Protocol
1. Preparação da solução de colagénio nativo solúvel
- Prepare comprar ou 200 mg de acidificada, solúvel, de colagénio tipo I da cauda de ratos a 1-3 mg / 15 ml, utilizando protocolos de isolamento convencionais, tais como relatado por Piez et ai.
- Escala a quantidade de material de partida com base no volume final desejado de soluções de colagénio modificados. Aproximadamente 25-30 ml de fazer metilado e 25-30 ml de soluções de colagénio succiniladas, cada um em 3 mg / ml, a partir de 200 mg de colagénio nativo solúvel.
2. O colágeno metilação
- Dilui-se 100 mg da solução nativa, acidificou-se (pH 2-3) de colagénio a uma concentração de 0,5 mg / ml com água estéril gelada e manter a solução em gelo para evitar a gelificação.
- Ajuste o pH da solução de colagénio para 9-10 com algumas gotas de NaOH 1 N e agita-se à TA durante 30 min. Observe-se o precipitado de colagénio, fazendo com que a solução se tornar turva. Girar a solução de colágeno precipitado a 3000 × g durante 25 min. Um precipitado claro, semelhante a gel deve ser visível no fundo dos tubos. Aspirar e descartar adequadamente o líquido sobrenadante.
- Ressuspender o precipitado de colagénio em 200 ml de metanol com HCl 0,1 N e permitir que a reacção de metilação para ocorrer com agitação à temperatura ambiente durante 4 dias. O colágeno não vai dissolver, mas deve se quebrar em pedaços muito pequenos visíveis que irão tornar a solução turva.
- Após a metilação, centrifugar a solução a 3000 × g durante 25 min para sedimentar o colagénio metilado. Aspirar e descarte do sobrenadante metanol acidificado.
- Dissolve-se o colagénio metilado em 25 ml de PBS estéril, dando uma concentração de aproximadamente 3 mg / ml, com uma pipetagem repetida, e filtrar a solução através de um filtro de células de 60 mm. Ajuste o pH da solução para 7,3-7,4 usando 20 ul incrementos de 1 N NaOH.
- Avaliar a Concentraçãn da solução utilizando um kit de ELISA comercial colágeno rato ou kit de ensaio de hidroxiprolina. Dilui-se a solução a 3 mg / ml com PBS estéril.
- Esterilizar a solução de colagénio metilado, transferindo-a para um frasco de vidro com uma tampa de rosca, de camadas cuidadosamente 3 mL de clorofórmio, na parte inferior da garrafa, permitir que a garrafa para definir O / N a 4 ° C, e em seguida assepticamente remover e armazenar o camada superior, que é o colagénio metilado.
- Guardar a solução a 4 ° C para utilização no prazo de 1 mês.
3. O colagénio succinilação
- Dilui-se a outros 100 mg da solução nativa, acidificou-se (pH 2-3) de colagénio a uma concentração de 0,5 mg / ml com água estéril gelada e manter a solução em gelo para evitar a gelificação.
- Ajuste o pH da solução de colagénio para 9-10 com algumas gotas de NaOH 1 N e agita-se à TA durante 30 min. O colagénio deve precipitar, fazendo com que a solução se tornar turva.
- Dissolve-se 40 mg de sucanidrido cínico (0,4 mg por mg de colagénio) em 10 ml de acetona (1/20 do volume da solução de colagénio). Lentamente (em cerca de 0,5 ml incrementos) adicionar esta mistura à solução de colagénio com agitação, enquanto se monitorizava continuamente o pH. Manter o pH acima de 9,0 através da adição de 1 ou 2 gotas de NaOH 1 N conforme o pH se aproxima de 9,0.
- Continuar a agitar à temperatura ambiente durante 120 minutos após a adição de todo o anidrido succínico em acetona. Observe a solução para se tornar claro como o colágeno succinilado dissolve. Verifique periodicamente o pH para assegurar que ela permaneça acima de 9,0.
- Ajustar o pH da solução para 4,0 com 20 ul incrementos de 1 N de HCl. Observar a solução turva novamente, como o colagénio precipita succinilada.
- Após a succinylation, centrifugar a solução a 3000 × g durante 25 min para sedimentar o colagénio succinilado. Aspirar e descarte do sobrenadante acidificou-se com anidrido succínico não reagido.
- Dissolve-se o colagénio succiniladoem 25 ml de PBS estéril, dando uma concentração de aproximadamente 3 mg / ml, com uma pipetagem repetida, e filtrar a solução através de um filtro de células de 60 mm. Ajuste o pH da solução para 7,3-7,4 usando 20 ul incrementos de 1 N NaOH.
- Avaliar a concentração da solução, utilizando um kit de ELISA comercial de rato de colagénio ou kit de ensaio de hidroxiprolina. Dilui-se a solução a 3 mg / ml com PBS estéril.
- Esterilizar a solução de colagénio succinilado, transferindo-a para um frasco de vidro com uma tampa de rosca, de camadas cuidadosamente 3 mL de clorofórmio, na parte inferior da garrafa, permitir que a garrafa para definir O / N a 4 ° C, e em seguida assepticamente remover e armazenar o camada superior, que é o colagénio succinilado.
- Guardar a solução a 4 ° C para utilização no prazo de 1 mês.
4. Verificação do colagénio Modificações
- Preparar amostras de 1 ml a partir de cada uma das soluções de colagénio nativo, metilados, e succiniladas e diluir para um coneentration de 0,1 mg / ml com água pura esterilizada para titulação de íons de hidrogênio. Diluir o tampão de pelo menos 1.000 vezes por diálise contra água através de um corte de 10 kDa membraneusing 3 mudanças de solução de pelo menos 4 horas cada.
- Ajustar o pH das soluções para 7.3 com pequenas quantidades de HCl e de NaOH. Usando pH 7,3 como uma referência arbitrária, executar titulação de iões de hidrogénio em cada uma das amostras, como descrito por Tanford 16 para criar curvas de titulação para as soluções de colagénio nativo, metilados, e succinilada.
- Traça-se a mudança de pH por volume de ácido adicionado em relação ao número de iões H + ligada por molécula. O pH elevado "amino" intervalo deve mostrar uma mudança no colagénio succinilado em direcção ao ponto neutro (uma perda de grupos amina), e o pH baixo "carboxilo" intervalo deve mostrar um deslocamento para a esquerda no colagénio desnaturado (uma perda de grupos carboxilo ) e um desvio para a direita na colagénio succinilada (um ganho no grupo carboxilos), em comparação com o colagénio nativo.
- Avaliar a eficácia da reacção succinylation pela determinação da% de grupos amino no colagénio nativa substituído por succinylation usando o método colorimétrico de ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBA), seguindo protocolos padrão 17,18.
5. fabricação de dispositivos microfluídicos e propagação de celular
- Fabricar dispositivos microfluídicos usando métodos padrão 9. Use réplica moldagem de PDMS de SU-8 mestres de silício definido usando fotolitografia para criar câmaras de cultura de células de microfluidos com 100 um de altura, 0,4-1,5 mm de largura e 1-10 mm de comprimento canais para o crescimento celular.
- Use um limpador de plasma para oxidar as superfícies do dispositivo e uma lâmina de vidro, em seguida, pressione em conjunto para ligação. Após a esterilização do dispositivo em caso de exposição à luz UV durante pelo menos 30 min, encher a câmara com 50 ug / ml de fibronectina em PBS estéril e incubar a 37 ° C durante 45 min. Semear o dispositivo com as células, tais como de rato primária ou hepatócitos humanos, que necessitem de um gel de colagénio para a estabilização do fenótipo ou do estado de diferenciação. Usamos 20 ul de recém-isolados hepatócitos primários de rato 7,19 comercialmente disponíveis ou criopreservados hepatócitos humanos primários semeadas a 14 x 10 6 células / ml para cada dispositivo.
- Permitir que as células para anexar para 4-6 horas, e, em seguida, lavar a células não ligadas e substituir a mídia chapeamento com meios de crescimento. Incubar O / N para assegurar célula completa divulgação e criar uma monocamada confluente de células.
6. Camada por camada de colágeno Deposição
- Em um fluxo laminar capuz de cultura de tecidos, volumes suficientes de preparar soluções de colagénio desnaturado e succiniladas de 10 aplicações de solução por cada dispositivo, bem como de alguns ml de meio. Mantenha as soluções no gelo. Nós usamos 20 jul (10-15 vezes o volume total de dispositivo) de colágeno por camada por dispositivo.
- Serdescaroçamento com a solução metilado (policatiónico), suplente rubor os dispositivos com 20 l de metilado e depois succinilado soluções de colágeno, esperando 1 min entre cada aplicação. Lave o dispositivo de um total de 10 vezes por solução, que deve levar cerca de 20 min. Trabalhar rapidamente para minimizar a quantidade de tempo que as células são sem meios.
- Observar colagénio lentamente acumulam à entrada / saída em função do tamanho. Se a resistência ao fluxo do fluido aumenta, lave o dispositivo uma ou duas vezes com a mídia, e depois continuar estratificação.
- Após a aplicação de todas as camadas, lavar duas vezes com o dispositivo de meios frescos e retornar para a incubadora. Dependendo do tipo de célula, as alterações morfológicas induzidas extracelulares da matriz, tais como a polarização aumentada em hepatócitos, deve ser visível dentro de algumas horas.
- Prepare dispositivos representativos para microscopia electrónica de transmissão usando métodos padrão de 9 para verificar a presença de uma matriz de colagénioa montagem no topo das células cultivadas.
7. Estabilização do fenótipo celular e função
- Imagem da morfologia celular, viabilidade, e a polaridade usando métodos padrão para o tipo de célula. Para hepatócitos, coletar imagens ao longo de 14 dias, utilizando microscopia de fase, coloração Live / Dead para a viabilidade, e corante CMFDA para a polarização apical para demonstrar os efeitos da deposição de colágeno.
- Para a morfologia das células, lave o dispositivo através da entrada, com uma pipeta, com 20 ul de PBS para enxaguar, injectar 20 ul de PBS, e a imagem do dispositivo usando microscopia de contraste de fase.
- Para a coloração Live / Dead, irrigue o dispositivo através da entrada com uma pipeta com 20 l de PBS para lavar, injetar 20 ml de solução de coloração Live / Dead com DAPI preparado seguindo as instruções do fabricante, incubar por 30 min a 37 ° C, lavar a Dispositivo de novo com 20 ul de PBS, e a imagem do dispositivo usando a microscopia de fluorescência.
- Para bile canalicoloração Culi, lave o dispositivo através da entrada, com uma pipeta, com 20 ul de PBS para enxaguar, injectar 20 ul de 2 gotas de solução corante uM CMFDA com DAPI preparados de acordo com as instruções do fabricante, incubar durante 30 minutos a 37 ° C, lavar novamente o dispositivo com 20 ul de PBS, e a imagem do dispositivo usando microscopia de fluorescência.
- Recolher os meios gastos e medir produtos metabólicos celulares em pontos de tempo apropriados ao longo da duração da cultura para determinar a função das células. Para hepatócitos, medir a quantidade de albumina e ureia na mídia gastos.
- Realizar análises funcionais de ponto final nas próprias células, como as que avaliam os níveis de enzimas de atividade, coloração de anticorpos, ou análise de RNA. Para hepatócitos, induzir e medir a atividade das enzimas do citocromo P450 ou fase II conjugação enzima glutationa S-transferase.
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Representative Results
Colagénio nativo pode ser modificado usando metilação e succinylation para criar soluções de colagénio policatiónicos e polianiónicos para uso na deposição de camada por camada. Succinylation modifica os grupos e-amino de colagénio nativo com grupos succinilo, metilação e modifica os grupos carboxilo de colagénio nativo com um grupo metilo (Figura 1A). Estas modificações às cadeias laterais de aminoácidos da proteína de colagénio alterar as curvas de titulação para pH das soluções. Succinylation reduz o número de grupos amino e aumenta o número de grupos carboxilo, enquanto que a metilação tem nenhum efeito sobre os grupos amino e reduz o número de grupos carboxilo, em relação ao colagénio nativo (Figura 1B). Estas modificações alteram as características de carga de as moléculas de colagénio. Succinylation remove grupos carregados positivamente e substitui-los com grupos carregados negativamente, e metilação remove grupos negativamente carregados (Figura 1C </ strong>).
Deposição de camada-a-camada de as soluções de colagénio desnaturado e succiniladas COL (LBL) cria um conjunto de matriz de colagénio ultrafinos em cima de superfícies carregadas, tais como células (Figura 2A). Os hepatócitos primários semeadas em vidro revestidos com fibronectina dentro de um dispositivo de microfluidos (Figura 2B) pode ser revestido com um tal conjunto de matriz de colagénio puramente (Figura 2C). A deposição de 10 camadas duplas em células cria uma espessura de camada de colagénio a cerca de 140 nm (Figura 2D).
A camada do conjunto de colágeno ultrafino depositados utilizando a técnica COL LBL estabiliza hepatócitos primários por mais de 14 dias em dispositivos microfluídicos. Hepatócitos sem tampa matriz topo perdem seu fenótipo diferenciado, contrato, e levante a superfície de dispositivos microfluídicos ao longo do tempo (Fig. 3A-C). Em contraste, os hepatócitos coberto com uma ultrafina colagénio montagem manutenn sua morfologia diferenciada e polarização mais de 14 dias (Figura 3D-F). A viabilidade das células foi mantida a mais de 90% (Figura 3G-I). Além disso, a polarização dos hepatócitos tratados com COL LBL aumentou ao longo do tempo, que mostra o desenvolvimento de uma rede canalicular biliar apical (Figura 3 J-L).
Além de viabilidade celular, morfologia, e polarização, a técnica COL LBL recupera e estabiliza a função de hepatócitos primários a níveis semelhantes aos de técnicas padrão para as células em placas. A secreção de albumina pelos hepatócitos é baixa imediatamente após o plaqueamento, e continua a ser baixa a menos que as células são induzidas para polarizar através de uma matriz de revestimento. Após o tratamento COL LBL, a secreção de albumina pelos hepatócitos que aumenta ao longo de 8-10 dias antes da estabilização (Figura 4A). A produção de ureia é elevado imediatamente após a sementeira de células e diminui ao longo do tempo nas células not coberto com uma matriz, a produção de ureia estabiliza após 8-10 dias em hepatócitos estabilizadas com LBL COL (Figura 4B). O citocromo P450 (CYP) a expressão da enzima em resposta a estímulos é uma função especializada de hepatócitos. A indução do CYP1A1 em hepatócitos em resposta à 3-metilcolantreno foi recuperado e estabilizado até 14 dias pelo tratamento COL LBL (Figura 4C).
Figura 1. soluções de colagénio da cauda de rato foram modificadas quimicamente para criar líquida positiva ou negativamente carregado net soluções poliméricas. (A) representações esquemáticas dos succinilação reacções de metilação e que modificam grupos carboxilo e e-amino, respectivamente. (B) curva de titulação derivados Hidrogénio que mostram mudanças nos números relativos de iões H + necessários para alterar o pH da solução após colmodificação lagen. (C) Os valores líquidos (média ± DP) das soluções de colagénio modificados calculados a partir de H + em turnos (B) normalizados para o colagénio nativo. MC: colagénio metilado. SC: colágeno succinilado. AA: resíduos de aminoácidos. Re-print com a permissão de 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. deposição de camada-a-camada de soluções de colagénio modificados criado um conjunto de matriz de colagénio ultrafino no topo dos hepatócitos. (A) Representação esquemática de hepatócitos semeadas em fibronectina em um microdispositivo e incubadas com soluções de colagénio desnaturado alternada e succiniladas. TEM secções transversais de representante (20 células examinadas por grupo) controlo (B) e COL LBL-tratado (C) hepatócitos após 2 dias de cultura. Setas: camada de colagénio LBL. Barra de escala:. 2 mm de espessura de camada (D) COL LBL (média ± DP) por célula medido a partir de imagens de TEM (n = 20 células) a partir de 4 dispositivos. Modificado de 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A técnica COL LBL mantida a morfologia dos hepatócitos, viabilidade e polarização em microdispositivos com mais de 14 dias em cultura. Hepatócitos sem camada superior em microdispositivos (controle negativo) contrato e levante a superfície ao longo do tempo (A-C). LBL deposição de colágeno modificados mantém morfologia dos hepatócitos (D-F) e VIABility (G-I) em microdispositivos com mais de 14 dias. CMFDA é um marcador de células genérico que permanece no citoplasma de hepatócitos não polarizada (J). Ao longo do tempo, o desenvolvimento de canalículos biliares pode ser visto pela excreção do fluoróforo em espaços canaliculares (K) que se desenvolvem em torno das células ao longo do tempo (L). Imagem barra de escala: 100 mm. Inset barra de escala: 50 mm. Modificado de 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. COL LBL estabiliza albumina hepatócitos e seções de uréia e atividade CYP mais de 14 dias em dispositivos microfluídicos. (A) Albumina secreção pelos hepatócitos em COL LBL começou de baixo e aumentou com o tempo uté atingindo um patamar ao dia 10. (B) a secreção de ureia pelos hepatócitos COL LBL diminuiu com o tempo até atingir um patamar ao dia 10. (C) A indução da actividade CYP1A foi baixa no dia 2, mas aumentou significativamente no dia sete, uma nível que se manteve até ao dia 14. A média ± SEM; COL LBL: hepatócitos cultivados após a deposição de colágeno LBL; NoTop: hepatócitos cultivados sem camada de matriz superior; n = 6-8 dispositivos. Modificado de 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ultrafinos assembleias de colágeno puro pode ser depositado em células carregadas ou superfícies de material usando deposição de camada por camada de colágenos modificados. Os resultados deste estudo demonstram que a metilação e succinylation de colagénio nativo criar soluções policatiónicos e polianiónicos de colagénio (Figura 1) que pode ser utilizado com a técnica de camada-a-camada para depositar conjuntos de matriz de colagénio ultrafinos em células (Figura 2) ou outro carregadas superfícies de materiais. Tais camadas de matriz ultrafinos pode estabilizar a morfologia, a viabilidade, e polarização de células tais como hepatócitos (Figura 3), após a sementeira em microcanais, bem como a sua função (Figura 4).
Para a deposição de camadas de colagénio sucesso ultrafinos, as reacções de modificação criando os colagénios metilados e succiniladas são críticos. Uma vez que a reacção de metilação grupo carboxilo não é favorável, oreacção de metilação de colagénio deve ser realizada em metanol acidificado para conduzir a reacção para a frente, baseado no princípio de Le Chatelier. Portanto, é importante remover todo o excesso de água a partir do colagénio após a precipitação do pH antes de se dissolver o precipitado de colagénio em metanol acidificado, a fim de aumentar a eficiência da reacção. Para a reacção de succinylation, mantendo o pH da solução acima de 9, enquanto a adição de anidrido succínico em acetona é crítica. A monitorização contínua do pH e adição lenta da solução de anidrido succínico acetona são úteis para garantir uma reação eficiente. Durante a deposição de camada-por-camada, que é crítico para minimizar o tempo que as células passam sem meios. O procedimento para 10 bilayers demora cerca de 20 min, que é quase tão longo quanto a maioria das células deve ser sem mídia fora da incubadora. Se mais de 10 bi camadas deve ser depositado, descansar as células em meios numa incubadora durante 3-4 horas entre Colladepoimentos gen para garantir a saúde das células. No outro extremo, muito poucas camadas não serão eficazes na manutenção da morfologia celular. Em nossos testes, 3 camadas não manteve a morfologia das células, enquanto que 10 camadas fez.
Várias modificações podem ser feitas com os procedimentos para solucionar problemas. O tempo e temperatura da reacção de metilação pode ser variado no caso de surgirem problemas. Por exemplo, diminuindo a temperatura de reacção a 4 ° C e o aumento do tempo de 7 dias pode aumentar a eficiência. Além disso, dependendo da extensão da polimerização de pH durante a extracção, o colagénio às vezes dissolvem totalmente na metanol acidificado durante a reacção de metilação. Se isto ocorrer, adicionar 10 M NaOH para trazer o pH até 9-10 após a reacção foi concluída, a fim de precipitar o colagénio para que ele possa ser sedimentadas durante o passo seguinte. Ao aplicar a deposição de camada por camada em dispositivos microfluídicos, pequenos canais ou portas podem se tornar clogged com colagénio, indicado por um aumento na resistência fluídica dispositivo. A lavagem do dispositivo com meios frescos deve remover todos os bloqueios, permitindo a deposição para continuar.
A deposição de colagénio manual da camada-por-camada, conforme descrito aqui é uma limitação em termos de automatização e a escala de dispositivos de microfluidos. No entanto, esta técnica é compatível com o hardware de microfluidos padrão, incluindo válvulas e bombas que podem ser utilizados para automatizar a técnica e preparar matrizes de dispositivos ao mesmo tempo. Outra limitação desta técnica para utilização em placa de cultura é que ela exige uma relativamente grande quantidade de colagénio nativo. Para a aplicação de microfluidos, os volumes de colagénios metilados e succinilada pode ser usado para criar camadas de colagénio ultrafinos em diversos dispositivos. Com placa padrão de cultura de tecidos, por outro lado, os volumes necessários para poços de revestimento tornar-se mais com o aumento do tamanho proibitivo bem.
Este camada-por técnica de camada para a deposição de camadas ultrafinas matriz de colagénio pode ser desenvolvido usando modificações alternativas ou funcionais, bem como através da criação de múltiplas camadas de células separadas por os conjuntos de matriz fina. Embora o aminoácido reacções de modificação da cadeia lateral relativamente simples de metilação e succinylation foram usadas aqui, as reacções alternativas ou adicionais poderia ser usado ao invés, a fim de criar colagénios functionalized. As cadeias laterais functionalized ainda deve produzir proteínas com cargas positivas e negativas globais líquidas, mas tais funcionalização pode ser útil para uma variedade de aplicações.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
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