Introduction
Многие животные используют вокализации для внутривидовой коммуникации. В мыши Mus Musculus, один важный тип сигнала связи ультразвуковые вокализации (USVs), которые имеют частоты выше 20 кГц. USVs испускаемые мышей считаются составной частью общественного признания в мужской женский 1-4, женщина-женщина 1, 5, и между мужчинами 1, 6 взаимодействий. USVs также излучаемый щенков, когда они изолированы от своей матери, что повышает ее щенок-извлечения поведение, и, следовательно, щенок выживание 7. Хотя многие доклады были проанализированы и классифицированы мыши USVs 8, 9, поведенческие реакции и нервные механизмы принимающей животного были менее документально 10, 11. Последнее необходимо для уточнения биологической значимости различных характеристик USVs. Чтобы выявить эти механизмы, эксперимент воспроизведения является эффективным методом. Недавние исследования показали, воспроизведение, что бы женщинамышей привлекают USVs 12, и что они предпочитают USVs из мужчин, которые отличаются от своих родителей 13, 14.
Эта статья объясняет, тест воспроизведения, используемый для оценки USV предпочтение у мышей. Два выбора теста окно был разработан, в котором два различных USVs могут быть воспроизведены одновременно в двух отсеках испытательном корпусе, как показано на рисунке 1. Этот тип испытательной коробке предотвращает звука загрязнения путем деления испытательной зоны, в трех суб-камер , используя свинцовые стены. Ультразвуковые излучатели В находятся за пределами каждой комнате. В стене между комнатами и ультразвуковых излучателей дыры, покрытые проволочной сетки. Мыши могут свободно перемещаться в трех номерах, и показать "Поиск сетку" поведение, как будто в ответ на USVs воспроизводимых ультразвуковых излучателей в. В этом тесте, мыши остаться на периоды различной продолжительности, близкой к одной звуковой излучатель или другой. Эти параметры могут быть зарегистрированы для получения чувствительной measu Re звука предпочтений.
Для воспроизведения USVs назад, нанокристаллических кремния термоакустическое излучатели (например, "NC-Си излучатель") были использованы в качестве и в предыдущих исследованиях 15-17. Эти устройства состоят из тонкопленочного электрода, нагреватель слоем кремния нанопористого и монокристаллической кремниевой пластины. Цифровой звуковой файл преобразуется в аналоговый сигнал и затем пропускали через нагреватель электрода. Устройство преобразует результирующее напряжение зависит от тепловых сигналов в значительной звукового давления с низким уровнем искажений. Это устройство уникально тем, что, в отличие от распространенных генераторы звука, которые зависят от механических вибраций, он может воспроизводить звук без необходимости диафрагмы. Излучатель имеет плоскую уровень звукового давления на частотах от 20 до 160 кГц (рис 2), и может воспроизводить записанные в цифровом мышиные USVs очень точно с точки зрения продолжительности, частоты и уровня звукового давления 15, 18, 19.
ve_content "> В типичном эксперименте, показанном на фиг.3, C57BL / 6 (В6) самки могут выбирать между BALB / C (BALB) мужчин USVs и фоновый шум. Кроме того, Фиг.4 показывает выбор B6 и BALB женщин между одновременные USV воспроизведений из BALB и В6 мужчина, как сообщается в предыдущем исследовании 14. Характеристики мужских USVs отличаются между B6 и BALB штаммы 20. Как показали эти результаты, привлекательность USVs может быть оценена с настоящим Протоколом, в котором звуки записываются с живой личности, акустически проанализированы и воспроизводятся с другими лицами.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены этическим комитетом университета Азабу мимо. Все эксперименты проводились в звуконепроницаемой камере.
1. Подготовка животных
- Мужчины для записи
- Получить половозрелых самцов мышей опытных в спаривании.
- Женский Субъекты
- Получить девственница мышей, которые были размещены с 2 до 5 помета в клетке (обычно 8 - 12 недель).
- Получить влагалищные мазки ежедневно определять фазу эстрального цикла до испытания, в соответствии с Маклин 21. Уход должны быть приняты, чтобы свести к минимуму вагинальная стимуляция, чтобы избежать Ложная.
- Пятно мазки Гимза, и определяют фазу эстрального цикла на основании наличия или отсутствия лейкоцитов, ороговевших эпителиальных клеток, содержащих ядро и эпителиальных клеток, в соответствии с Нельсоном 22.
2. Устройства (Рисунок 1)
_content ">
Рисунок 1. Схема Два выбора теста Box и устройства. Мыши могут получить доступ к номерам и B через маленькие ворота, расположенные между ними и в нейтральной зоне. Коробка двух выбор и два ультразвуковых излучателей расположены на этаже звуконепроницаемой камере. Микрофон подвешен внутри звуконепроницаемой камере. Аббревиатура:. ПК, персональный компьютер Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Для записи
- Подключите ультразвуковой конденсаторный микрофон к компьютеру с помощью USB-A / D конвертер.
- Установите уровень усиления А / Ц преобразователь на "7".
- Запись акустические данные в 16-битных файлов формата с частотой дискретизации 400 кГц с использованием аудио-программы захвата.
- Для воспроизведения
- Подключите Ц / А преобразователь к ПК, используяинтерфейс USB.
- Подключите два усилителя к D / A конвертер через аттенюатор. (Последнее устройство служит для предотвращения перегрузки.)
- Подключите ультразвуковой излучатель каждого усилителя.
3. Запись USV
- Поставьте самца мыши в малого (17 х 10 х 11 см) или среднего (21 х 14 х 13 см) с отверстием клетку 6 см диаметром в боковине и отверстия, покрытые 0,5 см проволочной сетки. При использовании среднего клетку, построить разбиение по центру клетки, чтобы уменьшить площадь.
- Не используйте кроватях в клетке, чтобы избежать шуршащие звуки, которые могли бы загрязнять записи.
- Поместите микрофон рядом с сеткой.
- Начните ультразвуковой контроль вокализации с установки записи, показанном на шаге 2.1.
- Поставьте половозрелых самок мыши в любом metestrus или диэструса в клетке с самцом мыши.
- Запись USVs для 3 - 5 мин.
4. ТТекущая ячейка
- Постройте тестовую коробку, используя акриловую доску (рисунок 1).
Примечание: тест окно (высокая 35 х 20, х 20 см), разделенный на три отсека: в нейтральную зону (15 х 20 см), и номера А и Б (20 х 10 см, каждый). Номера А и В каждый имеют отверстие 4 см диаметра, который покрыт с 0,5 см проволочной сетки. Отверстия и сетки расположены на каждом конце номера А и В. Сделать ворота (5 х 5 см каждый) между нейтральной зоне и номера А и В. - Чтобы предотвратить утечку звука изолировать каждый ультразвуковой излучатель, для стороны, обращенной к сетки, за исключением, с помощью резиновых пластин, уплотнительных их в поле по периметру каждого сетки.
- Место свинцовые пломбы на обеих сторонах стены между комнатами А и В для звукоизоляции.
5. Подготовка к Воспроизведение звука
- Создание воспроизведения звуков
- Захват сегмент 20 сек для USV из записанного файла с использованием цифровой аудио-программное обеспечение для редактирования.
- Выберите и захватить фон неISE (0,35 сек) с сегмента файла 20 сек USV. Создать 20 сек шума файл фона, повторяя шума сегмент.
- Для воспроизведения звуковых файлов два одновременно, экспортировать их как единый стерео звуковой файл, с одним файлом для "левом ухе», а другой файл для "правого уха".
- Фильтр звуковые файлы, используя как фильтр высоких частот с обрезанием 40 кГц.
- Снижение шума с помощью инструмента шумоподавления в программном обеспечении пост-обработки. Выберите и захватить сегмент файла, который не содержит USVs как профиль шумоподавления, и запустить снижение шума с 40 уровня.
- Калибровка воспроизведения звуков
- Убедитесь, что пространство между ультразвуковых излучателей и микрофона 10 см.
- Для калибровки уровней звукового давления от ультразвуковых излучателей, ультразвуковой мониторинг выполнения с использованием конфигурации, описанной в шаге 2.1. Измерьте уровень звукового давления по микрофону в децибелах (дБ).
- Usiнг аттенюатора и усилители, отрегулируйте громкость USVs генерируемых ультразвуковыми излучателями на том же уровне звукового давления в мужских USVs записанных в шаге 3.
- При использовании двух ультразвуковых излучателей и звуковой файл, состоящий из USVs и фонового шума, подтверждают, что две ультразвуковые излучатели обладают такой же уровень звукового давления, используя калибровки звука (например, 75 кГц чистый тон) перед выполнением теста поведения.
- При воспроизведении звукового файла, состоящего из двух потоков USVs, регулировать два сгенерированных уровней звукового давления на том же уровне, перед тестированием.
6. Два выбор Тест
- Поместите ультразвуковые излучатели позади ячеек коробки испытания.
- Закройте ворота в номерах А и В с акриловой доски, и приучить женский предмет в нейтральной зоне в течение 30 мин. Накройте коробку с акриловой доски, чтобы избежать, что мышь может бежать.
- Начать запись видео с помощью CCD камеры, установленной над коробкой. Камера (не показан на фиг.1) занимает площадь всех трех отсеков.
- Удалить ворота и кавер-доску и позволяют исследовать женщина свободно контрольное устройство, в том числе звуковых зон.
- Как только женщина исследовал обе сетки, и вернулся в нейтральную зону, начать играть звуковой файл 20 сек неоднократно в течение 5 или 10 мин.
- Провести мониторинг поведения в течение 5 или 10 мин.
- Чтобы уменьшить нежелательные обонятельные сигналы, осажденные из предыдущего субъекта, очистить тестовые клетки между тестами с 70% этанола.
- Переключите место ультразвуковые излучатели А и В случайным, чтобы избежать присущей эффект смещения стороны к комнаты А или В.
7. Статистический анализ
- Использование поведенческого программное обеспечение мероприятие забил, анализировать следующие параметры: общее число записей в каждой комнате; Общая продолжительность пребывания в каждом средней зоне; Общая продолжительность пребывания в каждом звуке зоны; иОбщая продолжительность поиска каждого сетки перед ультразвуковым излучателем. Рисунок 1 иллюстрирует то, что имеется в виду под "средней зоне" и "звуковой зоне."
Примечание: В случаях, когда мышь остается на разделительной линии между двумя зонами (рис 1, пунктирная линия) решить расположение в направлении головы. Когда голова стоит сетчатый сторону, он забил как пребывание в звуковой зоне. - Для каждого параметра поведенческой, сравнить ответы на номера А и B, используя подписали ранга тест Вилкоксона или парные футболки-тестов с уровнем значимости 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В USVs записаны с одной BALB-самца (161 слогов в 20 сек), а также фонового шума были использованы в качестве воспроизведения звуков в типичном эксперименте, показанном на фиг.3. В этом эксперименте, 7 женских B6 мышей использовали в 9-недельного возраста , Чтобы определить наилучший продолжительность испытания женского ответ к воспроизведению звуков, поведенческие показатели были проанализированы отдельно для первой и последней пять минут от общего времени испытания 10 мин.
Во-первых, не было никакого существенного различия в общей продолжительности пребывания в помещениях A или B в течение времени расследования до воспроизведения (рис 3а), демонстрируя, что не было результатов сторона bias.The также не показал, что там не было никакой разницы между фон шума стороны и сторона мужчин-USVs числа записей номеров, анализируя первые 5 мин, последний 5 мин, общее время тестирования (рис 3B). Рисунок 3С кумулятивные секунд duratион пребывания в каждой комнате во время воспроизведения (т.е., общая продолжительность пребывания в средней зоне, и в звуковой зоне). Субъекты провел значительно больше времени в сторону линии BALB мужчины USV, чем в фон шума стороны, при анализе первые 5 мин (р = 0,043), или общее время тестирования (р = 0,043). Там не было никаких существенных различий в этих параметрах при анализе с помощью последнего 5 мин. Там не было никаких существенных различий между стороной фон шума и стороны мужчины-USVs в средней зоне (рис 3D). Тем не менее, В6 женщины потратили значительно больше времени в звуковой зоне и поиске сетку в сторону линии BALB мужчины USV, по сравнению с фоном шума стороны, при анализе первые 5 мин (звук зону, P = 0,018, рис 3E; сетки , р = 0,018, рис 3F) или общее время тестирования (Звук зона, р = 0,028, рис 3E; сетки, р = 0,043, рис 3F). Результаты ясно показывают, что В6 женщинабольше подходит воспроизводимые мужской USVs, чем фоновый шум, особенно в первых 5 мин.
Это два выбора теста полезно сравнить характеристики USVs. В предыдущем исследовании, этот тест был использован для определения USV предпочтение B6 и BALB самок мышей для USVs из самцов этих штаммов 11. При использовании воспроизведения комбинацию USVs из B6 (133 слогов в 20 сек) и мышей BALB (108 слогов в 20 сек) мужской, женский мышей каждой из этих штаммов показал более поиске раза за USVs самцов другой штамм, чем собственного одной (Рисунок 4).
Рисунок 2. Измеряется Уровень звукового давления (SPL), порожденная NC-Si эмиттер в зависимости от частоты почти постоянной звукового давления примерно на 80 -. 90 дБ наблюдается между 40 и 160 кГц. Вход переменного тока военнопленныхэ 1,3 Вт в этом случае. Излучатель был помещен на расстоянии 20 мм от конденсаторного микрофона высокочастотной и выровнены с центром. Эта цифра была изменена с 19 Кихара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. В6 Женский Ответ на фоновый шум и BALB Мужской USVs. (А) Общая продолжительность пребывания в номерах А или В в течение времени расследования до воспроизведения. (В) Количество записей номеров во время воспроизведения. (С) Общая продолжительность проживания в номерах. (D) Общая продолжительность пребывания в средней зоне . (Е) Общая продолжительность пребывания в зоне звуковой. (F) Общая продолжительность поиска меши. Измерения другиндивидуальный приведены в точечных участков; турники в каждом участке указывают среднее; п = 7; * Указывают на значительные различия (р <0,05) между фоновым шумом и мужчин USVs для параметров анализируемых; Уилкоксона испытания подписали ранга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Женщина Ответ на USVs самцов из другого штамма против того же штамма. В6 (п = 6) и линии BALB (п = 10) женщин в диэструса подверженных мужской загрязненные постельные принадлежности до тестирования показали более длительное время поиска продолжительность для другие USVs деформации. Значения представляют собой средние + стандартная ошибка; * Указывают на значительные различия (р <0,05); Уилкоксона испытания подписали ранга. Эта цифра была изменена с Asaba
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом-в-помощь для JSPS стипендиатов до АА; грантами-в-помощь для научных исследований на инновационных направлений для JSPS стипендиатов (№ 4501 и № 25132712) к ТЗ; и грантом исследовательского проекта награжден Azabu университета. рис 2 перепечатана из Кихара, Т. Харада, Т., и Koshida, Н. вафли-совместимого изготовления и характеристик нанокристаллических кремниевых термонаведенных ультразвуковых излучателей. В: датчиков и исполнительных устройств A: Physical, объем 125, Elsevier, стр. 426, (2006), с разрешения Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
References
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351 (2007).
- Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244 (2014).
- Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
- Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405 (2014).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
- Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186 (2014).
- Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
- Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
- Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
- Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
- Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
- Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721 (2011).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389 (2012).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
- Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460 (2011).
- Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782 (2012).
- Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
- Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
- Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
- Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816 (2012).
