, personal computer Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Per la registrazione
- Collegare un microfono a condensatore ad ultrasuoni a un PC utilizzando un convertitore USB A / D.
- Impostare il livello di guadagno del convertitore A / D a "7".
- Dati acustici record in file di formato a 16 bit con una frequenza di campionamento di 400 kHz utilizzando il software di acquisizione audio.
- Per la riproduzione
- Collegare un convertitore D / A al PC utilizzandoun'interfaccia USB.
- Collegare due amplificatori per il convertitore D / A attraverso un attenuatore. (Quest'ultimo dispositivo serve per evitare sovraccarichi.)
- Collegare un emettitore ad ultrasuoni per ogni amplificatore.
3. USV registrazione
- Inserire un topo maschio in piccole (17 x 10 x 11 cm) o medie (21 x 14 x 13 cm) gabbia con un foro di 6 cm di diametro nella parete laterale e il foro coperto con una rete metallica 0,5 cm. Quando si usa una gabbia di medie dimensioni, realizzare una partizione attraverso il centro della gabbia per ridurre l'area.
- Non utilizzare biancheria da letto nella gabbia per evitare fruscii che possono contaminare le registrazioni.
- Collocare un microfono accanto alla mesh.
- Iniziare il monitoraggio ultrasuoni vocalizzazione con l'impostazione di registrazione mostrata al punto 2.1.
- Posizionare un sessualmente maturo topo femmina sia metestrus o diestrus nella gabbia con il topo maschio.
- USV record per 3-5 min.
4. Test Box
- Costruire la casella prova utilizzando bordo acrilico (Figura 1).
Nota: La casella di prova (alta 35 x 20, e x 20 cm) è diviso in tre scomparti: una zona neutra (15 x 20 cm), e sale A e B (20 x 10 cm, ciascuno). Camere A e B hanno ciascuno un foro di 4 centimetri di diametro che è coperto con una rete metallica 0,5 centimetri. I fori e tele si trovano a ciascuna estremità del sale A e B. Fai cancelli (5 x 5 cm ciascuno) tra la zona neutra e camere A e B. - Per evitare perdite suono isolare ciascun emettitore ultrasuoni, ad eccezione del lato rivolto verso la rete, utilizzando lastre in gomma, loro tenuta alla scatola intorno al perimetro di ciascuna maglia.
- Sigilli di piombo posto su entrambi i lati del muro tra le stanze A e B per l'isolamento acustico.
5. La preparazione per la riproduzione del suono
- Creazione di riproduzione Suoni
- Catturare un segmento di 20 secondi di USV dal file registrato utilizzando software di editing audio digitale.
- Selezionare e catturare sfondo noise (0.35 sec) dal file segmento 20 sec USV. Creare un file di rumore di fondo 20 sec ripetendo il segmento rumore.
- Per riprodurre i due file audio contemporaneamente, esportarli come un unico file audio stereo, con un file per il "orecchio sinistro" e l'altro file per il "orecchio destro."
- Filtrare i file audio utilizzando come filtro passa-alto con un taglio di 40 kHz.
- Ridurre il rumore utilizzando lo strumento di riduzione del rumore in software di post-elaborazione. Selezionare e catturare un segmento del file che contiene USV come il profilo di riduzione del rumore, ed eseguire la riduzione del rumore con il livello 40.
- Taratura di riproduzione Suoni
- Assicurarsi che lo spazio tra gli emettitori di ultrasuoni e il microfono è di 10 cm.
- Per calibrare i livelli di pressione sonora dagli emettitori di ultrasuoni, effettuare il monitoraggio ad ultrasuoni utilizzando la configurazione descritta al punto 2.1. Misurare il livello di pressione sonora dal microfono in decibel (dB).
- Using l'attenuatore e amplificatori, regolare il volume dei USV generati dai emettitori ultrasuoni allo stesso livello di pressione sonora come USV maschi registrate nel passaggio 3.
- Quando si utilizzano i due emettitori di ultrasuoni e un file audio composto da USV e rumore di fondo, verificare che i due emettitori di ultrasuoni presentano lo stesso livello di pressione sonora con un suono di calibrazione (per esempio, un tono puro 75-kHz) prima di eseguire il test comportamentale.
- Quando si riproduce un file audio composto da due flussi di USV, regolare i due livelli di pressione sonora generati allo stesso livello, prima del test.
6. Prova a due scelta
- Posizionare gli emettitori di ultrasuoni dietro le maglie della scatola della prova.
- Chiudere le porte di stanze A e B con un bordo acrilico, e abituare il soggetto femminile alla zona neutra per 30 min. Coprire la scatola con bordo acrilico per evitare che il mouse può sfuggire.
- Avviare la registrazione video utilizzando un CCFotocamera D montata sopra la casella. La telecamera (non mostrato in figura 1) comprende una superficie di tutte tre scomparti.
- Rimuovere il cancello e la copertura di bordo e lasciare la femmina di esplorare liberamente la casella di prova, comprese le zone sane.
- Una volta che la femmina ha indagato due maglie, ed è tornato alla zona neutra, avviare la riproduzione di un file audio di 20 secondi più volte per 5 o 10 minuti.
- Condurre il monitoraggio comportamentale per 5 o 10 minuti.
- Per ridurre stimoli olfattivi indesiderati depositati dal soggetto precedente, pulire le gabbie di prova tra le prove con il 70% di etanolo.
- Accendere il luogo di emettitori di ultrasuoni A e B in modo casuale al fine di evitare pregiudizi inerenti effetto lato verso le camere A o B.
7. Analisi statistica
- Utilizzando il software comportamentale evento-gol, l'analisi dei seguenti parametri: numero totale delle voci in ogni stanza; durata totale di permanenza in ogni zona mediana; durata totale di permanenza in ogni zona del suono; edurata totale di ricerca di ciascuna maglia davanti ultrasuoni emettitore. Figura 1 illustra ciò che si intende per "zona intermedia" e "zona suono."
Nota: Nei casi in cui il mouse rimane sulla linea di separazione tra le due zone (figura 1, linea tratteggiata) decidere la posizione della direzione della testa. Quando la testa rivolta verso il lato della maglia, è segnato come permanenza nella zona di suono. - Per ogni parametro comportamentale, confrontare le risposte per camere A e B con un Wilcoxon prova firmato-rank, o t -test in coppia con un livello di significatività di 0.05.
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Representative Results
I USV registrate da un topo BALB-maschio (161 sillabe per 20 sec), così come rumore di fondo sono stati utilizzati come riprodurre suoni nell'esperimento rappresentante illustrato nella figura 3. In questo esperimento, 7 topi B6 femminili sono stati usati a 9 settimane di età . Per determinare la migliore durata della prova della risposta femminile di riproduzione suoni, i parametri comportamentali sono state analizzate separatamente per i primi e gli ultimi cinque minuti del tempo di collaudo totale 10 min.
In primo luogo, non vi era alcuna differenza significativa nella durata totale del soggiorno in camere A o B durante il tempo di indagine prima della riproduzione (figura 3A), a dimostrazione che non vi era nessun risultato bias.The lato hanno inoltre dimostrato che non vi era alcuna differenza tra il lato di fondo-rumore e il lato maschio-USV del numero di voci da pranzo, analizzando i primi 5 minuti, l'ultimo 5 min, e tempo di prova totale (Figura 3B). Figura 3C mostra secondi cumulativi di DURATione di permanenza in ogni camera durante la riproduzione (cioè durata totale di permanenza nella zona mediana, e nella zona di suono). I soggetti hanno trascorso tempo significativamente più lungo nel lato BALB maschio-USV rispetto al lato di fondo rumore quando si analizzano i primi 5 minuti (p = 0,043), o il tempo di test totale (p = 0,043). Non ci sono state differenze significative in questi parametri quando si analizzano da ultimi 5 minuti. Non ci sono state differenze significative tra il lato di fondo rumore e il lato maschile-USV nella zona mediana (Figura 3D). Tuttavia, le femmine B6 trascorso del tempo significativamente più lungo nella zona di suono e cercare la rete nella parte BALB maschio-USV, rispetto al lato di fondo-rumore, quando si analizzano i primi 5 minuti (zona Suono, p = 0.018, Figura 3E; Mesh , p = 0.018, figura 3F) o il tempo di prova totale (zona Suono, p = 0.028, figura 3E, Mesh, p = 0.043, figura 3F). I risultati dimostrano chiaramente che una femmina B6Approcci più i maschi-USV riprodotti rispetto al rumore di fondo, in particolare nel primo 5 min.
Questo test due scelta è utile per confrontare le caratteristiche di USV. In uno studio precedente, questo test è stato utilizzato per determinare USV preferenza di topi femmina BALB B6 e per USV da maschi di questi ceppi 11. Quando si utilizza una combinazione di riproduzione di USV da un B6 (133 sillabe per 20 sec) e un topo BALB (108 sillabe per 20 sec) maschio, topi femmina di ciascuno di questi ceppi ha mostrato più volte alla ricerca delle USV dei maschi del altro ceppo di uno di loro (figura 4).
Figura 2. Misurato livello di pressione sonora (SPL) generato dal nc-Si emettitore come funzione della frequenza Un SPL quasi costante di circa 80 -. 90 dB si osserva tra i 40 e 160 kHz. Pow ingresso ACer è 1,3 W in questo caso. L'emettitore è posto ad una distanza di 20 mm da un microfono a condensatore ad alta frequenza e allineato con il suo centro. Questa cifra è stata modificata da 19 Kihara. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. B6 Femminile Risposta al rumore di fondo e BALB maschio USV. (A) Durata totale del soggiorno in camere A o B durante il tempo di indagine prima della riproduzione. (B) Numero di voci stanza durante la riproduzione. (C) Durata totale del soggiorno nelle camere. (D) Durata totale del soggiorno nella zona centrale . (E) Durata totale del soggiorno nella zona di suono. (F) Durata totale di cercare maglie. Misure di ciascunindividuale sono dati in dot plot; barre orizzontali in ogni appezzamento indicano la media; n = 7; * Indicano differenze significative (p <0.05) tra il rumore di fondo e USV maschili per i parametri analizzati; Wilcoxon test dei ranghi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Femminile risposta a USV di maschi da un ceppo diverso rispetto lo stesso ceppo. B6 (n = 6) e BALB (n = 10) femmine diestrus esposti a biancheria da letto-maschio sporca prima del test hanno mostrato tempi di ricerca durata più lunghi per la altri USV ceppo. I valori indicati sono media + errore standard; * Indicano differenze significative (p <0,05); Wilcoxon test dei ranghi. Questa cifra è stata modificata da Asaba
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa-in-Aid per JSPS Fellows a AA; da sovvenzioni-in-Aid per la Ricerca Scientifica sulle zone innovative per JSP Fellows (n 4501 e n 25.132.712) di TK; e da una borsa di progetto di ricerca assegnato dalla Azabu University. figura 2 è ristampato da Kihara, T., Harada, T., e Koshida, N. Wafer-compatibile fabbricazione e le caratteristiche del silicio nanocristallino emettitori di ultrasuoni indotte termicamente. In: Sensori e Attuatori A: fisiche, volume 125, Elsevier, pag. 426, (2006), con il permesso di Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
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