Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים

Published: September 17, 2015 doi: 10.3791/53076

Summary

שריר פפילרי חדרית עזב Murine יכול לשמש כדי לחקור התכווצות לב במבחנה. מאמר זה מתאר בפירוט את הבידוד ופרוטוקולי ניסוי ללמוד מאפייני התכווצות לב.

Abstract

שריר פפילרי מבודד מהלב עכבר בוגר יכול לשמש כדי לחקור התכווצות לב במהלך פיסיולוגיים / מצבים פתולוגיים שונים. ניתן להעריך את מאפייני ההתכווצות באופן עצמאי של השפעות חיצוניות כגון טונוס כלי דם או מעמד neurohumoral. הוא מתאר בין מדידות תא בודדות עם myocytes לב מבודד ובמחקרי vivo כמו אקו גישה מדעית. כך, הכנות שריר פפילרי לשמש כמודל מצוין ללמוד פיזיולוגיה / הפתופיזיולוגיה לב ויכול לשמש לחקירות כמו האפנון על ידי סוכנים תרופתיים או החקירה של מודלים של בעלי חיים מהונדסים. כאן, אנו מתארים שיטה של ​​בידוד שריר פפילרי הקדמי השמאלי עכברי לחקור התכווצות לב בהתקנת אמבטיה איברים. בניגוד להכנת רצועת שריר מבודד מקיר החדר, שריר פפילרי יכול להיות מוכן בטוטו מבלי לפגוע בשרירי tissuדואר קשה. התקנת האמבטיה האיבר מורכבת מכמה תאי אמבטיה איבר מצויד אלקטרודה, גז וטמפרטורה מבוקרת. שריר פפילרי המבודד קבוע בתא האמבטיה איבר וגירוי חשמלי. כוח העווית עורר נרשם באמצעות מתמר לחץ ופרמטרים כגון פרפור כוח משרעת ועווית קינטיקה מנותחות. ניתן לבצע פרוטוקולי ניסוי שונים כדי לחקור את סידן והתכווצות תדירות תלויה, כמו גם עקומות מנה-תגובה של סוכני התכווצות כמו קטכולאמינים או תרופות אחרות. בנוסף, תנאים פתולוגיים כמו איסכמיה החריפה יכולים להיות מדומים.

Introduction

החקירה של חלבונים כמו תעלות יונים המתייחסות לתפקידם התכווצות לב היא חיונית כדי לגלות pathomechanisms שונה ולהקים אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות לב, כגון איסכמיה ואי ספיקת לב.

פונקצית התכווצות של שריר לב יונקים ידוע להיות מווסת על ידי ערוצים שונים יון, מובילים וחלבונים אחרים. פוטנציאל פעולה עורר הפעלה של מתח L-סוג sarcolemmal תלוי Ca 2 + ערוצים מובילים לזרם Ca 2 + מהחלל תאי ולאחר מכן לCa 2 + -induced שחרור Ca 2 + (CICR) 1, אשר מפעיל התכווצות סלולרית 2. Ca 2 + -signaling משחק תפקיד מרכזי בהתכווצות והסתגלות לב ללחץ פיסיולוגי או פתולוגי. קטכולאמינים להפעיל רצפטורים β-adrenergic לב, ובכך מגרה cyclase adenylyl (AC) שמסנתז cAMP. שהופעל, protein kinase (PKA) phosphorylates חלבונים תאיים וקרום שונים הקשורים כמו L-סוג 2 + ערוצי Ca, phospholamban וקולטנים ryanodine וכתוצאה מכך השינוי של Ca 2 + ארעיים ו1,3,4 התכווצות לב. המחנה הוא מושפל על ידי phosphodiesterase (PDE). הפעלה של קולטנים מצמידים Gs האחרים מאשר β-adrenoceptors גם מובילה להצטברות של cAMP.

טכניקת מדידות התכווצות בשריר של חדר מבודד רצועות מבוססת היטב למיני יונקים גדולים 5-8. בהתבסס על האפשרות של גן המיקוד בעכברים חשוב להקים שיטות לנתח פיזיולוגיה של לב עכברית. עם זאת, הנתונים קיימים על המאפיינים הפיסיולוגיים של הכנות שריר מבודדות בעכברים משתנים בהתאם לתנאי ניסוי 9-12.

השיטה המתוארת משמשת כדי לנתח התכווצות לב של שריר פפילרי מראש עזב חדריתparations במבחנה. חקירה של התכווצות לב מבוצעת בהיעדר השפעות שינוי התכווצות לב in vivo, כמו לחץ דם, גירוי neurohumoral ולחץ פיזי או חילוף חומרים. שיעור הפועם של הכנת שריר קבלנות יכול להיות מוגדר בקפדנות ושינה באופן שרירותי. עווית כוח ניתן לנתח בהקשר של גירויים ספציפיים כגון ריכוז סידן, להכות בתדירות או בטמפרטורה. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור רכיבי מסלול איתות שונים ולהשוות את ביצועי לב של דגמי עכבר מהונדסים גנטי על ידי שליטה תנאי ניסוי שהוזכרו לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השלבים הבסיסיים של הליך הבידוד מוצגות באיור 1 כל השלבים מתוארים בפירוט בפרוטוקול הבא.. בידוד שריר פפילרי, הרכבה בתא אמבטיה איבר, רכישה והניתוח מתבצעת בלוח זמנים ברציפות וחובה.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לחקיקה גרמנית בהגנה על בעלי החיים ואושרו על ידי דירקטוריון האתיקה הסקירה של אוניברסיטת היידלברג.

1. הכנת מכשור

  1. להתכווצות מדידות להשתמש התקנת אמבטיה איבר מרובה חדרים. רכיבים של vivo לשעבר התקנת אמבטיה איבר התכווצות מוצגים באיור 2.
    הערה: כדי למזער את כמות הזמן בין ההכנה של שריר פפילרי ותחילת פרוטוקול הניסוי, להגדיר את הציוד ולהכין מאגרים לפני provid איסוף tissue.This הניסיוניes את הכמות הגדולה ביותר של זמן שהרקמה נשארת קיימא לבצע ניסויים.
  2. התחל את ציוד מחשבים ורכישת נתונים. הפעל חום אמבטיה איבר (מראש ל 32 מעלות צלזיוס) ולאפשר ליחידות טמפרטורה קבועה מראש.
  3. הכן את ציוד הרכישה. התחל הקלטת נתונים כאמור בתוכנה ידנית.
  4. בדקו ולנהל כיול (במידת צורך) בכל ערוץ ואפס כל הערוצים כדי לתקנן את האות החשמלית שסופקה ממתמר כוח בהתאמה (הקשורים לערוץ ש) לכוח 2-ז מסופק על ידי משקל מוסמך.
  5. הפעל אספקת גז (95% O 2/5% CO 2) לתאי אמבטיה איברים. ברציפות בגז כל התאים במהלך מדידות הפרוטוקול כולו.

2. הכנת חוצצים ופתרונות פיסיולוגיים

  1. הכן פתרון חיץ קרבס-Henseleit מנת להגיע לריכוזים סופיים של 119 מ"מ NaCl; 25 מ"מ NaHCO 3; 4.6 מ"מ KCl; גלוקוז 11mm; 1 מ"מ Na-pyruvate; 1.5 מ"מ CaCl 2; 1.64 מ"מ MgSO 4; 1.18 מ"מ KH 2 PO 4 ולהתאים את ה- pH 7.4 (ראה פתרון פיזיולוגי טבלת 1).
  2. הכן פתרון חיץ קרבס-Henseleit נפרד לשימוש במהלך בידוד כמתואר בשלב 2.1 עם monoxime נוסף 30mm 2,3-Butanedione (BDM) ו -50 IE הפרין / מיליליטר. פתרון מגניב ל- C ° 4 (ראה פתרון הכנת טבלת 1). לסימולציה איסכמיה, להכין איסכמיה-פתרון כפי שמתואר בטבלה 1.
  3. לפרוטוקול של 2 + Ca - ההתכווצות תלויה, להוסיף Ca 2 + לפתרון חיץ קרבס-Henseleit לריכוז סופי מבוקש.
    הערה: להכין פתרונות אלה ישירות לפני השימוש בו וGass עם carbogen להימנע משקעים של Calciumcarbonate. פתרון Prewarm 32 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. הכנת תבשיל Tube וDissection בגז המשמש בpapillary כריתת הנוהל

  1. חבר גז רךלשיר צינור (מ"מ קוטר 2-4 חיצוני) לחיבור הגז (100% חמצן, carbogen לחלופין) עם המומחה עובד.
  2. צור טבעת סגורה של צינור הגזים ההולם בתוך הצלחת לנתיחה. לנקב את צינור הגזים מספר פעמים שמבעבעות רציף מובטחת. צינור בגז זה יכול לשמש מספר פעמים.
  3. הכן צלחת לנתיחה עם אלסטומר סיליקון בתחתית (0.5 סנטימטרים עובי), כך שיכולות להיות תקועות סיכות לתוכו. מנה זו יכולה לשמש מספר פעמים.

4. בידוד של שרירים השמאל הקדמי papillary מעכברים

הערה: לפני שמתחילה את הבידוד של שריר פפילרי, לבדוק שקווי הגז ברורים של חסימות.

  1. הכן התקנת אמבטיה איבר כאמור בסעיף הפרוטוקול 1-3 לפני שמתחיל בהכנה של שרירי papillary. הכן את כל הפתרונות ביום של הניסוי.
  2. להקריב את העכבר (כ 8-12 שבועות) על ידי accordi נקע בצוואר הרחםng לעבודת מומחה והנחיות מוסדיות.
  3. תקן את החיה בעמדת גב כפות רגליו קדמיות על ידי תיקון ואחורי כפות על לוח לנתיחה, לפתוח את בית החזה לרוחב משני הצדדים על ידי חיתוך דרך הצלעות במספריים חדים עצם, ואז לחתוך את הסרעפת עם חתך רוחבי. הסר את קרום הלב. עכשיו הלב ואב העורקים נגישים.
  4. לתקן את הלב עם מלקחיים בוטים על truncus כלי הדם הקרוב ללב ולהפריד את הלב במהירות עם מספריים מהריאות והרקמות שמסביב.
  5. העבר את הלב הפועם בצלחת פטרי המלא בפתרון הכנה מקוררת בגז עם חמצן (שלב 2.2). לאפשר ללב להכות ולעורר התכווצויות לב ברכות באמצעות נגיעה בשיא של הלב עם מלקחיים.
  6. ברגע הלב הוא exsanguinous לגמרי, להעביר אותו לצלחת לנתיחה מלאה בפתרון מקורר הכנה (שלב 2.2) וגז עם O 2. מהצעד הזה על שימוש סטראו.
  7. לתקן את חימוםרט בסיכה קטנה בחדר ממני, כך שהלב הוא ראה מגב (חדר ממני ממוקם בצד ימין ממבטו של המפעיל).
  8. מספריים מייקר שימוש להפריד שני הפרוזדורים ברמה בין העליות והחדרים, לחתוך חיבור רקמה מחדרי הלב וזורקים. לבצע חתך דרך קיר החדר מAV-שסתום הרמה-לשיא של הלב להימנע מכל לחץ מכאני.
  9. פתח את החדר ולתקן את הקיר החופשי בצד השמאל עם מלקחיים, ובכך שיש להסתכל בשני שרירי papillary חדר שמאלי.
  10. לחתוך מעט מרוחב רקמת חדרית בשני הצדדים של שריר פפילרי הקדמי השמאלי שימור חלק מהמפרש מסתמית על הכנת שריר פפילרי ולהימנע מלגעת או מתיחת שריר פפילרי ככל האפשר. לנתח את קיר רקמת חדרית שנותרה משריר פפילרי.
  11. צרף חוטי משי (7/0, 0.5 מדד) בשני הצדדים של הכנת שריר פפילרי aration, אחד על המפרש מסתמית ואחד בחלק השרירי. תקן את ההכנה בתא האמבטיה איבר מלא בפתרון אמבטיה איבר וגז עם carbogen, כמו טמפרטורת 32 מעלות צלזיוס הוא הציעה.

5. איזון וגירוי של שריר פפילרי

  1. לעורר את הכנת שריר פפילרי עם פולסים מלבניים (משך 2 ms והנוכחי של 100 מילי-אמפר) בתדירות גירוי של 1 הרץ מייד לאחר הקיבוע באמבטיה האיברים.
  2. ודא שינוי תכוף של פתרון האמבטיה איבר, או על ידי שינוי רציף או על ידי שינוי תכוף במדריך (כל 5 דקות) על פי ההגדרה של סוג האמבטיה איבר בשימוש.
  3. בהדרגה להגדיל את היומרה עד כוח עווית מקסימאלי בהגיעה. הוא הגיע כוח עווית מקסימאלי כאשר הגידול של היומרה לא אחרי הגדלת נוספת בכוח העווית.
  4. לאחר 45-60 דקות של איזון, להתחיל פרוטוקול הניסוי.

"Jove_title"> 6. הציע פרוטוקולי ניסוי למדידת התכווצות

הערה: פרוטוקול הניסוי המפורט להלן כולל תמרונים סטנדרטיים לאפיין התכווצות לב בתנאים פיסיולוגיים וpathophysiological. בסעיף הנציג אנו מתארים פרוטוקולים אלה בפירוט גם מראה תוצאות נציג (ראה גם טבלה 2).

  1. הקלטה וניתוח של פרוטוקולי הניסוי
    1. להקלטה, להשתמש בתוכנה מתאימה עם רזולוציה נאותה זמנית (1kHz ≥ שיעור רכישה).
    2. ניתוח פרמטרים כוללים משרעת כוח העווית (גובה), זמן שיא מתח (TTP) וזמן המחצית מקסימאלי הרפיה (R 50 / TFall, בהתאמה) כאמור בתוכנה (כמו בדוגמה של תרשים 5.5 של ADInstruments, ראה איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול של כתב היד הזה למדידות התכווצות של שריר הכנות מבודדות עכברית פפילרי מכוון לתנאים אופטימליים כדי להשיג תוצאות ניסוי לשחזור בתנאים פיסיולוגיים. כדי להגדיר תנאי ניסוי אופטימליים ביצענו ניסויי טייס משתנים טמפרטורת אמבטיה איבר וריכוז סידן תאי (ראה גם 12). הפרוטוקול המתואר כאן בוצע עם ריכוז תאי סיד של 1.5 מ"מ וטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.

תכונות התכווצות בסל

לאפיין תכונות התכווצות בסיסיות, פרמטרים לכוח העווית משרעת, עווית שיעור, זמן שיא (מוגדר כזמן הנדרש כדי להגיע לכוח התכווצות מקסימאלי החל מ -5% בסל) והרפיה 50 זמן (זמן הרפיה מחצית מקסימאלי; מוגדר כזמן הנדרש ל להגיע מחצית כוח הרפיה) משמש בפרוטוקול זה. עקבות נציג TWמגרד והניתוח של פרמטרים אלה הם באיור 3A-B.

התכווצות סידן תלוי

ריכוז סידן תאי מכריע קובע צימוד עירור-התכווצות לב ועל ידי שינוי פרמטר זה, רגישות סידן של מנגנון התכווצות שריר לב בניתן להעריך. כפי שניתן לראות באיור 3 ג הגדלת של תוצאות ריכוז סידן תאיים בארעיים סידן שינה ולאחר מכן בדור כוח העווית שונה. סידן-הריכוז של הפתרון תאי מוגבר צעד-אחר-צעד (כלומר, בין 1.5 ל7mm). על ידי יישום פרוטוקול זה, ניתן להעריך הומאוסטזיס סידן בנוגע להתכווצות סידן תלוי במנגנון ההתכווצות. בהתקנת האמבטיה איבר המשמשת בכתב היד הזה, השינוי של ריכוז סידן תאי בוצע על ידי שינוי solut האמבטיה האיבריון מוביל באופן ידני להפרעה קצרה של צעדה ולאחר מכן להגברת postrest מלאכותית (ראה הגברת כוח לאחר הפסקה שאינה צעדה).

הגברת כוח לאחר הפסקה שאינה צעדה (PRP)

בסופו של סידן מחזור התכווצות הוא מוחרם לרשתית sarcoplasmatic (SR) בעיקר על ידי משאבת סידן ATP-תלוי (SERCA, Sarco-endoplasmic reticulum סידן-ATPase), ובכך להקטין את ריכוז סידן cytosolic במהלך דיאסטולה. אם מרווח הזמן בין שני צירים מוגדל, יותר סידן ניתן לשאוב בחזרה לתוך SR ולאחר מכן יותר סידן יכול להיות שפורסם במהלך העירור הבא. פרוטוקול postrest-ההגברה (PRP) מתאר שינויים של משרעת כוח העווית לאחר גירוי קודם עם תקופת מנוחה של משך מוגדר. באדם, חולדה, כמו גם ברקמת לב עכברית, הגדלת כוח העווית הוצגה 10,12-14,16 ( 13,14,16,17 אנושיים ועכברוש. פרוטוקול זה משמש כדי להעריך את התפקוד של הצטברות סידן הדיאסטולי בחנויות תאיות 4,15.

התכווצות תדר תלוי (FFR)

ביחס חיל-תדר מתאר את המתאם בין שיעור מכות וכוח התכווצות עווית (השפעת Bowditch) 18. ביחס תדירות force- שונה באופן משמעותי בין מיני יונקים ותנאי ניסוי 19. בעכברים, מתאם מסוים בין שיעור מכות וכוח ההתכווצות הוצג. בגיל 32 מעלות צלזיוס, FFR השלילי ראשוני בין שיעורי גירוי של 0.1-1 הרץ הוצג, ואילו FFR הוצג להיות חיובי בטווח של 1-4 הרץ של גירוי 9-12 (איור 3E).

בmyoca נכשלrdium מתאם שלילי בין שיעור מכות והתכווצות מתוארת 20,21. בכתב היד הזה, צעדה בתדר הסטנדרטי (1 הרץ) מופחת ל0.1 הרץ ומתחיל משם, צעדה בתדר עולה בהדרגה ל 5 הרץ (0.2; 0.5; 1; 2; 3; 4; 5 הרץ).

גירוי β-adrenergic

קטכולאמינים כמו אדרנלין ונוראדרנלין הם הורמונים המשתחררים בתנאים (patho-) פיסיולוגיים לחץ ויסות כוח התכווצות של הלב על ידי הפעלה של β-adrenoceptors. יישום iatrogenic של קטכולאמינים משחק תפקיד בולט בטיפול קליני בחולים עם אי ספיקת לב אקוטית כדי לשפר inotropy לב באופן זמני. השפעה זו ניתן גם לראות ונחקרו במחקרים במבחנה. כאגוניסט β-של adrenoceptors, Isoprenaline מגביר כוח עווית התכווצות. בvivo, עלייה בתדירות להכות גם מתרחש (השפעה חיובית האינוטרופית), שבנוסף מודולציה תגובת ההתכווצות (השפעת Bowditch, ראה גם פרוטוקול FFR שתואר לעיל). שימוש בשיטה שתוארה כאן, ההשפעה האינוטרופית של Isoprenaline יכולה להיחקר בקצב קבוע בלי מכות שהשפעת chronotropic (איור 3F). הגירוי של β-adrenoceptors גם יכול להיות מושגת על ידי הורמונים אחרים כגון היסטמין. ברקמת חדרית עכברית, יישום של תוצאות היסטמין בתגובת biphasic המכילה אפקט האינוטרופית חיובי ראשוני, אבל עם ירידה זמנית בכוח עווית כפי שמוצגת באיור 3G. מהסיבה שנראית פרשנות של נתונים שנמדדו על ידי יישום של היסטמין להיות קשה; במיוחד לרצפטור ההפעלה הבסיסית בעכברים לא נפתרה לחלוטין.

תנאי איסכמי

איסכמיה לבבית חריפה מוגדרת כהגבלה קריטית של זרימת דם המובילה לundersupply של רקמת הלב בחמצן וחומרים מזינים וכתוצאה מכך האובדן של התכווצות, פיתוח של התכווצות איסכמי ומוות של תאים. כדי לדמות איסכמיה במבחנה, שרירים חשופים למשך 30 דקות לglucose- ופתרון תאי ללא פירובט מבעבע עם 95% N CO 2/5% 2. עם גישת שדלדול של ה- ATP בשריר הלב צריך להיות מושרה. בתוך לאחר תחילת איסכמיה-הסימולציה כמה דקות, ירידה של כוח העווית מתרחשת עם הופעתו של התכווצות איסכמי בתמונה כעלייה ספונטנית במתח preload (איור 3H).

טבלת 1

טבלה 1: רכיבים וריכוזים של פתרונות חיץ בשימוש.

טבלה 2 />

טבלה 2: רשימה של פרוטוקולי ניסוי הציעו לחקור התכווצות לב בהכנות שריר פפילרי מבודדות.

איור 1
איור 1. צעדים עיקריים של הכנת שריר פפילרי. Dissection () של שני הפרוזדורים. צפה ב( ב ') על שריר פפילרי הקדמי של החדר השמאלי. Dissection (C) של שריר פפילרי מקיר החדר. קובץ מצורף של שני חוטי משי לפני הקיבעון בתא האמבטיה איבר (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

6fig2.jpg "/>
איור 2. התקנת אמבטיה איברים. (א) הגדרה סכמטי של התקנת האמבטיה איברים. תאי אמבטיה איבר מעיל מים מצוידים בפריץ זכוכית אוורור מספקים בקרת טמפרטורה יציבה. כדי ליצור פולסים מרובע גל אלקטרודות שדה מחוברות לתמיכה ברקמה. מתמר כוח החושים ההתכווצות של השריר ובכך מגביר את האות שנוצרה. האיתותים מסוננת ומועברות בחזרה למחשב על ידי ממיר A / D. האות היא דיגיטלית אז וניתן לשמור עבור ניתוחים מאוחר יותר. תמונה (ב) להכנת שריר פפילרי אחת קבועה בתא האמבטיה איברים מהתקנת האמבטיה איבר (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

PG "/>
איור 3. נציגי תוצאות של מדידות התכווצות של שרירי papillary קדמי השמאלי עכברי. ניתוח נציג של כוח העווית משרעת (), זמן שיא מתח (TTP) וזמן המחצית מקסימאלי הרפיה (R 50) של עווית אחת. הקלטות נציג של פרכוסי מגורה של הכנות שריר פפילרי עכברית תחת גירוי בסיסי עם שיעור מכות של 1 הרץ (ב '), במהלך הגדלת ריכוזי סידן תאי (C), במהלך מרווחי זמן מוגדר מנוחה (הגברת פוסט שאר, PRP) (ד), או שונה שיעורי גירוי (ביחס כוח-תדר, FFR) (E) ואחרי יישום של ריכוזים הולכים וגדל של Isoprenaline- (F) או היסטמין-יישום (G). הקלטת נציג של פרכוסים וpreload מגורה במהלך איסכמיה גירוי (H).S: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ניתוח של פרמטרים התכווצות. כדי לאפיין פונקצית התכווצות, פרמטרים כוללים משרעת כוח העווית (גובה), זמן שיא מתח (TTP) וזמן רגיעה המחצית מקסימלי (R 50 / TFall, בהתאמה) מנותחים בפרוטוקול זה באמצעות התוכנה תרשים תכנית 5.5 (ADInstruments). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בכתב יד זה אנו מתארים שיטה לחקור התכווצות של שריר פפילרי עכברי במבחנה אשר ניתן להשתמש בי לענות על כמה שאלות מדעיות הקשורים לפיזיולוגיה והפתולוגיה לב בעכברים, כמו גם לתמוך בניתוח של קווים מהונדסים והגילוי של גישות תרופות חדשות לטיפול בבעיות בתפקוד לב. אנו מדגימים את השימוש בשיטה זו כדי להעריך את המאפיינים פיסיולוגיים, פתולוגי ותרופתיים של התכווצות שריר לב (ראה איור 3). יישומים נוספים שלא מודגמים כאן כוללים הערכה של מסלולים תאיים באמצעות סוכנים תרופתיים שונים (ראה גם 12).

מחלות לב כגון מחלת לב איסכמית ואי ספיקת לב להציג בעיה קלינית דגול ותישאר הגורם המוביל לתמותה ותחלואה בעולם 22. לחלבונים רבים הביעו בלב, את תפקידם להתכווצות לב הוא still הבין כהלכה או שלא למד עד עכשיו. מדידת התכווצות שרירים בפפילרי מבודד מדגימה גישה משמעותית ותקפה ללמוד התכווצות לב במבחנה במודלים של עכברים.

למרות שהשיטה היא אפשרית מבחינה טכנית ומראה שחזור טוב, יש כמה שלבים קריטיים דרושים כדי להבטיח את הצלחתה: ראשית, לאחר שבודד הלב, להבטיח פתרון חופשי דם במהלך הליך ההכנה כדי להיות מסוגל לעבוד כמו שצריך (ויזואליזציה). עוד צעד קריטי הוא שהכנת רקמה מבוצעת בזהירות על מנת להבטיח יכולת קיום בהימנעות מכל נגיעה או מתיחה של שריר פפילרי. כפי שתואר בסעיף השיטה מנסה לשמור את המפרש מסתמית המחובר לשריר פפילרי כדי להבטיח מצורף ללא בעיות של חוט המשי. לאחר הקיבוע של ההכנה בתא האמבטיה האיבר, לשנות את פתרון האמבטיה איבר מספר פעמים במהלך דקות הראשונות כדי לשטוף את BDM. Increase היומרה של ההכנה מעט ובהדרגה עד אין עלייה נוספת בכוח העווית מתרחשת. יש כמה קריטריוני הדרה להערכת הפרוטוקולים בודדים כגון פעימות בקצב לא סדירות ועלייה ספונטנית של היומרה כסימן לתנאי איסכמי. כמה פרוטוקולי ניסוי כגון הגברת postrest ויחס כוח-תדירות ניתן לבצע עם אותו מדגם ההכנה, ואילו מדגם הכנה חדש אמור לשמש לניתוח תופעות בתיווך בסמים על התכווצות. פרוטוקול ההכנה מותאם לבודד את שריר פפילרי הקדמי השמאלי. התאמת הפרוטוקול, גם השרירים האחוריים יכולים לשמש לשיטה זו של מדידות התכווצות.

שיטה זו של מדידת שריר פפילרי המבודדת מספקת מידע שונים על התכווצות סידן, לטמפרטורה ותדירות תלויה, כמו גם על תגובת ההתכווצות לאחר החלת סוכנים תרופתיים או ה- SIMulation של מצבים פתולוגיים. עם זאת, הפרשנות והניפוח של תוצאות אלו צריכה להיות מטופל בזהירות מדעית. השיטה המתוארת היא מודל במבחנה של שריר לב, מנותק מהסביבה הרגילה שלו והעצבוב עצבי. לכן, תנאי הניסוי הם לא פיסיולוגיים והתוצאות שהתקבלו בפרוטוקול זה לא ניתן להעביר ללא פרשנות מעמיקה למצב בvivo. לדוגמא, השיטה אינה לוקחת בחשבון את השינויים בלחץ דם, הורמונים או שליטה עצבית חיצונית. האספקה ​​של תוספי חמצן וחילוף חומרים להכנה באמבטיה האיבר מוגבלת על ידי דיפוזיה. אספקה ​​מספקת של תוספי חמצן וחילוף חומרים תוביל לתנאי איסכמי ותוצאות ניסוי המשך לא חוקיות. כדי להימנע מכך, תנאי הניסוי צריכים להיות אופטימליים, במיוחד בנוגע לחמצון, ריכוז של סידן וטמפרטורה של פתרון האמבטיה איברים.עם תנאי הניסוי של הפרוטוקול מתואר כאן, יכולות להיות מוענק תוצאות תקפות.

בכתב יד זה שיטה של ​​הדמיית תנאים כמו איסכמיה-מתוארת. בנוסף לסימולציה של היפוקסיה, כל התוספים האנרגטיים של פתרון האמבטיה איבר מדולדלים היו לחקות את מדינת איסכמי in vivo טובה ככל האפשר. בניגוד להיפוקסיה, שהראה כי הדלדול בו זמנית של אספקת חמצן והאנרגיה מוביל לשינויים בארעיים סידן דומים לשינויים ראו in vivo 23.

ההליך המתואר לבידוד של שריר פפילרי עכבר יכול להיות מותאם למינים אחרים, למשל, חולדה. עם זאת תנאים אופטימליים של התקנת האמבטיה האיבר יכולים להשתנות בין מודלים של בעלי חיים שונים ויכולים להיות מותאם. פרמטרים שייתכן שיהיה צורך הסתגלות הם הטמפרטורה וריכוז סידן מהפתרון הפיזיולוגי.

בsummary, שיטת התכווצות זו מספקת גישה חזקה מאוד להעריך פיזיולוגיה לב, הפתופיזיולוגיה ופרמקולוגיה. כאשר משתמש בו כראוי, הוא מספק את היכולת ללמוד התכווצות לב בסביבה מבודדת אך מבוקרת היטב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen", FR 1,638 / 1-2) ועל ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם, חלק מהמרכזים הגרמנים לחקר הבריאות , שהוא (משרד הגרמני לחינוך ומחקר) BMBF יוזמה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Glucose Sigma-Aldrich D9434 
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280 
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 223506
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P 5655
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879 Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich I5627 Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml ratiopharm PZN 3874685
Histamine dihydrochloride Sigma-Aldrich H7250 Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
  2. Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
  3. Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
  4. Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
  5. Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
  6. Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
  7. Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
  8. Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
  9. Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
  10. Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
  11. Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
  12. Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
  13. Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
  14. Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
  15. Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
  16. Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
  17. Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
  18. Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
  19. Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
  20. Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
  21. Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
  22. Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
  23. Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).

Tags

רפואה גיליון 103 שריר פפילרי התכווצות לב עכבר איתות SS-אדרנרגיים איסכמיה
מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uhl, S., Freichel, M., Mathar, I.More

Uhl, S., Freichel, M., Mathar, I. Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice. J. Vis. Exp. (103), e53076, doi:10.3791/53076 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter