Protocol
1. Приготовление раствора Родной растворимый коллаген
- Подготовка или приобрести 200 мг подкисленной, растворимого типа, коллагена из хвостов крыс на 1-3 мг / мл с использованием стандартных протоколов выделения, как сообщает Piez др. 15
- Шкала количество исходного материала на основе желаемого конечного объема модифицированных растворов коллагена. Приблизительно 25-30 мл сделать метилированных и 25-30 мл сукцинилированных решений коллаген, каждый по 3 мг / мл, от 200 мг растворимого нативного коллагена.
2. Коллаген Метилирование
- Развести 100 мг нативного, подкисленной (рН 2-3) раствора коллагена в концентрации 0,5 мг / мл ледяной стерильной воде и держать на льду раствор, чтобы предотвратить гелеобразование.
- Доводят рН раствора коллагена 9-10 с несколькими каплями 1 N NaOH и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Соблюдайте коллагена осадок, в результате чего решение стать облачно. Спин вниз осажденного раствора коллагена при 3000 г в течение 25 мин. Четкое гелеобразный осадок должен быть виден в нижней части трубы. Аспирируйте и надлежащим образом распоряжаться надосадочной жидкости.
- Ресуспендируют осажденного коллагена в 200 мл метанола с 0,1 N HCl и оставляют реакционную метилирование происходить при перемешивании при комнатной температуре в течение 4 дней. Коллаген не растворяются, но должны распадаться на мелкие кусочки, которые видны сделают решение облачность.
- После метилирования, центрифуги раствор при 3000 х г в течение 25 мин для осаждения метилированный коллаген. Аспирируйте и распоряжаться подкисленный метанол супернатанта.
- Растворить метилированный коллаген в 25 мл стерильной PBS в, давая концентрации приблизительно 3 мг / мл, с повторным пипетированием и фильтруют раствор через клеточный фильтр 60 мкм. Доводят рН раствора до 7,3-7,4 с помощью 20 мкл с шагом в 1 N NaOH.
- Оценить concentratioн раствора с использованием коммерческих крыса коллагена ELISA набор или набор гидроксипролина анализа. Развести решение 3 мг / мл стерильного PBS с.
- Стерилизацию метилированный решение коллагена путем передачи его в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, тщательно отводками 3 мл хлороформа в нижней части бутылки, позволяют бутылка для установки O / N при 4 ° С, а затем асептически удалить и хранить Верхний слой, который является метилированный коллаген.
- Хранить раствор при 4 ° С для использования в течение 1 месяца.
3. Коллаген Сукцинилирование
- Развести другой 100 мг нативного, подкисленной (рН 2-3) раствора коллагена в концентрации 0,5 мг / мл ледяной стерильной воде и держать на льду раствор, чтобы предотвратить гелеобразование.
- Доводят рН раствора коллагена 9-10 с несколькими каплями 1 N NaOH и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Коллаген должны ускорить, в результате чего решение стать облачно.
- Растворите 40 мг SucCinic ангидрид (0,4 мг на мг коллагена) в 10 мл ацетона (1/20 объема раствора коллагена). Медленно (приблизительно 0,5 мл шагом) добавить эту смесь к раствора коллагена при перемешивании при непрерывном мониторинге рН. Поддержание рН выше 9,0, добавляя 1 или 2 капли 1 N NaOH, как рН 9,0 подходы.
- Продолжить перемешивание при комнатной температуре в течение 120 мин после добавления всех нтарного ангидрида в ацетоне. Соблюдайте решение стать ясно, как сукцинилированный коллагена растворяется. Периодически проверяйте, чтобы обеспечить рН остается выше 9,0.
- Доводят рН раствора до 4,0 с помощью 20 мкл с шагом 1 N HCl. Соблюдайте решение облачно снова, как сукцинилированный коллагена осаждается.
- После сукцинилированием, центрифуги решение в 3000 × г в течение 25 мин для осаждения сукцинилированных коллагена. Аспирируйте и распоряжаться подкисленной супернатанта непрореагировавшего ангидрида янтарной кислоты.
- Растворите сукцинилированных коллагенав 25 мл стерильной PBS, дающих концентрации приблизительно 3 мг / мл, при повторном пипеткой, и фильтрации раствора через ячейки сетчатого фильтра 60 мкм. Доводят рН раствора до 7,3-7,4 с помощью 20 мкл с шагом в 1 N NaOH.
- Оценка концентрации раствора с использованием коммерческого коллагена крысы ELISA набор или набор для анализа гидроксипролина. Развести решение 3 мг / мл стерильного PBS с.
- Стерилизацию сукцинилированных решение коллагена путем передачи его в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, тщательно отводками 3 мл хлороформа в нижней части бутылки, позволяют бутылка для установки O / N при 4 ° С, а затем асептически удалить и хранить Верхний слой, который является сукцинилированный коллагена.
- Хранить раствор при 4 ° С для использования в течение 1 месяца.
4. Проверка коллагена Изменения
- Подготовка 1 мл пробы из каждой из нативных, метилированных и сукцинилированных решений коллагеновых и разбавить до концentration 0,1 мг / мл стерильной воды для чистого водорода титрованием ионов. Далее разбавить буфер, по крайней мере 1000-кратного диализом против воды через 10 кДа отсечки membraneusing 3 раствора изменяется по крайней мере 4 ч каждой.
- Отрегулируйте рН растворов до 7,3 с небольшими количествами NaOH и HCl. Использование рН 7,3 в качестве произвольного ссылке, выполнить ионов водорода титрованием на каждом из образцов, как описано Танфорду 16 для создания кривых титрования для нативных, метилированных и сукцинилированных решений коллагена.
- Участок изменения рН на единицу объема добавленной кислоты по сравнению с количеством связанного ионов Н + на молекулу. Высокий уровень рН "амино" диапазон должен показать сдвиг в сукцинилированного коллагена к нейтральной точке (потеря аминогрупп) и низким рН "карбоксильной" диапазон должен показать левый поворот метилированного коллагена (потерю карбоксильных групп ) и сдвиг вправо в сукцинилированного коллагена (прирост в карбоксильной группес), по сравнению с нативного коллагена.
- Оценка эффективности реакции сукцинилирования путем определения% аминогрупп в нативного коллагена заменен сукцинилирования использованием 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBA) колориметрическим методом, в соответствии со стандартными протоколами 17,18.
5. Изготовление микрофлюидных устройств и сотовых Раздают
- Изготовить микрожидкостных устройств, используя стандартные методы 9. Используйте реплики формования PDMS от SU-8 мастеров на кремнии, определенной с помощью фотолитографии для создания микрожидкостных клеточной культуры камеры с 100 мкм в высоту, ширину 0.4-1.5 мм, 1-10 мм и длиной каналов для роста клеток.
- Используйте чистящее средство в плазме для окисления поверхности устройства и стекло, а затем нажмите вместе, чтобы связью. После стерилизации устройства под воздействием УФ света в течение не менее 30 мин, заполнить камеру с 50 мкг / мл фибронектина в стерильной PBS и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин. Семенной устройство с клетками, такими как первичный крысы или человека гепатоцитов, которые требуют коллагена гель для стабилизации фенотипа или состояния дифференцировки. Мы используем 20 мкл свежевыделенных первичной гепатоцитов крысы 7,19 или коммерчески доступных криоконсервированных гепатоцитов первичных человеческих высевают в 14 × 10 6 клеток / мл в устройстве.
- Разрешить клетки приложить на 4-6 часа, а затем промыть одиноких клетки и заменить обшивки СМИ с ростом массовой информации. Выдержите O / N, чтобы обеспечить полное ячейку распространения и создать сливающийся монослой клеток.
6. Слой за слоем Коллаген осаждения
- В ламинарном потоке капот культуры ткани, готовят достаточных объемов метилированных и сукцинилированных коллагеновых растворов в течение 10 приложений каждого раствора на устройстве, а также несколько миллилитров сред. Держите решения на льду. Мы используем 20 мкл (в 10-15 раз общий объем устройства) коллагена в слое на устройство.
- Бытьхлопкоочистительное с метилированной (поликатионной) раствор, альтернативный промывки устройства 20 мкл метилированных и затем сукцинилированный растворов коллагена, ожидая 1 мин между каждым приложением. Промойте устройству в общей сложности 10 раз в растворе, который должен занять около 20 минут. Работают быстро, чтобы свести к минимуму количество времени, клетки без средств массовой информации.
- Заметим, коллаген медленно накапливаются на входе / выходе в зависимости от его размера. Если сопротивление возрастает потока жидкости, промойте устройство один или два раза со средствами массовой информации, а затем продолжить наслоение.
- После нанесения всех слоев, промыть устройство в два раза свежей средой и вернуться в инкубатор. В зависимости от типа клеток, внеклеточный матрикс-индуцированных морфологических изменений, таких как повышенной поляризации в гепатоцитах, должны быть видны в течение нескольких часов.
- Подготовка репрезентативных устройства для электронной микроскопии с использованием стандартных методов 9 до проверки присутствия коллагеновой матрицеУзел сверху культивируемых клеток.
7. Стабилизация клеточной фенотипа и функции
- Изображение морфология клеток, жизнеспособность, и полярность с помощью стандартных методов типа клеток. Для гепатоцитов, собирать изображения в течение 14 дней, используя фазового микроскопа, LIVE / DEAD для окрашивания жизнеспособность и CMFDA краситель для апикальной поляризации, чтобы продемонстрировать последствия отложения коллагена.
- Для морфологии клеток, промойте устройство через входное отверстие с помощью пипетки 20 мкл PBS, чтобы ополоснуть, вводят 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью фазово-контрастной микроскопии.
- Для получения немедленной / DEAD окрашивания, промыть устройство через входное отверстие пипеткой с 20 мкл PBS, чтобы смыть, инъекционные 20 мкл LIVE / DEAD красящим раствором с DAPI подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, промыть Устройство снова 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Для желчных CanaliCuLi окрашивание, промойте устройство через входное отверстие с помощью пипетки 20 мкл PBS, чтобы ополоснуть, вводят 20 мкл 2 мкМ CMFDA красящим раствором с DAPI подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя, инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С, промыть устройство снова 20 мкл PBS, и изображение устройства с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Сбор отработанных массовой информации и измерения клеточных метаболических продуктов на соответствующих временных точках в течение срока культуры для определения функции клеток. Для гепатоцитов, измеряют количество альбумина и мочевины в истощенных средах.
- Выполнение конечных функциональных анализов на самих клеток, таких как оценки уровней активности фермента, окрашивание антителом или анализа РНК. Для гепатоцитов, вызывают и измерить цитохрома Р450 деятельности или фазы II спряжения фермент глутатион S-трансферазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Родной коллаген может быть изменен с помощью метилирования и Сукцинилирование создать поликатионные и полианионные коллагеновые решения для использования в слой за слоем осаждения. Сукцинилирование модифицирует Е-аминогрупп нативного коллагена с сукцинил групп, и метилирование изменяет карбоксильных групп нативного коллагена с метильной группы (фиг.1А). Эти модификации белка коллагена боковых цепей аминокислот изменить кривые рН титрование растворов. Сукцинилирование уменьшает количество аминогрупп и увеличивает количество карбоксильных групп, тогда как метилирование не влияет на аминогрупп и уменьшает количество карбоксильных групп, по сравнению с нативного коллагена (Фиг.1В). Эти модификации изменяют характеристики заряда молекул коллагена. Сукцинилирование удаляет положительно заряженные группы и заменяет их с отрицательно заряженными группами, и метилирование удаляет отрицательно заряженные группы (рис 1С </ STRONG>).
Слой за слоем отложение метилированных и сукцинилированных решений коллагена (COL LBL) создает матрицу сборки ультратонкий коллагена в верхней части заряженных поверхностей, таких как клетки (фиг.2А). Первичные гепатоциты высевают на покрытые фибронектином стекла в микрожидком устройства (Фигура 2В) может быть покрыта таким чисто коллагеновой матрице сборки (фиг.2с). Нанесение 10 бислоев на клетки создает коллагена слой толщиной примерно 140 нм (рис 2D).
Ультратонкий коллагена сборки слой, нанесенный с использованием метода COL LBL стабилизирует первичные гепатоциты более 14 дней в микрофлюидных устройств. Гепатоциты без верхней крышки матрицы теряют дифференцированный фенотип, контракт, и поднять с поверхности микрофлюидных устройств с течением времени (рис. 3А-С). В противоположность этому, гепатоциты покрыты ультратонкого коллагена сборки maintaiн их дифференцированное морфология и поляризации в течение 14 дней (рис 3D-F). Жизнеспособность клеток поддерживали на уровне выше 90% (рис 3G-I). Кроме того, поляризация гепатоцитов, получавших COL LBL увеличилась с течением времени, показывающий развитие апикального желчных канальцевой сети (рис 3J-L).
В дополнение к жизнеспособности клеток, морфологии и поляризации, метод COL LBL восстанавливает и стабилизирует функцию первичных гепатоцитов при уровнях, аналогичных стандартных методов клеток в пластинах. Секреция альбумина гепатоцитами низкий сразу после посева, а остается на низком уровне, если клетки не индуцируют для поляризации через матрицы покрытия. После лечения COL LBL, секреции альбумина гепатоцитами возрастает более чем 8-10 дней до стабилизации (рис 4а). Производство карбамида высокой сразу после посева клеток и уменьшается с течением времени в клетках нOT покрыта матрицей, производство мочевины стабилизируется через 8-10 дней в гепатоциты, стабилизированных COL LBL (рис 4В). Цитохрома P450 (CYP) экспрессии фермента в ответ на стимулы один специализированной функции гепатоцитов. Индукция CYP1A1 в гепатоцитах в ответ на 3-метилхолантрена извлекают и стабилизировалась до 14 дней при лечении COL LBL (фиг.4С).
Рисунок 1. крысиный хвост коллагена решения были химически модифицированы, чтобы создать сеть положительно или отрицательно заряженные чистая полимерных растворов. (А) Схема представлений Сукцинилирование и метилирования реакций, которые изменяют карбоксильные и Е-аминогруппы, соответственно. (B) Водород титрования derivatives Кривая изменения в относительной численности ионов Н +, необходимых для изменения рН раствора после перевалаLagen модификация. (С) Чистые расходы (в среднем ± SD) модифицированных решений коллагеновых рассчитанных Н + сдвигов в (б) нормированные в родной коллагена. МК: метилированы коллагена. СК: сукцинилированный коллагена. АА: аминокислотных остатков. Повторная печать с разрешением от 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. слой за слоем отложение коллагена модифицированных растворах создано ультратонкую коллагеновой матрицы в сборе на вершине гепатоцитов. (А) Схематическое представление гепатоцитов, посеянных на фибронектин на микроустройство и инкубировали с чередующимися метилированных и сукцинилированных решения коллагена. ТЕМ сечения представителя (20 клеток исследовали в группе) мошенникиTrol (В) и COL LBL обработке (C) гепатоциты после 2 дней культуры. Стрелки: LBL слой коллагена. Масштабная линейка:. 2 мкм (D) кол LBL толщина слоя (в среднем ± SD) в клетке, измеренной от ТЕМ изображений (п = 20 клеток от 4-х устройств). Модифицированный с 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Методика COL LBL поддерживается гепатоцитов морфологии, жизнеспособности и поляризацию в микроустройствах более 14 дней в культуре. Гепатоциты без верхнего слоя в микроустройствах (отрицательный контроль) договора и поднять с поверхности в течение долгого времени (А-С). LBL осаждения модифицированных коллагенов поддерживает морфологию гепатоцитов (D-F) и viability (G-я) в микроустройствах более 14 дней. CMFDA является общим маркером клеток, что остается в цитоплазме, не являющихся поляризованный гепатоцитов (J). Со временем, развитие желчные канальцы можно увидеть, путем выведения флуорофора в канальцевой пространств (К), которые развиваются вокруг клеток с течением времени (L). Изображение Шкалы: 100 мкм. Врезка Шкалы: 50 мкм. Модифицированный с 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Полковник LBL стабилизирует гепатоцитов альбумина и мочевины и секции CYP активность в течение 14 дней в микрофлюидных устройств. (А) Альбумин секреции гепатоцитами в COL LBL запущен низко и увеличение со временем уntil достигая плато на 10-й день (B) мочевина секреции COL LBL гепатоцитов не уменьшилось с течением времени до тех пор, достигая плато на день 10. (С) индукции CYP1A активности был низким день 2, но значительно повышалось на 7-й день, А уровень, который поддерживался через день 14. Среднее ± SEM; Полковник LBL: гепатоциты культивируют после LBL осаждения коллагена; NoTop: гепатоциты, культивированные без верхнего слоя; матрицы N = 6-8 устройств. Модифицированный с 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ультратонкие чистый коллаген сборки могут быть нанесены на заряженных клеток или материальных поверхностей с использованием слой за слоем отложение модифицированных коллагенов. Результаты этого исследования показывают, что метилирование и Сукцинилирование из нативного коллагена создать поликатионные и полианионные решения коллагена (Рисунок 1), которые могут быть использованы с слой за слоем техники на хранение ультратонких коллагеновый матрикс сборок на клетки (рис 2) или других заряженных материальные поверхности. Такие ультратонкие слои матрицы может стабилизировать морфологии, жизнеспособности и поляризацию клеток, таких как гепатоциты (рисунок 3), после посева в микрофлюидных устройств, а также их функции (рисунок 4).
Для успешного нанесения ультратонких слоев коллагеновых, модификация реакции, создающие метилированных и сукцинилированных коллагены являются критическими. Поскольку реакция метилирования карбоксильную группу не выгодно, токоллаген реакция метилирования должна быть выполнена в подкисленной метанола для проведения реакции вперед, основанную на принципе Ле Шателье. Поэтому, важно, чтобы удалить все излишки воды из коллагена после осаждения рН перед растворением осажденного коллагена в подкисленный метанол, чтобы увеличить эффективность реакции. Для реакции сукцинилирования, поддерживая рН раствора выше 9, добавляя янтарный ангидрид в ацетоне имеет решающее значение. Непрерывный контроль рН и медленным добавлением раствора янтарной ангидрида в ацетоне полезны для обеспечения эффективного реакцию. Во время слой за слоем осаждения, очень важно, чтобы свести к минимуму время, что клетки обходиться без средств массовой информации. Процедура 10 бислоев занимает приблизительно 20 мин, что составляет около тех пор, пока большинство клеток должны быть без средств массовой информации за пределами инкубатора. Если более 10 бислои должны быть депонированы, отдых клеток в средствах массовой информации в инкубаторе в течение 3-4 часов между КоллаGEN показания для обеспечения здоровья клеток. На другом полюсе, тоже несколько слоев не будет эффективным в поддержании морфологии клеток. В нашем тестировании, 3 слоя не поддерживать морфологии клеток, в то время как 10 слоев сделал.
Несколько модификации могут быть сделаны с процедурами для устранения проблемы. Время и температура реакции метилирования может изменяться в случае возникновения проблем. Например, уменьшение температуры реакции до 4 ° С и увеличение времени до 7 дней может увеличить эффективность. Кроме того, в зависимости от степени полимеризации в процессе добычи рН, коллаген иногда полностью растворяется в подкисленной метанола в ходе реакции метилирования. Если это происходит, добавить 10 М NaOH, чтобы довести рН до 9-10 после реакции завершил того, чтобы осадить коллагена, так что он может быть осаждали на следующем этапе. При применении слой за слоем отложение в микрофлюидных устройств, небольшие каналы или порты могут стать CLogged с коллагеном, свидетельствует увеличение в устройстве текучей сопротивления. Промывка устройства со свежими СМИ должны удалить любые блокировки, что позволяет осаждения, чтобы продолжить.
Руководство осаждения слоя за слоем коллагена, как описано здесь является ограничение в плане масштабирования и автоматизации микрофлюидных устройств. Тем не менее, этот метод совместим со стандартом микрожидкостных аппаратных средств, в том числе клапанов и насосов, которые могут быть использованы для автоматизации технику и подготовить массивы устройств одновременно. Другим ограничением данного метода для использования в пластине культуры является то, что он требует относительно большого количества нативного коллагена. Для применения микрожидкостных, объемы метилированных и сукцинилированных коллагенов может быть использован для создания сверхтонких слоев коллагеновых во многих устройствах. При стандартном ткани пластины культуры, с другой стороны, объемы, необходимые для покрытия скважин становятся более непомерно с увеличением размера скважины.
Это Layer-за слоем метод осаждения ультратонких слоев коллагенового матрикса могут быть дополнительно разработаны с использованием альтернативных или функциональные изменения, а также путем создания нескольких слоев клеток, разделенных тонкими матричных узлов. Хотя относительно простые аминокислотные модификации боковой цепи реакций метилирования и сукцинилирования были использованы здесь, альтернативные или дополнительные реакции могут быть использованы вместо того, чтобы создать функционализированные коллагены. Функционализованные боковые цепи должны по-прежнему дают протеины с чистых общих положительных и отрицательных зарядов, но такой функционализации может быть полезным для различных применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
- Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
- Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
- Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
- Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
- McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
- Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
- Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
- Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
- Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
- Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
- Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
- Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
- Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
- Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
