Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Bestemme Ultralyd vokalisering Valg i mus bruker en to-valg avspilling Test

Published: September 3, 2015 doi: 10.3791/53074

Introduction

Mange dyr bruker lyder for intraspesifikk kommunikasjon. I mus Mus musculus, en viktig type av kommunikasjonssignalet er ultrasoniske vokaliseringer (USVs), som har frekvenser høyere enn 20 kHz. USVs slippes ut av mus er regnet som en komponent av sosial anerkjennelse i mannlig-kvinnelig 1-4, female-female 1, 5, og hann-hann 1, 6 interaksjoner. USVs er også slippes ut av valpene når de er isolert fra sin mor, noe som øker hennes valp-hente atferd, og derfor avkommets overlevelse 7. Selv om mange rapporter har analysert og kategorisert mus USVs 8, 9, de atferdsmessige reaksjoner og nevrale mekanismer for mottaker dyret er mindre dokumentert 10, 11. Den sistnevnte er nødvendig for å klargjøre den biologiske betydning av de forskjellige egenskapene til USVs. Å avsløre disse mekanismene, er avspillings eksperimentet en effektiv metode. Nyere avspillings studier har avdekket at kvinneligemus er tiltrukket av USVs 12, og at de foretrekker USVs fra menn som er forskjellig fra sine foreldre 13, 14.

Denne artikkelen forklarer avspilling test som brukes til å evaluere USV preferanse hos mus. En to-valg test-boksen ble utviklet hvor to forskjellige USVs kan avspilles samtidig i to avdelinger av en test kabinett, som vist i figur 1. Denne typen av test-boksen forhindrer at lyden kontaminering ved å dividere testområdet i tre underkamre ved hjelp av bly vegger. Ultralyd emittere er plassert utenfor hvert rom. I veggen mellom rommene og ultralyd emittere er hull dekket med netting. Mus kan bevege seg fritt i de tre rommene, og viser en "søk på nett" atferd, som for å svare på USVs spilles av ultralyd emittere. I denne testen ble mus bo for perioder av forskjellig varighet i nærheten av en lyd emitter eller den andre. Disse parametrene kan logges for å få en sensitiv måle re av lyd preferanser.

For å spille av USVs tilbake, nanocrystalline silicon termo-akustisk emittere (dvs. "nc-Si emitter") ble brukt som i tidligere studier 15-17. Disse anordninger består av en tynn-film varmeapparat elektrode, en nano-porøst silisiumlaget, og et enkelt-krystallinsk silisiumskive. Den digitale lydfil blir konvertert til et analogt signal og føres deretter gjennom varme elektroden. Enheten konverterer de resulterende spenningsavhengige termiske signaler til betydelig lydtrykk med lav forvrengning. Denne enheten er unikt ved at, i motsetning til vanlige lyd-generatorer som er avhengig av mekaniske vibrasjoner, kan det gjengi lyd uten behov for en membran. Emitter viser en flat lydtrykknivå ved frekvenser fra 20 til 160 kHz (figur 2), og kan gjengi digitalt innspilte murine USVs svært nøyaktig med tanke på varighet, frekvens og lydtrykknivå 15, 18, ​​19.

ve_content "> I et representativt eksperiment er vist i figur 3, ble C57BL / 6 (B6) for kvinner tillatt å velge mellom BALB / c (BALB) hann USVs og bakgrunnsstøy. I tillegg, figur 4 viser valget av B6 og BALB kvinner mellom samtidige USV avspillinger fra en BALB og B6 mannlig, som rapportert i en tidligere studie 14. Karakteristikken av mannlige USVs skiller mellom B6 og BALB stammer 20. Som vist av disse resultatene, kan attraktivitet USVs vurderes med denne protokoll, hvor lydene blir registrert fra en levende person, akustisk analysert, og spilles til andre individer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av etikkomiteen i Azabu University. Alle forsøk ble utført i et lydtett kammer.

1. Animal Forberedelse

  1. Hanner for opptak
    1. Få kjønnsmodne hannmus opplevd i parring.
  2. Kvinnelige Temaer
    1. Skaff virgin hunnmus som har blitt plassert med 2 til 5 littermates per bur (vanligvis 8 - 12 uker gamle).
    2. Oppnå vaginalutstryk daglig for å bestemme fasen av brunst før testen, i henhold til McLean 21. Forsiktighet bør tas for å minimere vaginal stimulering for å unngå pseudopregnancy.
    3. Flekk utstryk med Giemsa, og bestemme fasen av brunst basert på tilstedeværelse eller fravær av leukocytter, forhornede epitelceller, og kjerneholdige epitelceller, ifølge Nelson 22.

2. Devices (figur 1)

_content "> Figur 1
Figur 1. Skjematisk av Two-valg Test Box og enheter. Mus kan få tilgang til rom A og B gjennom de små portene som ligger mellom dem og den nøytrale sonen. De to-valget boksen og to ultralyd emittere er plassert på gulvet i et lydtett kammer. Mikrofonen er opphengt inne i lydtett kammer. Forkortelse:. PC, PC Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. For opptak
    1. Koble til en ultralyd kondensatormikrofon til en PC med en USB-A / D-konverter.
    2. Innstille forsterkningen for A / D-omformeren til "7".
    3. Rekord akustiske data i 16-bits format filer med en samplingsfrekvens på 400 kHz ved hjelp av lydopptak programvare.
  2. For avspilling
    1. Koble en D / A-konverter til PC ved hjelpUSB-grensesnitt.
    2. Koble to forsterkere til D / A-konverter gjennom en attenuator. (Den sistnevnte anordning tjener til å hindre overbelastning.)
    3. Koble en ultralyd emitter til hver forsterker.

3. USV Recording

  1. Plasser en hann mus i et små- (17 x 10 x 11 cm) eller middels størrelse (21 x 14 x 13 cm) bur med en 6 cm diameter hull i sideveggen, og hullet er dekket med en 0,5 cm netting. Ved bruk av en middels stor bur, konstruere en skillevegg tvers over midten av buret for å redusere arealet.
  2. Ikke bruk sengetøy i buret for å unngå knitring som kan forurense opptakene.
  3. Plasser en mikrofon ved mesh.
  4. Begynn ultralyd vokalisering overvåking med opptaks oppsettet vist i trinn 2.1.
  5. Plasser en kjønnsmoden hunn mus i enten metestrus eller diestrus i buret med den mannlige mus.
  6. Rekord USVs i 3 - 5 min.

4. Test Box

  1. Bygg testen boksen med akryl bord (figur 1).
    Merk: Test boks (35 x 20, og x 20 cm høy) er delt i tre seksjoner: en nøytral sone (15 x 20 cm), og rommene A og B (20 x 10 cm, hver). Rommene A og B hver har en 4 cm diameter hull som er dekket med en 0,5 cm netting. Hullene og duker er plassert i hver ende av rommene A og B. Foreta porter (5 x 5 cm hver) mellom den nøytrale sone og rommene A og B.
  2. For å hindre lydlekkasje isolere hver enkelt ultralyd-emitter, med unntak av den side som vender mot mesh, ved hjelp av gummiplater, forsegle dem til boksen rundt omkretsen av hver maske.
  3. Place bly selene på begge sider av veggen mellom rom A og B for lydisolasjon.

5. Forberedelse til Lydavspilling

  1. Opprettelse av avspillings Sounds
    1. Fange en 20 sek segment av USV fra den innspilte filen ved hjelp av digital lyd redigering programvare.
    2. Velg og fange bakgrunn ingenise (0,35 sek) fra 20 sek USV segment fil. Lag en 20 sek bakgrunnsstøy-fil ved å gjenta støy segmentet.
    3. For å spille av de to lydfiler samtidig, eksportere dem som en enkelt stereo lydfil, med én fil for "venstre øret" og den andre filen for "høyre øre."
    4. Filter lydfilene bruke som high-pass filter med en cutoff på 40 kHz.
    5. Redusere støyen med støyreduksjon verktøy i post-prosessering programvare. Velg og fange et segment av filen som inneholder ingen USVs som støyreduksjon profil, og kjøre støyreduksjon med level 40.
  2. Kalibrering av avspillings Sounds
    1. Pass på at avstanden mellom ultralyd emittere og mikrofonen er 10 cm.
    2. For å kalibrere lydtrykknivåer fra ultralyd emittere, utfører ultralydovervåking ved hjelp av konfigurasjons beskrevet i trinn 2.1. Mål lydtrykknivå ved mikrofonen i desibel (dB).
    3. USIng demperen og forsterkere, justere volumet av USVs generert av ultralyd emittere til samme lydtrykknivå som de mannlige USVs registrert i trinn tre.
    4. Ved bruk av de to ultralyd emittere og en lydfil som består av USVs og bakgrunnsstøy, bekrefter at de to ultralyd emittere vise den samme lydtrykknivå ved hjelp av en kalibrerings lyd (for eksempel en 75-kHz ren tone) før du utfører atferds test.
    5. Når gjengi en lydfil som består av to strømmer av USVs, justere de to genererte lydtrykk til samme nivå, før testing.

6. To-valg Test

  1. Plasser ultralyd emittere bak maskene i testboksen.
  2. Lukke portene til rom A og B med en akryl bord, og tilvenne den kvinnelige underlagt den nøytrale sonen i 30 min. Dekk boks med akryl bord for å unngå at musen kan unnslippe.
  3. Starte videoopptak ved hjelp av en CCD kamera montert over ruten. Kameraet (ikke vist i figur 1) dekker området av alle tre kammere.
  4. Ta av gate og dekke bord og la den kvinnelige å utforske fritt testen boksen, inkludert lyd soner.
  5. Når hunnen har undersøkt både masker, og har returnert til den nøytrale sonen, begynne å spille et 20 sek lydfil gjentatte ganger for 5 eller 10 min.
  6. Gjennomføre atferdsovervåking for 5 eller 10 min.
  7. For å redusere uønskede olfactory signaler avsatt fra forrige emnet, rydde test bur mellom tester med 70% etanol.
  8. Bytt i stedet for ultralyd emittere A og B tilfeldig unngå iboende side skjevhet effekt mot rom A eller B.

7. Statistiske analyser

  1. Ved hjelp av atferds event-scoring programvare, analysere følgende parametre: total antall oppføringer i hvert rom; totale varigheten av oppholdet i hver midtre sonen; totale varigheten av oppholdet i hver lyd sone; ogtotal varighet på leting etter hver maske foran ultralyd emitter. Figur 1 illustrerer hva som menes med "midtre sonen" og "sound sone."
    Merk: I tilfeller der musen forblir på delelinjen mellom de to sonene (Figur 1, stiplet linje) bestemme plasseringen av retningen av hodet. Når hodet vender mot mesh side, er det scoret som et opphold i lyden sonen.
  2. For hver atferds parameter, sammenligne svarene for rom A og B ved hjelp av en Wilcoxon signert-rank test, eller paret t -UNDERSØKELSER med et signifikansnivå på 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De USVs registrert fra en BALB-hann (161 stavelser per 20 sek), så vel som bakgrunnsstøy ble anvendt som avspilling av lyd i representativt eksperiment er vist i figur 3. I dette eksperimentet, ble 7 hunn B6-mus ble brukt ved 9 ukers alder . For å finne den beste varigheten av testing av kvinnelige svaret å spille lyder, ble de atferdsmessige parametere analysert separat for første og siste fem minutter av den totale 10 min test tid.

Først var det ingen signifikant forskjell i total varighet av oppholdet i rom A eller B under etterforskning før avspilling (figur 3A), viser at det var ingen side bias.The Resultatene viste også at det var ingen forskjell mellom bakgrunnen støy side og hann-USVs side i antall rom oppføringer, analysere den første 5 min, den siste 5 min, og den totale testtiden (figur 3B). Figur 3C viser akkumulerte sekunders duration av oppholdet i hvert rom under avspilling (dvs. total varighet av oppholdet i den midtre sonen, og i lyden sone). Fagene brukte betydelig lengre tid i BALB hann-USV side enn på den bakgrunnsstøy side ved analyse av den første 5 min (p = 0,043), eller den totale testtiden (p = 0,043). Det var ingen signifikante forskjeller i disse parametrene når analysere ved siste 5 min. Det var ingen signifikante forskjeller mellom bakgrunnsstøy siden og den mannlige-USVs side i den midtre sonen (Figur 3D). Imidlertid B6 hunner brukte betydelig lengre tid i lyden sonen og søker maskene i BALB hann-USV side, i forhold til bakgrunnsstøy side, når analysere den første 5 min (Sound sone, p = 0,018, figur 3E; Mesh , p = 0,018, Figur 3F) eller total testing tid (Sound sonen, p = 0,028, Figur 3E, Mesh, p = 0,043, Figur 3F). Resultatene viser tydelig at en B6 kvinneligtilnærminger flere gjengivelsen av mannlige-USVs enn bakgrunnsstøy, spesielt i den første 5 min.

Denne to-choice testen er nyttig å sammenligne egenskapene til USVs. I en tidligere studie, ble denne testen brukes til å bestemme USV preferanse for B6 og BALB hunnmus for USVs fra hanner av disse stammene 11. Ved bruk av en avspilling kombinasjon av USVs fra en B6 (133 stavelser per 20 sek), og en BALB (108 stavelser per 20 sek) hann, hunnmus av hver av disse stammene viste lenger søker tider for USVs av hanner av den annen stamme enn av sin egen en (figur 4).

Figur 2
Figur 2. Målt lydtrykknivå (SPL) genereres av nc-Si emitter som en funksjon av frekvens En nesten konstant SPL på ca 80 -. 90 dB er observert mellom 40 og 160 kHz. AC input poweh er 1,3 W i dette tilfellet. Emitteren ble plassert i en avstand av 20 mm fra en høyfrekvent kondensatormikrofon og på linje med midten. Dette tallet har blitt forandret fra Kihara 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. B6 Kvinne Response til bakgrunnsstøy og BALB Mann USVs. (A) Total varighet av oppholdet i rom A eller B under etterforskning før avspilling. (B) Antall rom oppføringer under avspilling. (C) Total varighet av oppholdet i rommene. (D) Total varighet av oppholdet i den midtre sonen . (E) Total varighet av oppholdet i lyden sonen. (F) Total varighet for å søke i maskene. Målinger av hvertindivid er gitt i dot plots; horisontale barer i hvert plott viser gjennomsnittet; n = 7; * Angir signifikante forskjeller (p <0,05) mellom bakgrunnsstøy og mannlige USVs for parametrene som ble analysert; Wilcoxon signert rang tester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Kvinne Response til USVs av menn fra en annen stamme vs. samme stamme. B6 (n = 6) og BALB (n = 10) kvinner i diestrus utsatt for manns skittent sengetøy før testing viste lengre varighet søke tider for andre belastningsskader USVs. Verdier som vises er gjennomsnitt + standardfeil; * Angir signifikante forskjeller (p <0,05); Wilcoxon signert rang tester. Dette tallet har blitt forandret fra Asaba Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for JSP Fellows til AA; av Grants-i-Aid for Scientific Research på Innovative Områder for JSP Fellows (No. 4501 og nr 25132712) til TK; og med et forskningsprosjekt stipend tildelt av Azabu University. Figur 2 er gjengitt fra Kihara, T., Harada, T., & Koshida, N. Wafer-kompatibel fabrikasjon og egenskapene til nanocrystalline silicon termisk induserte ultralyd emittere. I: Sensorer og aktuatorer A: Fysiske, volum 125, Elsevier, s. 426, (2006), med tillatelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soundproof chamber Muromachi Kikai
Small cage CLEA Japan CL-0113-1
Middle cage CLEA Japan CL-0103-1
Ultrasound condenser microphones Avisoft Bioacoustics CM16/CMPA
A/D converter Avisoft Bioacoustics UltraSoundGate116H
Audio software Avisoft Bioacoustics RECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / Audio editing software Adobe Systems Adobe Audition 3.0
Nc-Si emitter Original not commercially available but it is planned to be so in near future
D/A converter National Instruments NI USB-6251 BNC
Attenuator Original
Amplifier Yamatake
PC Windows 7 professional Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system
Event recorder Excel-macro / Event-scoring software original Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto
CCD Camera
Rubber plates (made of elastomer resin) Tokyo bouon TI-75BK B4 Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
  2. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
  3. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  4. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
  5. Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
  6. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  7. Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
  8. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
  9. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
  10. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
  11. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
  12. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  13. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  14. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
  15. Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
  16. Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
  17. Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
  18. Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
  19. Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
  20. Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
  21. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
  22. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  23. Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
  24. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
  25. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  26. Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
  27. Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  28. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
  29. Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
  30. Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
  31. Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
  32. Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
  33. Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).

Tags

Atferd Ultralyd vokalisering Mate valg seksuell seleksjon sosial anerkjennelse pup isolasjon samtale BALB / c mus C57BL / 6 mus ultralyd emitter
Bestemme Ultralyd vokalisering Valg i mus bruker en to-valg avspilling Test
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Asaba, A., Kato, M., Koshida, N.,More

Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback Test. J. Vis. Exp. (103), e53074, doi:10.3791/53074 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter