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Bioengineering

Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

Published: September 29, 2015 doi: 10.3791/53078
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

Protocol

1. Preparación de la solución nativa Colágeno Soluble

  1. Preparar o comprar 200 mg de acidificado, soluble, colágeno tipo I a partir de colas de rata a 1-3 mg / ml utilizando protocolos estándar de aislamiento, tales como reportado por Piez et al. 15
  2. Escala la cantidad de material de partida basado en el volumen final deseado de soluciones de colágeno modificado. Aproximadamente hacer de 25-30 ml de metilada y 25-30 ml de soluciones de colágeno succinilados, cada uno a 3 mg / ml, a partir de 200 mg de colágeno nativo soluble.

2. El colágeno metilación

  1. Diluir 100 mg de la solución de colágeno nativo, se acidificó (2-3 pH) a una concentración de 0,5 mg / ml de hielo agua estéril fría y mantener la solución en hielo para evitar la gelificación.
  2. Ajustar el pH de la solución de colágeno 9-10 con unas pocas gotas de NaOH 1 N y se agita a TA durante 30 min. Observe el precipitado de colágeno, haciendo que la solución a enturbiarse. Centrifugar la solución de colágeno precipitado a 3000 × g durante 25 min. A, precipitado similar a un gel claro debe ser visible en el fondo de los tubos. Aspirar y desechar correctamente el líquido sobrenadante.
  3. Resuspender el precipitado de colágeno en 200 ml de metanol con HCl 0,1 N y permitir que la reacción de metilación que se produzca con agitación a TA durante 4 días. El colágeno no se disuelve, sino que debe romperse en pedazos muy pequeños visibles que harán que la solución turbia.
  4. Después de la metilación, centrifugar la solución a 3000 × g durante 25 min para sedimentar el colágeno metilado. Aspirar y desechar el sobrenadante de metanol acidificado.
  5. Se disuelve el colágeno metilado en 25 ml de PBS estéril, dando una concentración de aproximadamente 3 mg / ml, con pipeteo repetido, y filtrar la solución a través de un filtro de células de 60 micras. Ajustar el pH de la solución a 7.3 a 7.4 utilizando 20 l incrementos de 1 N NaOH.
  6. Evaluar la concentration de la solución utilizando un kit ELISA colágeno rata comercial o kit de ensayo de hidroxiprolina. Diluir la solución a 3 mg / ml con PBS estéril.
  7. Esterilizar la solución de colágeno metilado transfiriéndolo a una botella de vidrio con un tapón de rosca, capas cuidadosamente 3 ml de cloroformo en la parte inferior de la botella, deje la botella para establecer O / N a 4 ° C, y luego asépticamente retirar y almacenar la la capa superior, que es el colágeno metilado.
  8. Guarde la solución a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes.

3. El colágeno Succinilación

  1. Diluir la otra 100 mg de la solución de colágeno nativo, se acidificó (2-3 pH) a una concentración de 0,5 mg / ml de hielo agua estéril fría y mantener la solución en hielo para evitar la gelificación.
  2. Ajustar el pH de la solución de colágeno 9-10 con unas pocas gotas de NaOH 1 N y se agita a TA durante 30 min. El colágeno debe precipitar, haciendo que la solución a enturbiarse.
  3. Disolver 40 mg de succinic anhídrido (0,4 mg por mg de colágeno) en 10 ml de acetona (1/20 el volumen de la solución de colágeno). Lentamente (en aproximadamente 0,5 ml incrementos) añadir esta mezcla a la solución de colágeno con agitación mientras se monitorea continuamente el pH. Mantener el pH por encima de 9,0 mediante la adición de 1 o 2 gotas de 1 N NaOH como el pH se aproxima a 9,0.
  4. Continuar agitar a TA durante 120 min después de añadir todo el anhídrido succínico en acetona. Observe la solución a quedar claro como el colágeno succinilado disuelve. Compruebe periódicamente el pH para asegurarse de que permanece por encima de 9,0.
  5. Ajustar el pH de la solución a 4,0 con 20 l de HCl incrementos de 1 N. Observe la solución turbia de nuevo, como el colágeno succinilado precipita.
  6. Después de la succinilación, centrifugar la solución a 3000 × g durante 25 min para sedimentar el colágeno succinilado. Aspirar y desechar el sobrenadante acidificadas con anhídrido succínico sin reaccionar.
  7. Se disuelve el colágeno succiniladoen 25 ml de PBS estéril, dando una concentración de aproximadamente 3 mg / ml, con pipeteo repetido, y filtrar la solución a través de un filtro de células de 60 micras. Ajustar el pH de la solución a 7.3 a 7.4 utilizando 20 l incrementos de 1 N NaOH.
  8. Evaluar la concentración de la solución utilizando un kit ELISA rata colágeno comercial o kit de ensayo de hidroxiprolina. Diluir la solución a 3 mg / ml con PBS estéril.
  9. Esterilizar la solución de colágeno succinilado transfiriéndolo a una botella de vidrio con un tapón de rosca, capas cuidadosamente 3 ml de cloroformo en la parte inferior de la botella, deje la botella para establecer O / N a 4 ° C, y luego asépticamente retirar y almacenar la la capa superior, que es el colágeno succinilado.
  10. Guarde la solución a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes.

4. Verificación de las modificaciones del colágeno

  1. Preparar muestras de 1 ml de cada una de las soluciones de colágeno nativo, metilados, y succinilados y diluir a una concentration de 0,1 mg / ml con agua pura estéril para la titulación de iones hidrógeno. Además diluir el tampón de al menos 1.000 veces mediante diálisis frente a agua a través de un punto de corte de 10 kDa membraneusing 3 cambios de la solución durante al menos 4 h cada uno.
  2. Ajustar el pH de las soluciones a 7,3 con pequeñas cantidades de NaOH y HCl. Uso de pH 7,3 como una referencia arbitraria, realice ion hidrógeno titulación en cada una de las muestras como se describe por Tanford 16 para crear curvas de valoración para las soluciones de colágeno nativo, metilados, y succinilada.
  3. Trazar el cambio de pH por volumen de ácido añadido en comparación con el número de iones H + por molécula unida. El rango de pH alto "amino" debe mostrar un cambio en el colágeno succinilado hacia el punto neutro (una pérdida de grupos amina), y el rango de pH bajo "carboxilo" debería mostrar un desplazamiento hacia la izquierda en el colágeno metilado (una pérdida de grupos carboxilo ) y un desplazamiento hacia la derecha en el colágeno succinilado (una ganancia en el grupo carboxilos), en comparación con el colágeno nativo.
  4. Evaluar la eficacia de la reacción de succinilación mediante la determinación del% de grupos amino en el colágeno nativa se sustituye por succinilación utilizando el método colorimétrico del ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBA), siguiendo protocolos estándar 17,18.

5. La fabricación de dispositivos de microfluidos y la siembra de células

  1. Fabricar dispositivos de microfluidos utilizando métodos estándar 9. Utilice réplica de moldeo de PDMS de SU-8 maestros en el silicio definido usando fotolitografía para crear cámaras de cultivo de células de microfluidos con 100 m de altura, 0,4-1,5 mm de ancho, y 1 hasta 10 mm canales largos para el crecimiento celular.
  2. Use un limpiador de plasma para oxidar las superficies del dispositivo y un portaobjetos de vidrio, y luego presione juntos para bonos. Después de esterilizar el dispositivo por la exposición a la luz UV durante al menos 30 min, llenar la cámara con 50 mg / ml de fibronectina en PBS estéril y se incuba a 37 ° C durante 45 min. Sembrar el dispositivo con las células, tales como la rata primaria o hepatocitos humanos, que requieren un gel de colágeno para la estabilización de fenotipo o estado de diferenciación. Utilizamos 20 l de recién aisladas hepatocitos de rata primaria 7,19 o disponibles comercialmente hepatocitos primarios humanos criopreservados sembradas a 14 × 10 6 células / ml por dispositivo.
  3. Permita que las células se unan a 04.06 horas, y luego se lavan a cabo las células no unidas y reemplazar los medios de chapado con medio de crecimiento. Incubar O / N para garantizar la difusión de célula completa y crear una monocapa confluente de células.

6. Capa por capa deposición de colágeno

  1. En una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar, preparar volúmenes suficientes de soluciones de colágeno metilado y succiniladas para 10 aplicaciones de cada solución por dispositivo, así como unos pocos ml de medio. Mantenga las soluciones en hielo. Utilizamos 20 l (10-15 veces el volumen total del dispositivo) de colágeno por capa por dispositivo.
  2. Seratrapando con la solución (policatiónica) metilado, rubor los dispositivos con 20 l de metilado y luego se alternan succinilado soluciones de colágeno, esperando 1 minuto entre cada aplicación. Limpie el dispositivo con un total de 10 veces por solución, que deben tener aproximadamente 20 min. Trabajar rápidamente para minimizar la cantidad de tiempo que las células son sin medios de comunicación.
  3. Observe colágeno acumular lentamente a la entrada / salida en función de su tamaño. Si la resistencia a los aumentos de flujo de fluidos, a eliminar el dispositivo una vez o dos veces con los medios de comunicación, y luego continuar en capas.
  4. Después de aplicar todas las capas, enjuagar el dispositivo dos veces con medio fresco y volver a la incubadora. Dependiendo del tipo celular, los cambios morfológicos extracelulares inducidas por la matriz, tales como aumento de la polarización en los hepatocitos, deben ser visibles dentro de unas pocas horas.
  5. Preparar los dispositivos representativos para microscopía electrónica de transmisión utilizando métodos estándar 9 para verificar la presencia de una matriz de colágenomontaje en la parte superior de las células cultivadas.

7. Estabilización del fenotipo celular y función

  1. Image la morfología celular, la viabilidad, y la polaridad usando métodos estándar para el tipo de célula. Para los hepatocitos, recoger imágenes de más de 14 días mediante microscopía de fase, la tinción LIVE / DEAD para la viabilidad, y el tinte CMFDA para polarización apical para demostrar los efectos de la deposición de colágeno.
  2. Para la morfología celular, lave el dispositivo través de la entrada mediante una pipeta con 20 l de PBS para enjuagar, inyectar 20 l de PBS, y la imagen el dispositivo mediante microscopía de contraste de fase.
  3. Para la tinción LIVE / DEAD, lave el dispositivo a través de la entrada mediante una pipeta con 20 l de PBS para enjuagar, inyectar 20 l de solución de tinción LIVE / DEAD con DAPI preparó siguiendo las instrucciones del fabricante, se incuba durante 30 minutos a 37 ° C, enjuague el dispositivo de nuevo con 20 l de PBS, y la imagen el dispositivo mediante microscopía de fluorescencia.
  4. Para canali bilistinción culi, a eliminar el dispositivo a través de la entrada mediante una pipeta con 20 l de PBS para enjuagar, inyecte 20 l de 2 solución de tinción M CMFDA con DAPI preparados según las instrucciones del fabricante, se incuba durante 30 minutos a 37 ° C, enjuague el dispositivo nuevo con 20 l de PBS, y la imagen al dispositivo utilizando microscopía de fluorescencia.
  5. Recoge los medios gastados y medir productos metabólicos celulares en los puntos de tiempo apropiados durante la duración cultivo para determinar la función de las células. Para los hepatocitos, medir la cantidad de albúmina y urea en los medios gastados.
  6. Realizar análisis funcionales de punto final en las propias células, tales como la evaluación de los niveles de actividad de la enzima, tinción de anticuerpos, o análisis de ARN. Para los hepatocitos, inducir y medir la actividad de las enzimas del citocromo P450 o la fase II de conjugación enzima glutatión S-transferasa.

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Representative Results

Colágeno nativo se puede modificar mediante la metilación y la succinilación para crear soluciones de colágeno policatiónicos y polianiónicos para su uso en la deposición de capa por capa. Succinilación modifica los grupos -amino de colágeno nativo con grupos succinilo, y la metilación modifica los grupos carboxilo del colágeno nativo con un grupo metilo (Figura 1A). Estas modificaciones de las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína colágeno alteran las curvas de valoración del pH para las soluciones. Succinilación reduce el número de grupos amino y aumenta el número de grupos carboxilo, mientras que la metilación no tiene efecto sobre los grupos amino y reduce el número de grupos carboxilo, en comparación con colágeno nativo (Figura 1B). Estas modificaciones alteran las características de carga de las moléculas de colágeno. Succinilación elimina grupos cargados positivamente y los reemplaza con grupos cargados negativamente, y la metilación elimina grupos cargados negativamente (Figura 1C </ strong>).

Deposición de capa por capa de las soluciones de colágeno metilado y succinilados (COL LBL) crea un conjunto de matriz de colágeno ultrafina en la parte superior de superficies cargadas, tales como las células (Figura 2A). Hepatocitos primarios sembradas sobre el vidrio recubiertos de fibronectina dentro de un dispositivo de microfluidos (Figura 2B) se pueden recubrir con un conjunto de matriz de colágeno tales puramente (Figura 2C). La deposición de 10 bicapas en las células crea un espesor de capa de colágeno de aproximadamente 140 nm (Figura 2D).

La capa de ensamblaje de colágeno ultrafina depositado mediante la técnica COL LBL estabiliza hepatocitos primarios por más de 14 días en dispositivos de microfluidos. Los hepatocitos sin una cubierta matriz superior pierden su fenotipo diferenciado, contrato, y levantar de la superficie de los dispositivos de microfluidos en el tiempo (Fig. 3A-C). En contraste, los hepatocitos cubiertos con un colágeno manteni asamblea ultrafinon su morfología diferenciada y la polarización de más de 14 días (Figura 3D-F). La viabilidad de las células se mantuvo a mayor que 90% (Figura 3G-I). Además, la polarización de los hepatocitos tratados con COL LBL aumentó con el tiempo, mostrando el desarrollo de una red canalicular biliar apical (Figura 3J-L).

Además de la viabilidad celular, la morfología, y la polarización, la técnica COL LBL recupera y estabiliza la función de los hepatocitos primarios en niveles similares a técnicas estándar para las células en placas. La secreción de la albúmina por los hepatocitos es baja inmediatamente después de la siembra, y sigue siendo baja a menos que las células son inducidas a polarizar a través de una cubierta matriz. Después del tratamiento COL LBL, la secreción de albúmina por las los hepatocitos aumenta a lo largo de 8-10 días antes de estabilizarse (Figura 4A). La producción de urea es alta inmediatamente después de la siembra de células y disminuye con el tiempo en las células nOT cubierto con una matriz, la producción de urea se estabiliza después de 8-10 días en hepatocitos estabilizadas con COL LBL (Figura 4B). Citocromo P450 (CYP) expresión de la enzima en respuesta a estímulos es una función especializada de los hepatocitos. La inducción de CYP1A1 en hepatocitos en respuesta a 3-metilcolantreno se recuperó y se estabiliza hasta 14 días por el tratamiento COL LBL (Figura 4C).

Figura 1
Figura 1. Rata soluciones de colágeno de la cola fueron modificados químicamente para crear neta positiva o neta carga negativa soluciones de polímeros. (A) representaciones esquemáticas de las reacciones de metilación y succinilación que modifican los grupos carboxilo y amino varepsilon, respectivamente. (B) derivados curva de titulación de hidrógeno que muestran los cambios en los números relativos de iones H + necesarios para alterar pH de la solución después de colmodificación lagen. (C) Los cargos netos (media ± DE) de las soluciones de colágeno modificados calculados a partir de la H + cambios en (B) normalizados al colágeno nativo. MC: colágeno metilado. SC: colágeno succinilado. AA: residuos de aminoácidos. Vuelva a imprimir con permiso de 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. deposición capa por capa de soluciones de colágeno modificado creó un conjunto de matriz de colágeno ultrafina en la parte superior de los hepatocitos. (A) Representación esquemática de los hepatocitos sembrados en fibronectina en un microdispositivo y se incubaron con la alternancia de soluciones de colágeno metilado y succinilados. TEM secciones transversales de representante (20 células examinadas por grupo) CON(C) hepatocitos control (B) y COL-LBL tratado después de 2 días de cultivo. Flechas: capa de colágeno LBL. Barra de escala:. 2 micras espesor de la capa (D) COL LBL (media ± DE) por célula medido a partir de imágenes de TEM (n = 20 células de 4 dispositivos). Modificado de 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. La técnica COL LBL mantiene la morfología de los hepatocitos, la viabilidad y la polarización en microdispositivos más de 14 días en cultivo. Hepatocitos sin capa superior en microdispositivos (control negativo) Contrato y levante la superficie a través del tiempo (A-C). LBL deposición de colágenos modificados mantiene la morfología de los hepatocitos (D-F) y VIABility (G-I) en microdispositivos más de 14 días. CMFDA es un marcador de células genérico que permanece en el citoplasma de los hepatocitos no polarizados (J). Con el tiempo, el desarrollo de canalículos biliares puede ser visto por la excreción del fluoróforo en espacios canaliculares (K) que se desarrollan alrededor de las células en el tiempo (L). Imagen barra de escala: 100 m. Recuadro barra de escala: 50 micras. Modificado de 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure4
Figura 4. COL LBL estabiliza albumin hepatocitos y las secciones de urea y la actividad CYP más de 14 días en dispositivos de microfluidos. (A) de albúmina de la secreción por los hepatocitos en COL LBL comenzó bajo y aumentó con el tiempo uasta llegar a una meseta en el día 10. (B) Urea secreción por los hepatocitos COL LBL disminuido con el tiempo hasta llegar a una meseta en el día 10. (C) La inducción de la actividad CYP1A fue baja en el día 2, pero aumentó significativamente en el día 7, una nivel que se mantuvo hasta el día 14. Media ± SEM; COL LBL: hepatocitos cultivados después LBL depósito de colágeno; NoTop: hepatocitos cultivados sin capa de matriz superior; n = 6-8 dispositivos. Modificado de 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Ultrafinos conjuntos de colágeno puro pueden ser depositados en las células cargadas o superficies de materiales utilizando deposición de capa por capa de colágenos modificados. Los resultados de este estudio demuestran que la metilación y succinilación de colágeno nativo crear soluciones de colágeno policatiónicos y polianiónicos (Figura 1) que puede ser utilizado con la técnica de capa por capa para depositar conjuntos de matriz de colágeno ultrafinas sobre las células (Figura 2) u otro cargadas superficies de materiales. Tales capas de matriz ultrafinas pueden estabilizar la morfología, viabilidad, y la polarización de las células tales como los hepatocitos (Figura 3), después de la siembra en dispositivos de microfluidos, así como su función (Figura 4).

Para la deposición con éxito de capas de colágeno ultra fino, las reacciones de modificación que crean los colágenos metilados y succinilados son críticos. Debido a que la reacción de metilación grupo carboxilo no es favorable, lareacción de metilación de colágeno debe llevarse a cabo en metanol acidificado para conducir la reacción hacia delante, basado en el principio de Le Chatelier. Por lo tanto, es importante para eliminar todo el exceso de agua del colágeno después de la precipitación pH antes de disolver el colágeno precipitado en el metanol acidificado con el fin de aumentar la eficacia de la reacción. Para la reacción de succinilación, manteniendo el pH de la solución por encima de 9, mientras que la adición de la anhídrido succínico en acetona es crítica. La monitorización continua del pH y la adición lenta de la solución de acetona anhídrido succínico son útiles para asegurar una reacción eficiente. Durante la deposición capa por capa, es crítico para minimizar el tiempo que las células van sin medios de comunicación. El procedimiento para 10 bicapas toma aproximadamente 20 minutos, que es casi tan larga como la mayoría de las células deben ser, sin medios de comunicación fuera de la incubadora. Si más de 10 bicapas deben depositarse, descansar las células en los medios de comunicación en una incubadora durante 3-4 horas entre colladeposiciones generación para garantizar la salud de las células. En el otro extremo, demasiado pocas capas no serán eficaces en el mantenimiento de la morfología celular. En nuestras pruebas, 3 capas no mantuvieron la morfología celular, mientras que 10 capas hicieron.

Varios se pueden hacer modificaciones a los procedimientos para solucionar problemas. El tiempo y la temperatura de la reacción de metilación se pueden variar si surgen problemas. Por ejemplo, la disminución de la temperatura de reacción a 4 ° C y aumentando el tiempo de 7 días puede aumentar la eficiencia. También, dependiendo de la extensión de la polimerización durante la extracción pH, el colágeno a veces disolver completamente en el metanol acidificado durante la reacción de metilación. Si esto ocurre, añadir 10 M NaOH para llevar el pH hasta 9-10 después de la reacción se ha completado con el fin de precipitar el colágeno de modo que se puede sedimentó durante el paso siguiente. Mientras que la aplicación de la deposición capa por capa en dispositivos de microfluidos, pequeños canales o puertos pueden convertirse en clogged con colágeno, indicado por un aumento en la resistencia fluídica dispositivo. Lavado del dispositivo con medio fresco debe eliminar cualquier bloqueo, permitiendo la deposición para continuar.

La deposición de colágeno manual de la capa por capa, como se describe aquí es una limitación en términos de la escala y la automatización de dispositivos de microfluidos. Sin embargo, esta técnica es compatible con el hardware de microfluidos estándar, incluidas las válvulas y bombas que podrían ser utilizados para automatizar la técnica y preparar matrices de dispositivos a la vez. Otra limitación de esta técnica para uso en cultivo en placa es que requiere una cantidad relativamente grande de colágeno nativo. Para la aplicación de microfluidos, los volúmenes de colágenos metilados y succinilada se pueden usar para crear capas de colágeno ultrafinas en muchos dispositivos. Con cultivo en placa de tejido estándar, por otra parte, los volúmenes requeridos para recubrir los pocillos se vuelven más prohibitivo con el aumento de tamaño también.

Esta capa-técnica por capa para la deposición de capas ultradelgadas matriz de colágeno podría desarrollarse más mediante el uso de modificaciones alternativas o funcionales, así como mediante la creación de múltiples capas de células separadas por los conjuntos de matriz finos. Aunque se utilizaron las reacciones de modificación cadena lateral de aminoácido relativamente simples de metilación y succinilación aquí, las reacciones alternativas o adicionales podrían utilizarse en lugar con el fin de crear colágenos funcionalizados. Las cadenas laterales funcionalizadas aún deben producir proteínas con cargas positivas y negativas global neta, pero tales funcionalización pueden ser útiles para una variedad de aplicaciones.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

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