Introduction
多くの動物は種内の通信のための発声を使用しています。マウスハツカネズミでは、通信信号の一つの重要な種類は、20kHzのより高い周波数を有する超音波発声（USVs）、です。マウスによって放出されたUSVsは男女1-4、メス-メス1、5、およびオス-オス1、6相互作用における社会的認知のコンポーネントと考えられています。彼らは自分の彼女の子犬-検索行動を増加させ、母、ため、仔の生存7から隔離されたときにUSVsも子犬によって放出されます。多くの報告がマウスUSVs 8,9を分析し、分類しているが、受信動物の行動反応と神経機構は少ない10、11を文書化されている。後者はUSVsの諸特性の生物学的意義を明確にする必要があります。これらのメカニズムを明らかにするために、再生実験は、効率的な方法です。最近の再生の研究は、女性のことを明らかにしましたマウスはUSVs 12に引き寄せられ、彼らは彼らの親13、14から異なっている男性からUSVsを好むこと。
この記事では、マウスのUSVの好みを評価するために使用される再生テストを説明します。二選択試験箱を図1に示すように、2つの異なるUSVsは、試験容器の二つの区画に同時に再生することが可能で開発された。試験箱のこのタイプは、三つのサブチャンバ内にテスト領域を分割して音声汚染を防止、鉛の壁を使用。超音波エミッタが各部屋の外に位置しています。部屋や超音波エミッタとの間の壁にはワイヤメッシュで覆われた穴があります。マウスは、3つの部屋の中で自由に移動し、超音波エミッタによって再生USVsに応答するかのように、「メッシュを検索する」の挙動を示すことができます。この試験では、マウスは1音エミッタまたは他の近くに異なる期間の期間にご利用いただけます。これらのパラメータは、敏感measuを得るために記録することができます音の好みの再。
バックUSVsを再生するには、ナノ結晶シリコン熱音響放射体（ すなわち 、「NC-Siのエミッタ」）は、以前の研究15-17のように使用されました。これらのデバイスは、薄膜ヒータ電極、ナノ多孔質シリコン層、及び単結晶シリコンウエハで構成されています。デジタルサウンドファイルは、アナログ信号に変換された後、ヒータ電極を通過します。デバイスは、低歪みと有意な音圧に生じる電圧に依存する熱信号に変換します。この装置は、その中で一意である、機械的な振動に依存する共通の音源とは異なり、振動板を必要とせずに音を再生することができます。エミッタは、20から160キロヘルツ（ 図2）の周波数で平坦な音圧レベルを示し、持続時間、周波数、音圧レベル15、18、19の観点で非常に正確にデジタルで記録されたネズミUSVsを再生することができます。
図3に示す代表的な実験においてve_contentは">、C57BL / 6（B6）雌のBALB / c（BALB）との間で雄USVsとバックグラウンドノイズを選択させた。また、 図4は、間にB6とBALB女性の選択肢を示していますBALBとB6の男性からの同時USVのプレイバックは、以前の研究で報告されているように14。男性のUSVsの特徴は、B6の間で異なり、BALBは20菌株 。これらの結果により、USVsの魅力が存在するプロトコルを用いて評価することができます示されているように、ここで音は、生きた個体から記録された音響的に分析し、他の個体に再生されます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての手順は、麻布大学の倫理委員会によって承認されました。全ての実験は、防音室で行いました。
1.動物の準備
- 記録のための男性
- 交配の経験が性的に成熟した雄マウスを入手します。
- 女性被験者
- （ - 12週齢通常8）ケージあたり2〜5同腹子に収容されてきた処女雌マウスを入手します。
- マクリーン21によれば、試験前の発情周期の位相を決定するために、毎日の膣スメアを取得します。ケアは、偽妊娠を避けるために、膣の刺激を最小限に抑えるよう注意が必要です。
- ギムザで塗抹標本を染色し、白血球、角化上皮細胞、および有核上皮細胞の有無に基づいて発情周期の位相を決定し、ネルソン22によります。
2. [デバイス（図1）
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二つの選択肢のテストボックスとデバイスの図1の回路図。マウスは、彼らとニュートラルゾーンの間に位置する小さなゲートを介して部屋AとBにアクセスすることができます。二選択ボックスと2つの超音波エミッタは防音室の床に置かれています。マイクは防音チャンバー内に吊り下げられています。略称：PC、パーソナルコンピュータである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 記録のために
- USB型A / Dコンバータを使用してPCに超コンデンサーマイクを接続します。
- 「7」にA / D変換器のゲインレベルを設定します。
- オーディオキャプチャソフトウェアを使用して、400 kHzでのサンプリングレートで16ビット形式のファイル内の音響データを記録します。
- 再生のための
- 使用してPCにD / A変換器を接続しますUSBインターフェース。
- 減衰器を介してD / Aコンバータへの2つのアンプを接続します。 （後者のデバイスは、過負荷を防止するためのものです。）
- 各アンプに超音波エミッタを接続します。
3. USV録音
- 側壁で直径6cmの穴0.5センチ金網で覆われた穴小（17×10×11センチ）または中型（21×14×13 cm）のケージにオスのマウスを置きます。中型ケージを使用する場合は、面積を減少させるために、ケージの中央を横切って、パーティションを構成します。
- 録音を汚染する可能性がカサカサ音を回避するためにケージ内のベッドを使用しないでください。
- メッシュの横にマイクを置きます。
- ステップ2.1に示す記録セットアップと超音波発声の監視を開始します。
- 雄マウスとケージの中に発情後期または発情間期のいずれかで性的に成熟した雌のマウスを置きます。
- 5分 - 3のレコードUSVs。
4. TESTボックス
- アクリル板（ 図1）を使用して、テストボックスを作成します。
注：ニュートラルゾーン（15×20 cm）であり、部屋AとB（20×10センチ、それぞれ）：試験箱（35×20、および×20センチの高さ）は、3つの区画に分割されています。客室AおよびBは、それぞれ0.5センチメートル金網で覆われている4 cmで径孔を有します。穴やメッシュは中立ゾーンと部屋AとBの間の部屋A、Bの各端作るゲート（5×5センチメートルそれぞれ）に配置されています - 音漏れを防止するためには、各メッシュの周囲のボックスにそれらをシール、ゴム板を使用して、メッシュに面する側を除いて、各超音波エミッタを絶縁します。
- 遮音のために部屋AとBの間の壁の両側にリードシールを置きます。
5.サウンド再生の準備
- 再生音の作成
- デジタルオーディオ編集ソフトウェアを使用して記録されたファイルからUSVの20秒のセグメントをキャプチャします。
- 背景なしを選択し、キャプチャ20秒USVセグメントファイルからISE（0.35秒）。雑音区間を繰り返すことにより、20秒のバックグラウンドノイズファイルを作成します。
- 同時に2つのサウンドファイルを再生するには、「左耳」とのために、他のファイルに1つのファイルで、単一のステレオサウンドファイルとして書き出す」右耳。」
- 40kHzのカットオフを用いて、高域通過フィルタを使用して音声ファイルをフィルタ。
- 後処理ソフトウェアでノイズリダクションツールを使用してノイズを低減します。選択し、ノイズ低減プロファイルとして何のUSVsを含まないファイルのセグメントをキャプチャし、レベル40とノイズリダクションを実行します。
- 再生音のキャリブレーション
- 超音波エミッタとマイクの間のスペースは10cmであることを確認してください。
- 超音波エミッタからの音圧レベルを較正するために、ステップ2.1で説明した構成を用いた超音波モニタリングを行います。デシベル（dB）でマイクで音圧レベルを測定します。
- USIアッテネータとアンプをngの、ステップ3で記録された男性のUSVsと同じ音圧レベルに超音波エミッタによって生成されたUSVsの音量を調整します。
- 2つの超音波エミッタとUSVs及び背景雑音からなる音声ファイルを使用する場合、2つの超音波エミッタは、行動試験を行う前にキャリブレーション音（例えば、75 kHzの純音）を使用して、同じ音圧レベルを示すことを確認します。
- USVsの二つの流れから成るサウンドファイルを再生する場合、テストの前に、同じレベルに生成された2つの音圧レベルを調整します。
6.二選択テスト
- 試験箱のメッシュの後ろに超音波エミッタを配置します。
- アクリル板付きの客室、A、Bにゲートを閉じ、30分間のニュートラルゾーンに女性対象を慣らします。マウスが逃げることができることを避けるために、アクリル板で箱をカバー。
- CCを使用して録画を開始しますDカメラは、ボックスの上に取り付けられました。カメラ（ 図1には図示せず）は、全ての3つの区画の面積をカバーします。
- ゲート及びカバーボードを取り外し、女性が自由に音のゾーンを含む試験箱を探索することができます。
- 女性が両方のメッシュを調査しており、ニュートラルゾーンに戻った後は、5または10分間繰り返し、20秒のサウンドファイルの再生を開始。
- 5または10分間の行動監視を行っています。
- 前の対象から堆積望ましくない嗅覚を減らすために、70％エタノールを用いた試験の間に試験ケージを清掃してください。
- ランダム部屋AまたはBに向けて固有の側バイアス効果を避けるために、超音波エミッタAとBの場所を切り替えます
7.統計分析
- 行動イベントスコアのソフトウェアを使用して、次のパラメータを分析：各部屋内のエントリの総数を、各中間ゾーンでの滞在時間の合計。各サウンドゾーンの滞在時間の合計。と超音波エミッタの前に各メッシュの検索の合計時間。 図1は 、「ミドルゾーン」とが何を意味するのかを示して、「サウンドゾーン"。
注意：マウスは、2つのゾーン間の境界線上にとどまる場合には（ 図1、破線は）ヘッドの方向によって位置を決めます。ヘッドメッシュ側を向いている場合には、音声区間での滞在として記録されます。 - 各行動パラメータについては、ウィルコクソンの符号順位検定を使用して部屋AとBの応答を比較し、または0.05の有意水準でのt -testsをペアリング。
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Representative Results
USVs は 、図3に示す代表的な実験に聞こえる再生として使用された1 BALB男性（20秒あたり161音節）と同様に、バックグラウンドノイズから記録した。この実験では、7メスのB6マウスは、生後9週で使用しました。サウンドを再生する女性の応答のテストの最高の持続時間を決定するために、行動パラメータは合計10分間の試験時間の最初と最後の5分間別々に分析しました。
まず、何の側bias.Theの結果はまた、バックグラウンド・ノイズ側との間には差がなかったことを示さなかったがあったことを実証し、再生（図3A）の前に調査時間中に部屋AまたはBでの滞在の合計時間に有意差はなかったですオス・USVs側の部屋のエントリ数で、最初の5分、最後の5分で、総試験時間（ 図3B）を分析するには。 図3Cは、duratの累積秒を示しています再生中に各部屋に滞在のイオン（ すなわち、合計ミドルゾーンでの滞在期間、およびサウンドゾーンで）。最初の5分（P = 0.043）、または総試験時間（P = 0.043）を分析する際に被験者は、バックグラウンド・ノイズ側よりもBALB男性-USV側のかなり長い時間を過ごしました。最後の5分によって分析する際に、これらのパラメーターに有意差はなかったです。ミドルゾーン（ 図3D）のバックグラウンドノイズ側と雄USVs側との間に有意差はなかったです。しかし、B6雌はサウンドゾーンにかなり長い時間を費やし、BALB男性-USV側にメッシュを検索、バックグラウンド・ノイズ側と比較して、最初の5分（サウンドゾーン、P = 0.018、 図3Eを分析する際 、メッシュp = 0.018、 図3F）、または総試験時間（サウンドゾーン、P = 0.028、 図3E;メッシュ、P = 0.043、 図3F）。結果は、B6の女性がすることを実証特に最初の5分で、バックグラウンドノイズより再現男性USVsに近づきます。
この2選択テストはUSVsの特性を比較することは有用です。以前の研究では、このテストは、これらの株11の雄からUSVsためB6およびBALB雌マウスのUSV嗜好を決定しました。 B6（20秒あたり133音節）およびBALB（20秒あたり108音節）男性からUSVsの再生の組み合わせを使用する場合は、これらの株のそれぞれの雌マウスは他の系統の男性のUSVsのための長い検索時間以上を示しました自分の1の（ 図4）。
図2.測定音圧レベル（SPL）周波数の関数としてNC-Siのエミッタによって生成された約80のほぼ一定SPL - 。90デシベルは40と160 kHzの間で観察されています。 AC入力POWerがこのケースで1.3 Wです。エミッタは、高周波コンデンサマイクロホンから20mmの距離に配置され、その中心に合わせました。この図は、木原19から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.バックグラウンドノイズおよびBALB男性USVsにB6女性の対応。 （A）再生前に調査時間中に部屋AまたはBでの滞在時間の合計。（B）再生中に部屋エントリの数。（C）お部屋での滞在時間の合計。（D）ミドルゾーンでの滞在時間の合計。（E）のサウンドゾーンでの滞在時間の合計。（F）メッシュを探索する時間の合計。それぞれの測定個々のドットプロットに示されています。各プロットの横バーは、平均値を示しています。 N = 7。 *分析パラメータのバックグラウンドノイズと雄USVsの間に有意差（p <0.05）を示します。ウィルコクソンの符号付き順位検定。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.女性の同じ系統対異なる株から男性のUSVsへの対応。B6（N = 6）およびBALB（N = 10）、試験の前に男性汚れた寝具にさらさ発情間期中の女性があったために長い期間の検索時間他のひずみUSVs。示されている値は、平均値±標準誤差です。 *有意差（p <0.05）を示します。ウィルコクソンの符号付き順位検定。この図は、浅羽から変更されています
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Acknowledgments
この作品は、費補助金JSPSフェローのためのAAにすることによってサポートされていました。 ;費補助金のために日本学術振興会科学研究員のための革新的な分野にTKへ（第4501号及び25132712）によりますそして、麻布大学。 図2によって授与研究プロジェクトの助成金によって木原、T.、原田、T.、＆越田、N.ウェハー互換製造およびナノ結晶シリコン熱誘起超音波エミッタの特性から転載されました。 センサおよびアクチュエータA：では、物理 、ボリューム125、エルゼビア、P。 426、（2006）、エルゼビアからの許可を得て。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
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