Introduction
Muchos animales utilizan vocalizaciones para la comunicación intraespecífica. En el ratón Mus musculus, un tipo importante de la señal de comunicación es vocalizaciones ultrasónicas (USVs), que tienen frecuencias superiores a 20 kHz. USVs emitidos por los ratones se consideran un componente de reconocimiento social en hombre-mujer 1.4, hembra-hembra 1, 5 y macho-macho 1, 6 interacciones. USVs también son emitidos por los cachorros cuando están aislados de su madre, lo que aumenta su comportamiento cachorro-recuperación, y por lo tanto PUP supervivencia 7. Aunque muchos informes han analizado y categorizado USVs ratón 8, 9, las respuestas de comportamiento y mecanismos neurales del animal que recibe se han documentado menos 10, 11. Este último es necesario aclarar el significado biológico de las diversas características de USVs. Para revelar estos mecanismos, el experimento de reproducción es un método eficiente. Estudios recientes han revelado que la reproducción femeninaratones son atraídos a USVs 12, y que prefieren USVs de machos que son diferentes de sus padres 13, 14.
En este artículo se explica la prueba de reproducción se utiliza para evaluar USV preferencia en ratones. Una caja de prueba de dos elección se desarrolló en el que dos USVs diferentes se pueden reproducir simultáneamente en dos compartimentos de un recinto de ensayo, como se muestra en la Figura 1. Este tipo de caja de prueba evita la contaminación sonora dividiendo el área de prueba en tres sub-cámaras , el uso de paredes de plomo. Los emisores de ultrasonidos se encuentran fuera de cada habitación. En la pared entre las habitaciones y emisores de ultrasonido son agujeros cubiertos con una malla de alambre. Los ratones pueden moverse libremente en las tres habitaciones, y muestran una "búsqueda de la malla" el comportamiento, como para responder a USVs reproducidas por los emisores de ultrasonido. En esta prueba, los ratones se mantienen durante períodos de diferente duración cerca de un emisor de sonido o el otro. Estos parámetros se pueden registrar para obtener un measu sensibles re de la preferencia de sonido.
Para reproducir los USVs espalda, emisores termo-acústico de silicio nanocristalino (es decir, "nc-Si emisor") fueron utilizados como en estudios previos 15-17. Estos dispositivos se componen de un electrodo de película delgada calentador, una capa de silicio nano-poroso, y una oblea de silicio monocristalino. El archivo de sonido digital se convierte en una señal analógica y después se pasa a través del electrodo calefactor. El dispositivo convierte las señales térmicas dependientes de voltaje resultantes en presión sonora significativa con baja distorsión. Este dispositivo es único en que, a diferencia de los generadores de sonido comunes que dependen de las vibraciones mecánicas, se puede reproducir el sonido sin la necesidad de un diafragma. El emisor presenta un nivel de presión sonora plana en las frecuencias de 20 a 160 kHz (Figura 2), y puede reproducir USVs murinos grabados digitalmente con mucha precisión en cuanto a la duración, la frecuencia y el nivel de presión acústica 15, 18, 19.
ve_content "> En un experimento representativo se muestra en la Figura 3, C57BL / 6 (B6) hembras se les permitió elegir entre BALB / c (BALB) USVs masculinos y ruido de fondo. Además, la Figura 4 muestra la elección de las hembras B6 y BALB entre reproducciones USV simultáneas desde un BALB y un macho B6, según ha informado en un estudio previo 14. Las características de USVs machos difieren entre B6 y BALB cepas 20. Como se muestra por estos resultados, el atractivo de USVs se puede evaluar con el presente Protocolo, en el que los sonidos se registran de un individuo vivo, acústicamente analizados, y se reproducen a otros individuos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Azabu. Todos los experimentos se llevaron a cabo en una cámara insonorizada.
1. Preparación Animal
- Machos para grabación
- Obtener ratones machos sexualmente maduros con experiencia en el apareamiento.
- Los sujetos femeninos
- Obtener ratones hembra virgen que han sido alojados con 2 a 5 compañeros de camada por jaula (generalmente 8 - 12 semanas de edad).
- Obtener frotis vaginal a diario para determinar la fase del ciclo estral antes de la prueba, según McLean 21. Se debe tener cuidado para minimizar la estimulación vaginal para evitar pseudopreñez.
- Tinción de los frotis con Giemsa, y determinar la fase del ciclo estral en base a la presencia o ausencia de leucocitos, células epiteliales cornificadas y células epiteliales nucleadas, de acuerdo con Nelson 22.
2. Dispositivos (Figura 1)
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Figura 1. Esquema de la Dos-elección Box Prueba y Dispositivos. Los ratones pueden acceder a salas A y B a través de las pequeñas puertas situadas entre ellos y la zona neutral. La caja de dos elección y dos emisores de ultrasonido se coloca en el suelo de una cámara insonorizada. El micrófono está suspendido dentro de la cámara a prueba de sonido. Abreviatura:. PC, computadora personal Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Para Grabación
- Conecte un micrófono de condensador de ultrasonidos a un PC mediante un convertidor de USB A / D.
- Ajuste el nivel de ganancia del convertidor A / D a "7".
- Datos acústicos de Registros en archivos de formato de 16 bits con una frecuencia de muestreo de 400 kHz utilizando el software de captura de audio.
- Para la reproducción
- Conecte un convertidor D / A a la PC usandouna interfaz USB.
- Conecte dos amplificadores al convertidor D / A través de un atenuador. (Este último dispositivo sirve para evitar la sobrecarga.)
- Conectar un emisor de ultrasonido para cada amplificador.
3. USV grabación
- Coloque un ratón macho en una pequeña (17 x 10 x 11 cm) o (21 x 14 x 13 cm) jaula de tamaño mediano con un agujero de 6 cm de diámetro en la pared lateral y el agujero cubierto con una malla de alambre de 0,5 cm. Cuando se utiliza una jaula de tamaño mediano, la construcción de una partición a través del centro de la jaula para reducir el área.
- No use ropa de cama en la jaula para evitar ruidos susurrantes que podrían contaminar las grabaciones.
- Coloque un micrófono al lado de la malla.
- Comience monitoreo vocalización ultrasónica con la configuración de la grabación se muestra en el paso 2.1.
- Colocar un ratón hembra sexualmente maduros, ya sea en metaestro o diestro en la jaula con el ratón macho.
- USVs récord para 3-5 min.
4. Test Box
- Construir la caja de prueba utilizando tablero de acrílico (Figura 1).
Nota: La caja de prueba (35 x 20 y 20 x cm de alto) se divide en tres compartimentos: una zona neutra (15 x 20 cm), y salas A y B (20 x 10 cm, cada uno). Habitaciones A y B tienen cada uno un agujero de 4 cm de diámetro que está cubierto con una malla de alambre de 0,5 cm. Los agujeros de malla y están situados en cada extremo de habitaciones A y B. Hacer puertas (5 x 5 cm cada uno) entre la zona neutral y habitaciones A y B. - Para evitar la pérdida de sonido aislar cada emisor de ultrasonido, excepto por el lado orientado hacia la malla, usando placas de caucho, sellándolos a la caja alrededor del perímetro de cada malla.
- Lugar sellos de plomo en ambos lados de la pared entre las habitaciones A y B para el aislamiento acústico.
5. Preparación para la reproducción de sonido
- Creación de sonidos de reproducción
- Captura de un segmento de 20 segundos de USV del archivo grabado utilizando el software de edición de audio digital.
- Seleccione y captar el fondo sinise (0,35 segundos) desde el archivo segmento sec USV 20. Cree un archivo de ruido de fondo 20 seg repitiendo el segmento de ruido.
- Para reproducir los dos archivos de sonido simultáneamente, exportarlos como un solo archivo de sonido estéreo, con un archivo de la "oreja izquierda" y el otro archivo para el "oído derecho."
- Filtra los archivos de sonido utilizando como filtro de paso alto con un corte de 40 kHz.
- Reduzca el ruido con la función de reducción de ruido en el software de post-procesamiento. Seleccione y capturar un segmento del archivo que contiene USVs como el perfil de reducción de ruido, y ejecutar la reducción de ruido con el nivel 40.
- Calibración de los sonidos de reproducción
- Asegúrese de que el espacio entre los emisores de ultrasonido y el micrófono es de 10 cm.
- Para calibrar los niveles de presión de sonido de los emisores de ultrasonido, realizar monitoreo ultrasónica usando la configuración descrita en el paso 2.1. Medir el nivel de presión de sonido por el micrófono en decibelios (dB).
- Using el atenuador y los amplificadores, ajustar el volumen de los USVs generadas por los emisores de ultrasonido para el mismo nivel de presión de sonido como los USVs masculinos registrado en el paso 3.
- Al utilizar los dos emisores de ultrasonidos y un archivo de sonido compuesto por USVs y el ruido de fondo, confirmar que los dos emisores de ultrasonidos presentan el mismo nivel de presión de sonido con un sonido de calibración (por ejemplo, un tono puro de 75 kHz) antes de realizar la prueba de comportamiento.
- Al reproducir un archivo de sonido compuesta de dos corrientes de USVs, ajustar los dos niveles de presión de sonido generado al mismo nivel, antes de la prueba.
6. Prueba de dos elección
- Coloque los emisores de ultrasonido detrás de las mallas de la caja de prueba.
- Cerrar las puertas a las salas A y B con un tablero de acrílico, y habituarse al sujeto femenino a la zona neutral durante 30 min. Cubra la caja con tablero de acrílico para evitar que el ratón puede escapar.
- Inicie la grabación de vídeo con un CCCámara D montado en la caja. La cámara (no mostrada en la figura 1) cubre el área de todos los tres compartimientos.
- Retire la puerta y la cubierta a bordo y permitir a la hembra para explorar libremente la caja de prueba, incluyendo las zonas de sonido.
- Una vez que la hembra ha investigado ambas mallas, y ha vuelto a la zona neutral, empezar a jugar un archivo de sonido de 20 segundos en varias ocasiones durante 5 o 10 minutos.
- Llevar a cabo el monitoreo del comportamiento durante 5 o 10 minutos.
- Para reducir señales olfativas deseadas depositado a partir de la materia anterior, limpiar las jaulas de ensayo entre los ensayos con etanol al 70%.
- Cambiar el lugar de emisores de ultrasonidos A y B al azar para evitar el efecto de sesgo lateral inherente hacia salas A o B.
7. Análisis estadísticos
- El uso de software evento puntuable del comportamiento, análisis de los siguientes parámetros: número total de entradas en cada habitación; duración total de la estancia en cada zona media; duración total de la estancia en cada zona de sonido; yduración total de búsqueda de cada malla en frente del emisor de ultrasonidos. Figura 1 ilustra lo que se entiende por "zona intermedia" y "zona de sonido."
Nota: En los casos en que el ratón se mantiene en la línea divisoria entre las dos zonas (Figura 1, línea discontinua) decidir la ubicación de la dirección de la cabeza. Cuando la cabeza se enfrenta al lado de la malla, se anotó como una estancia en la zona de sonido. - Para cada parámetro del comportamiento, comparar las respuestas de las habitaciones A y B mediante una prueba de rangos de Wilcoxon firmado-o T-pruebas pareadas con un nivel de significación de 0,05.
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Representative Results
Los USVs registran de una BALB-macho (161 sílabas por 20 sec), así como el ruido de fondo se usaron como la reproducción de sonidos en el experimento representativo se muestra en la Figura 3. En este experimento, se utilizaron 7 ratones B6 hembra a 9 semanas de edad . Para determinar la mejor duración de las pruebas de respuesta femenina para reproducir los sonidos, los parámetros de comportamiento se analizaron por separado para los primeros y últimos cinco min de la época total de la prueba 10 min.
En primer lugar, no hubo diferencia significativa en la duración total de estancia en habitaciones A o B durante el tiempo de investigación antes de la reproducción (Figura 3A), lo que demuestra que no hubo resultados bias.The lado también mostraron que no hubo diferencias entre el lado de ruido de fondo y el lado masculino-USV en el número de entradas de las habitaciones, el análisis de los primeros 5 minutos, los últimos 5 minutos, y el tiempo de prueba totales (Figura 3B). La figura 3C muestra segundos acumulativos de Duration de la estancia en cada habitación durante la reproducción (es decir, la duración total de la estancia en la zona media, y en la zona de sonido). Los sujetos pasaron un tiempo significativamente más largo en el lado macho BALB-USV que en el lado de ruido de fondo cuando se analiza la primera 5 min (p = 0,043), o el tiempo de prueba total (p = 0,043). No hubo diferencias significativas en estos parámetros cuando se analiza por último 5 min. No hubo diferencias significativas entre el lado de ruido de fondo y el lado macho-USVs en la zona media (Figura 3D). Sin embargo, las hembras B6 pasaron significativamente más tiempo en la zona de sonido y la búsqueda de la malla en el lado BALB masculino-USV, en comparación con el lado de ruido de fondo, al analizar la primera 5 min (zona de sonido, p = 0,018, Figura 3E; Mesh , p = 0,018, Figura 3F) o tiempo de prueba total de (zona de sonido, p = 0,028, Figura 3E; Mesh, p = 0,043, Figura 3F). Los resultados demuestran claramente que una hembra B6se acerca más a los varones-USV reproducidas que el ruido de fondo, sobre todo en los primeros 5 minutos.
Esta prueba de dos elección es útil comparar las características de USVs. En un estudio previo, se utilizó esta prueba para determinar USV preferencia de ratones hembra BALB B6 y para USVs de machos de estas cepas 11. Cuando se utiliza una combinación de reproducción de USVs de un B6 (133 sílabas por 20 seg) y un BALB (108 sílabas por 20 sec) macho, ratones hembra de cada una de estas cepas mostró ya buscar veces para los USVs de machos de la otra cepa de de su propia (Figura 4).
Figura 2. Medida de nivel de presión sonora (SPL) generada por el nc-Si Emisor como función de la frecuencia Un SPL casi constante de aproximadamente 80 -. Se observa 90 dB entre 40 y 160 kHz. Pow entrada de CAer es de 1,3 W en este caso. El emisor se colocó a una distancia de 20 mm desde un micrófono de condensador de alta frecuencia y alineada con su centro. Esta cifra ha sido modificado desde Kihara 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. B6 Respuesta Mujer al ruido de fondo y BALB masculino USVs. (A) La duración total de la estancia en las salas A y B durante el tiempo de la investigación antes de la reproducción. (B) Número de entradas de las habitaciones durante la reproducción. (C) Duración total de la estancia en las habitaciones. (D) Duración total de la estancia en la zona media . (E) Duración total de la estancia en la zona de sonido. (F) Duración total de búsquedas en las mallas. Las mediciones de cadaindividuo se dan en gráficos de puntos; barras horizontales en cada parcela indican la media; n = 7; * Indican diferencias significativas (p <0,05) entre el ruido de fondo y USVs masculinos para los parámetros analizados; Wilcoxon pruebas de rango con signo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Respuesta hembra a USVs de machos de una cepa diferente frente a la misma cepa. B6 (n = 6) y BALB (n = 10) hembras en diestro expuestos a la ropa de cama por hombres sucios antes de la prueba mostraron más largos tiempos de búsqueda de duración para el otros USVs deformación. Los valores mostrados son la media + error estándar; * Indican diferencias significativas (p <0,05); Pruebas de rangos con signo de Wilcoxon. Esta cifra ha sido modificado desde Asaba
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a JSP becarios a AA; por subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica en Áreas innovadoras para JSP Fellows (Nº 4501 y Nº 25132712) a los conocimientos tradicionales; y con una donación proyecto de investigación otorgado por la Universidad de Azabu. Figura 2 se reimprime de Kihara, T., Harada, T., y Koshida, fabricación y características de silicio nanocristalino inducidos térmicamente emisores de ultrasonido compatible con la oblea N.. En: Los sensores y actuadores A: físicas, volumen 125, Elsevier, p. 426, (2006), con permiso de Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soundproof chamber | Muromachi Kikai | ||
| Small cage | CLEA Japan | CL-0113-1 | |
| Middle cage | CLEA Japan | CL-0103-1 | |
| Ultrasound condenser microphones | Avisoft Bioacoustics | CM16/CMPA | |
| A/D converter | Avisoft Bioacoustics | UltraSoundGate116H | |
| Audio software | Avisoft Bioacoustics | RECORDER USGH | |
| Adobe Audition 3.0 / Audio editing software | Adobe Systems | Adobe Audition 3.0 | |
| Nc-Si emitter | Original | not commercially available but it is planned to be so in near future | |
| D/A converter | National Instruments | NI USB-6251 BNC | |
| Attenuator | Original | ||
| Amplifier | Yamatake | ||
| PC | Windows 7 professional | Intel® core i7-2600K CPU @ 3.4GHz, 8GB RAM, 64-bit operating system | |
| Event recorder Excel-macro / Event-scoring software | original | Programmed by Naoto Akagawa & Takeru Yamamoto | |
| CCD Camera | |||
| Rubber plates (made of elastomer resin) | Tokyo bouon | TI-75BK B4 | Cut them to the proper size http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3 |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 |
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