Abstract
מיקרוסקופיה Intravital היא שיטה שיכול לשמש כדי לחקור תהליכים שונים באזורים שונים וכלי בבעלי חיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר. זה יכול להתבצע בפרק זמן קצר עם תוצאות לשחזור מראים אינטראקציות יקוציט-האנדותל in vivo. אנו מתארים הגדרה דלקתית לאחר אתגר LPS של האנדותל. אבל במודל זה ניתן להחיל סוגים רבים ושונים של מצבים דלקתיים, כמו חיידקים, כימי או ביולוגי ולחקור את הממשל של תרופות וההשפעות הישירות שלהם על בעלי החיים החיים והשפעתה על גיוס לויקוציטים. פרוטוקול זה יושם בהצלחה למספר הטיפולים השונים של עכברים והשפעתם על תגובה דלקתית בכלי. במסמך זה, אנו מתארים את ההדמיה של לויקוציטים וטסיות דם על ידי fluorescently תיוג אלה עם rhodamine 6G. בנוסף, כל הדמיה ספציפית יכולה להיות PErformed באמצעות מולקולות שכותרתו fluorescently ממוקדות.
Introduction
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה פשוטה של מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר בחיים עכברים לתצפית ישירה של אינטראקציות יקוציט-האנדותל ויקוציט-טסיות בתנאים דלקתיים.
מיקרוסקופיה Intravital פותחה כדי לחקור אינטראקציות יקוציט-האנדותל in vivo בתנאים דלקתיים 1,2, שאינו טריוויאלי אבל חשוב להבנת גיוס לויקוציטים דלקתי ותפקוד. השיטה שאנו מתארים בפרוטוקול זה פותחה על בסיס פרסומים שפורסמו בעבר. דומה להדמית התאגדות טסיות דם בפקיק גובר 3 ובמקביל למה שפורסם קודם לכן 4, וריד לפדר exteriorized נבחן על ידי מיקרוסקופ אור מועברת. ישנם דגמים שונים של מיקרוסקופיה התוך החיוני כגון שריר Cremaster של חולדות 5 או כבד של עכבר וחולדות 6.
מיקרוסקופיה Intravital של וריד לפדר פותחה ויושמה במחקרים קודמים על ידי מספר קבוצות. השתמשנו בטכניקה זו כדי לצפות בהבדלים בגיוס לויקוציטים בין עכברים הפראיים סוג וhydroxylase1 tryptophane (Tph1) - / - עכברים, שהם לקויים של סרוטונין שאינו עצבי והשווה את הממצאים לעכברי טסיות הדם שסרוטונין היה מדולדל פרמקולוגית על ידי לטווח ארוך פלואוקסטין מעכב יישום ספיגה החוזרת של סרוטונין 7. יש לנו גם בחנו אינטראקציות יקוציט-האנדותל לאחר טיפול פלואוקסטין החריף 8.
בפרוטוקול זה אנו מתמקדים במיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר, כי מודל זה יכול להתבצע במהירות, ומאפשר מדידות תקפות של אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט. זה הרבה יותר מאתגר ובמיקרוסקופיה intravital של איברים אחרים, כגון עצמות, כבד, עור, או שרירים Cremaster זמן רב. המצבl המתואר כאן הוא אידיאלי להערכה לשחזור של אינטראקציה תאי תאים דלקתית לאחר challengeing אותו עם גירוי דלקתי, כגון זריקת intraperitoneal של lipopolysaccharide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לחוק הגרמני הגנה על בעלי חיים (TierSchG). העכברים שוכנו ויטופלו בהתאם לפרקטיקת חיה טובה כפי שהוגדר בFELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) וגוף רווחת בעלי החיים הלאומי GV-סולאס (www.gv-solas.de/index.html). ועדת הרווחה של בעלי החיים באוניברסיטה פרייבורג, כמו גם את הרשויות המקומיות (Regierungspräsidium פרייבורג) אישרו את כל הניסויים בבעלי החיים.
1. טיפול בבעלי חיים, הכנה ואינדוקציה של דלקת
- השתמש 4 - עכברי זכרים ישנים 6 שבוע עם טווח משקל של 16 - 20 גרם. הערה: אם העכברים מבוגרים או כבדים יותר הם מציגים שומן עודף סביב הספינה, המגביל את התצפית המיקרוסקופית.
- לעקר את כל הכלים ושולחן מיקרוסקופ לפני הניתוח.
- להזריק 20 מ"ג / קילוגרם LPS (lipopolysaccharide) intraperitoneally 4 שעות לפני במיקרוסקופ לעכבר החי לגרום inflamm חיידקיםני.
- Prewarm תמיסת מלח 0.9% בwaterbath על 37 מעלות צלזיוס לללחלח את תא הפלסטיק והרקמה לפדר.
- להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) ממש לפני הליך מיקרוסקופ. ניתן להשתמש בהרדמה אלטרנטיבית, למשל, 2% שאיפת isoflurane. לאשר הרדמה תקינה על ידי האובדן של תגובה לגירוי רפלקס (קמצוץ הבוהן או זנב עם לחץ חזק).
- לְהַשִׁיר שֵׂעַר הבטן באמצעות מכונת גילוח והסרת שיער רופף עם הגזה רוויה עם אתנול 70%.
- החל משחה וטרינר בעיניים של העכבר כדי למנוע יובש, ואילו בהרדמה.
2. ניתוח
- לעקר את הבטן באמצעות אתנול 70%. שיטה זו אינה שיטה סטרילית ויכולה להיות קטלני בסוף הניסוי.
- בצע laparotomy חציון: פתח את עור הבטן באמצעות מלקחיים קטנים, מעוגלים ומספריים קטנים. זהה את עליתכלי gastrical ולפתוח את הצפק באזור של alba Linea, כדי להגן על כלי הדם.
- החל כמה טיפות של תמיסת מלח prewarmed לתוך חלל הבטן כדי לשמור על הרקמה לחה.
- כדוריות דם לבנות וטסיות דם תווית fluorescently ידי הזרקת rhodamine 50 μl 6G (1 מ"ג / מיליליטר) רטרו-orbitally כפי שתואר לפני 9,10.
- Exteriorize לולאה של מקום זה ileumand בpetridish בקוטר של 10 סנטימטר ולוודא כדי לשמור על הרקמה לחה על ידי יישום 37 ° C prewarmed תמיסת מלח (0.9%) מכל רגע אחר.
3. מיקרוסקופית Intravital
- מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ולהביא את הווריד לפדר בקוטר של 200-300 מיקרומטר במרכז התצוגה. בחר כלי ללא שומן נראית לעין סביבה.
- אל תיגעו בכולים לפדר ובכך להימנע מגירוי האנדותל. ידית מעי הלולאה בזהירות.
- דמיינו אינטראקציות תא-אנדותל דםעם מיקרוסקופ הפוך או זקוף ומצלמה באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. שיא דם אינטראקציות תא-אנדותל דקות 1 ב 4 ורידים שונים לכל עכבר.
- להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר השלמת ניסויי הדמיה.
4. ניתוח
- לבצע את הניתוח במצב לא מקוון ועיוור לכל הפרמטרים. לבצע ניתוח באמצעות כל תוכנה מתאימה.
- לאשר את זרימת דם תנאים יציבים וinterindividually דומים בקולנוע-קליפים ברזולוציה גבוהה בזמן (במסגרת שיעור מקסימלי) התמקדו בתא זרימת דם intraluminal.
- לכמת את מספר כדוריות דם לבנות מתגלגלים. לכך למתוח קו אנכי דרך הווריד ולספור את כל לויקוציטים חציית הקו הזה בדקות 1.
- לקבוע מהירות מתגלגלת על ידי מדידת זמן יקוציט אחת צריך לעבור מרחק של 50 מיקרומטר תוך גלגול ביציבות על האנדותל. כדי לעשות זאת, לצייר שני קווים אנכיים במרחק של לא 50 מיקרומטרhrough הווריד.
- מדוד את זמן יקוציט נציג צריך לקבל מקו אחד לother.Calculate המהירות של כדוריות דם לבנות על ידי חלוקת 50 מיקרומטר באמצעות הזמן הדרוש (מיקרומטר / s).
- למדוד הידבקות לויקוציטים בשדה של 0.04 מ"מ 2. כדי לעשות זאת, לצייר ריבוע עם אורך הצד של 200 מיקרומטר לתוך הווריד.
- ספירת כדוריות דם לבנות החברה חסיד, שהוגדרו כלא תנועה גלויה למשך 30 שניות, תוך כיכר זו.
- לספור את מספר טסיות הדם קשור לויקוציטים אחד לכמת אינטראקציות טסיות-יקוציט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה של הגדרת הניסוי המתוארת בפרוטוקול זה מוצגת באיור 1. זה מראה עכבר עם מעי-לולאת exteriorized וכליו, שניתן לראות במיקרוסקופ intravital. איור 2 מראה מידה מסוימת של הפעלה בבעלי חיים שלא טופלו בשל ההליך עצמו. אבל אין כמעט מתגלגל איטי או הידבקות חברה של לויקוציטים בהשוואה לעכברים שטופלו-LPS. איור 2 מציג גם את התוצאות השונות של מיקרוסקופיה intravital בעכברי wildtype או שטופל בפלואוקסטין במשך 3 שבועות במי השתייה או עכברים שלא טופלו. איור 2a עד C צג התוצאות ללא כל אתגר דלקתי נוסף עם LPS, ואילו עכברים באיור 2F-H טופלו בLPS בנוסף. כאן אנו יכולים לראות מספרים גבוהים יותר של כדוריות דם לבנות מתגלגל וחסידים, ואילו מהירות גלגול ירדה לאחר אתגר LPS. עם הניסויים האלה אנחנו יכולים להראות שסרוטונין טסיות הדם הוא גrucial לצעדים הראשוניים של גיוס לויקוציטים בדלקת 7.
באיור 3, מיקרוסקופיה intravital בוצעה ללא אתגר LPS נוסף ורק לאחר טיפול אקוטי עם fluoxetine intraperitoneally 2 שעות לפני הניתוח. כאן אנו יכולים לראות מספרים גבוהים יותר של כדוריות דם לבנות חסיד בתקיפות ומהירויות גלגול נמוכות יותר בעכברים שטופל פלואוקסטין, המצביע על השפעה של טיפול פלואוקסטין החריף על אינטראקציות יקוציט-האנדותל 8.
באיור 4 אינטראקציות טסיות-יקוציט במהלך דלקת הצפק lipopolysaccharide מושרה הם דמיינו בתוך וריד. טסיות דם הם rosetting סביב לויקוציטים ומתחמים אלה אינטראקציה עם קיר הכלי.
איור 1. סקירה כללית של הגדרות הניסויית. (ב) מיקרוסקופ Intravital עם העכבר הניח (חץ אדום) מתחת למטרה (החץ השחור). מקור אור (חץ שחור) ומצלמה (חץ אדום) מסומנים. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מיקרוסקופית Intravital לאחר מתן 3-שבועות של Fluoxetine לעכברי wildtype עם או בלי LPS אתגר. השתנה ממספר 7 (א) של לויקוציטים מתגלגל ללא LPS-גירוי. (ב) מהירות יקוציט ללא גירוי LPS. מספר (C) של לויקוציטים חסיד בתוקף ללא גירוי LPS.דוגמא לכלי של עכבר WT מטופל ללא אתגר LPS (ד '). (ה) דוגמא לכלי של עכבר שטופל fluoxetine ללא אתגר LPS. מספר (F) של לויקוציטים מתגלגל לאחר LPS-גירוי. (G) יקוציט מהירות לאחר גירוי LPS. מספר (H) של לויקוציטים חסיד תוקף לאחר גירוי LPS. דוגמא לכלי של עכבר WT מטופל לאחר אתגר LPS (I). דוגמא (J) של כלי של עכבר שטופל fluoxetine אחרי אתגר LPS. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מיקרוסקופית Intravital לאחר חריף Fluoxetine אתגר 2 שעות לפני ניתוח עםמתוך LPS אתגר. השתנה מ8) מספר כדוריות דם לבנות מתגלגלים ללא LPS-גירוי. B) מהירות יקוציט ללא גירוי LPS. מספר C) של לויקוציטים חסיד בתוקף ללא גירוי LPS. ד) דוגמא לכלי של עכבר WT מטופל ללא אתגר LPS. E) דוגמא לכלי של עכבר שטופל fluoxetine חריף ללא אתגר LPS. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. אינטראקציות טסיות דם-יקוציט in vivo אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונה מייצגת של היתר טסיות דם-יקוציטפעולות בעכברי in vivo במהלך דלקת הצפק lipopolysaccharide מושרה בעורקים. הדפס מ -11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במסמך זה אנו מתארים את ההכנה וביצועים של מיקרוסקופיה intravital של ורידים לפדר של עכברי in vivo. שיטה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-אנדותל 11 ישירות באורגניזם החי.
כתגובה מוקדמת לדלקת האנדותל מקבל הופעל ואינטראקציה עם כדוריות דם לבנות וטסיות דם וכתוצאה מכך מתגלגלים, הדבקה והגלגול 12. אבל לויקוציטים גם אינטראקציה עם טסיות דם ויוצרים מה שנקרא, מתחמי טסיות-יקוציט, בעיקר מתחמי טסיות-נויטרופילים (PNCs) ומתחמי טסיות-מונוציטים (PMCs) ניתן לצפות 13,14 .These אינטראקציות ולכמת בשיטה זו.
בנוסף טכניקה זו מאפשרת לחקור הפעלת האנדותל עם סמנים כמו VCAM-1 או ICAM-1 (לדוגמא, לאחר אינטראקציות טסיות דם / יקוציט) 15.
הגירוי הפיזי של ההליך עצמו גורם למידה מסוימת של הפעלת אנדותל, מה שמוביל לגלגול גלוי של לויקוציטים (אך כמעט ולא מתגלגלים איטי ולא הידבקות חברה). משמעות הדבר הוא כי הבוחן צריך לטפל לפדר בזהירות רבה. אם יש יותר מדי הפעלה שנגרמה על ידי גולמי טיפול זה יגרום למספרים גבוהים של כדוריות דם לבנות מתגלגל וחסידות. כדי להגיע למספר לשחזור של 30-80 לויקוציטים מתגלגל לדקה בעכברי wild-type הבוחן צריכה להיות מאומן.
חסימה של P-selectin / PSGL-אינטראקציה יכולה לשמש כביקורת על מנת לאשר את האינטראקציה של לויקוציטים עם האנדותל. זה פוסל כי לויקוציטים הם פסיביים "מחוברים" לאנדותל, תרחיש שעלול להתרחש אם זרימת הדם מופחתת מאוד.
קוטר כלי לפדר נע על 200-300 מיקרומטר. לפיכך, שיטה זו אינה מתאימה להערכת זרימת דם בנימים, אך מתמקדתעל אינטראקציות יקוציט-האנדותל בעורקים קטנים, מודלקים, המקום העיקרי לגלגול של לויקוציטים. בהשוואה לשיטות מיקרוסקופיה התוך חיונית אחרות כגון מודל Cremaster, שיטה זו היא קלה יותר ללמוד ויכול להתבצע בפרק זמן קצר יותר.
אחת המגבלות החשובות ביותר של שיטה זו הוא שהעכברים צריכים להיות צעיר בלי הרבה שומן לפדר יש תצפית טובה לכלי השיט, כך ששיטה זו לא ניתן לבצע לאחר מחקרי האכלה או טיפול ארוכים.
ברגע שהבוחן הוא אימן, ניתן לבחון מצבים דלקתיים שונים בשיטה זו, כגון יישום של LPS, thioglycollate, TNFα או היסטמין. הדמיה ספציפית יותר של תאי דם מסוימים יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במולקולות שכותרתו fluorescently ממוקדת. בסך הכל, בשיטה זו היא קלה ללימוד ודרך מהירה לבחון אינטראקציות יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט באורגניזם חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
