Protocol
1. Préparation de la solution de collagène natif soluble
- Préparer ou acheter 200 mg de acidifiés, soluble, collagène de type I à partir de queues de rats à 1-3 mg / ml en utilisant des protocoles d'isolement classiques, tels que rapportés par Piez et al. 15
- L'échelle de la quantité de matière de départ par rapport au volume final souhaité de solutions de collagène modifiés. Environ 25 à 30 ml de faire méthyle et de 25 à 30 ml de solutions de collagène succinylés, chacun à 3 mg / ml, à partir de 200 mg de collagène natif soluble.
2. Collagène méthylation
- Diluer 100 mg de la, acidifié (pH 2-3) solution native de collagène à une concentration de 0,5 mg / ml avec de la glace de l'eau stérile froide et maintenir la solution sur de la glace pour empêcher la gélification.
- Ajuster le pH de la solution de collagène à 10/09 avec quelques gouttes de NaOH 1 N et on agite à température ambiante pendant 30 min. Observez le précipité de collagène, entraînant la solution à devenir trouble. Isoler le précipité de collagène solution à 3000 g pendant 25 min. Un précipité clair, gel doit être visible dans le fond des tubes. Aspirer et éliminer correctement le liquide surnageant.
- Remettre en suspension le précipité de collagène dans 200 ml de méthanol avec HCl 0,1 N et laisser la réaction de méthylation de se produire avec agitation à température ambiante pendant 4 jours. Le collagène ne se dissout pas, mais devrait se briser en très petits morceaux visibles qui feront la solution trouble.
- Après la méthylation, centrifugeuse la solution à 3000 g pendant 25 min pour sédimenter le collagène méthylé. Aspirer et éliminer le surnageant de méthanol acidifié.
- On dissout le collagène méthylé dans 25 ml de PBS stérile, ce qui donne une concentration d'environ 3 mg / ml, avec pipetage répété, et filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 60 pm. Ajuster le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant 20 ul incréments de NaOH 1 N.
- Évaluer la Concentration de la solution en utilisant un collagène de rat commerciale kit ELISA ou kit de dosage hydroxyproline. Diluer la solution à 3 mg / ml avec du PBS stérile.
- Stériliser la solution de collagène méthylé en le transférant à une bouteille en verre avec un bouchon à vis, marcottage soigneusement 3 ml de chloroforme au fond de la bouteille, laissez la bouteille pour régler O / N à 4 ° C, puis de façon aseptique Retirez et rangez les couche supérieure, qui est le collagène méthylé.
- Conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation dans un mois.
3. Le collagène Succinylation
- Diluer les 100 autres mg de la, acidifié (pH 2-3) solution native de collagène à une concentration de 0,5 mg / ml avec de la glace de l'eau stérile froide et maintenir la solution sur de la glace pour empêcher la gélification.
- Ajuster le pH de la solution de collagène à 10/09 avec quelques gouttes de NaOH 1 N et on agite à température ambiante pendant 30 min. Le collagène devrait précipiter, entraînant la solution à devenir trouble.
- Dissoudre 40 mg de Succinic anhydride (0,4 mg par mg de collagène) dans 10 ml d'acétone (20/01 ème volume de la solution de collagène). Lentement (environ 0,5 ml en incréments) ajouter à ce mélange la solution de collagène sous agitation tout en contrôlant en continu le pH. Maintenir le pH au-dessus de 9,0 par addition de 1 ou 2 gouttes de NaOH 1 N, le pH se rapproche comme 9,0.
- Poursuivre l'agitation à température ambiante pendant 120 min après l'addition de l'ensemble de l'anhydride succinique dans de l'acétone. Observez la solution à devenir clair que le collagène succinylé dissout. Contrôler régulièrement le pH pour qu'il reste au-dessus de 9,0.
- Ajuster le pH de la solution à 4,0 avec 20 ul de incréments de HCl 1 N. Observez la solution trouble à nouveau, comme le collagène succinylé précipite.
- Après la succinylation, centrifugeuse la solution à 3000 g pendant 25 min pour sédimenter le collagène succinylé. Aspirer et éliminer le surnageant acidifié avec l'anhydride succinique qui n'a pas réagi.
- Dissoudre le collagène succinylédans 25 ml de PBS stérile, ce qui donne une concentration d'environ 3 mg / ml, avec pipetage répété, et filtrer la solution à travers un tamis cellulaire de 60 pm. Ajuster le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant 20 ul incréments de NaOH 1 N.
- Évaluer la concentration de la solution en utilisant un collagène rat commerciale kit ELISA ou kit de dosage hydroxyproline. Diluer la solution à 3 mg / ml avec du PBS stérile.
- Stériliser la solution de collagène succinylé en le transférant à une bouteille en verre avec un bouchon à vis, marcottage soigneusement 3 ml de chloroforme au fond de la bouteille, laissez la bouteille pour régler O / N à 4 ° C, puis de façon aseptique Retirez et rangez les couche supérieure, qui est le collagène succinylé.
- Conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation dans un mois.
4. Vérification du collagène Modifications
- Préparer des échantillons de 1 ml de chacune des solutions natives, méthylés, et collagène succinylé et diluer à une concntration de 0,1 mg / ml avec de l'eau pure stérile pour le titrage des ions hydrogène. Diluer le tampon d'au moins 1000 fois par dialyse contre de l'eau à travers une coupure de 10 kDa membraneusing 3 changements de solution pendant au moins 4 heures chacune.
- Ajuster le pH des solutions à 7,3 avec de petites quantités de NaOH et HCl. Utilisation de pH 7,3 en tant que référence arbitraire, effectuer le titrage d'ions hydrogène sur chacun des échantillons, comme décrit par Tanford 16 pour créer des courbes de titration pour les solutions natives, méthylés, et collagène succinylé.
- Tracer la variation de pH par volume d'acide ajoutée par rapport au nombre de H + ions lié par molécule. Le pH élevé "amino" gamme devrait montrer un changement dans le collagène succinylé vers le point neutre (une perte de groupes amines), et le faible pH "carboxyle" gamme devrait montrer un décalage vers la gauche dans le collagène méthylé (une perte de groupes carboxyle ) et un déplacement vers la droite dans le collagène succinylé (un gain en groupe carboxyles), par rapport au collagène natif.
- Évaluer l'efficacité de la réaction de succinylation en déterminant le% de groupes amino dans le collagène natif remplacés par succinylation en utilisant l'acide 2,4,6-trinitrobenzène (TNBA) Méthode colorimétrique, suivant des protocoles standard 17,18.
5. fabrication de dispositifs microfluidiques et la cellule de semis
- Fabriquer des dispositifs microfluidiques en utilisant des procédés standard de 9. Utilisation réplique moulage de PDMS de SU-8 sur silicium maîtres définis par photolithographie microfluidiques pour créer des chambres de culture cellulaire avec 100 um de hauteur, 0,4-1,5 mm de large, et 1 à 10 mm de long des canaux pour la croissance cellulaire.
- Utilisez un nettoyeur à plasma pour oxyder les surfaces de l'appareil et une lame de verre, puis appuyez ensemble pour obligataire. Après stérilisation du dispositif par exposition à la lumière UV pendant au moins 30 min, remplir la chambre avec 50 ug / ml de fibronectine dans du PBS stérile et incuber à 37 ° C pendant 45 min. Initialiser le dispositif avec des cellules de rat, telles que les hépatocytes humains primaires ou qui nécessitent un gel de collagène pour la stabilisation du phénotype ou l'état de différenciation. Nous utilisons 20 pi d'hépatocytes primaires de rat fraîchement isolés 7,19 ou disponibles dans le commerce des hépatocytes humains primaires cryoconservés ensemencées à 14 × 10 6 cellules / ml par appareil.
- Laisser les cellules se fixer pendant 4-6 heures, puis lavent cellules seules et remplacent les milieux d'étalement avec les médias de la croissance. Incuber O / N pour assurer la pleine étalement cellulaire et de créer une monocouche confluente de cellules.
6. couche par couche de collagène Deposition
- Dans une hotte à flux laminaire de culture de tissu, préparer des volumes suffisants de solutions de collagène dénaturé et succinylées pour 10 applications de chaque solution par dispositif, ainsi que quelques ml de milieu. Conserver les solutions sur la glace. Nous utilisons 20 pi (10-15 fois le volume total du dispositif) de collagène par couche par appareil.
- Êtreégrenage avec le (polycationique) solution méthylé, suppléant rinçage des appareils avec 20 pi de méthyle et puis succinylée solutions de collagène, en attendant 1 min entre chaque application. Rincer le dispositif un total de 10 fois par la solution, ce qui devrait prendre environ 20 min. Travaillez rapidement pour minimiser la quantité de temps les cellules sont sans médias.
- Observez collagène accumuler lentement à l'entrée / sortie en fonction de sa taille. Si la résistance à l'écoulement fluide augmente, rincer l'appareil une ou deux fois avec les médias, et puis continuer stratification.
- Après l'application de toutes les couches, rincer l'appareil deux fois avec un milieu frais et de revenir à l'incubateur. Selon le type cellulaire, les changements morphologiques induits par la matrice extracellulaire, tels que renforcement de polarisation dans les hépatocytes, doivent être visibles au bout de quelques heures.
- Préparer dispositifs représentatifs des types de microscopie électronique à transmission en utilisant des procédés standard de 9 pour vérifier la présence d'une matrice de collagèneassemblage au-dessus des cellules cultivées.
7. Stabilisation de phénotype cellulaire et fonction
- L'image de la morphologie cellulaire, la viabilité et la polarité en utilisant des procédés standard pour le type de cellule. Pour les hépatocytes, recueillir des images de plus de 14 jours en utilisant la microscopie de phase, coloration, LIVE / DEAD pour la viabilité, et CMFDA colorant pour la polarisation apicale de démontrer les effets des dépôts de collagène.
- Pour la morphologie des cellules, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS pour rincer, injecter 20 pi de PBS, et l'image du dispositif utilisant microscope à contraste de phase.
- Pour la coloration, LIVE / DEAD, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS à rincer, injecter 20 pi de solution de coloration, LIVE / DEAD avec DAPI préparés en suivant les instructions du fabricant, incuber pendant 30 min à 37 ° C, rincer le Dispositif de nouveau avec 20 pi de PBS, et l'image du dispositif utilisant la microscopie à fluorescence.
- Pour la bile Canalicoloration Culi, rincer l'appareil à travers l'entrée à la pipette avec 20 pi de PBS pour rincer, injecter 20 pi de 2 solution de coloration uM CMFDA avec DAPI, préparées conformément aux instructions du fabricant, incuber pendant 30 min à 37 ° C, rincer l'appareil de nouveau avec 20 ul de PBS, et l'image de l'appareil en utilisant la microscopie de fluorescence.
- Recueillir les milieux épuisés et mesurer les produits métaboliques cellulaires à des points de temps appropriés pendant la durée de la culture afin de déterminer la fonction des cellules. Pour les hépatocytes, de mesurer la quantité d'albumine et de l'urée dans les milieux épuisés.
- Effectuer des analyses fonctionnelles de point final sur les cellules elles-mêmes, comme l'évaluation des niveaux d'enzymes d'activité, la coloration des anticorps, ou l'analyse de l'ARN. Pour les hépatocytes, induire et mesurer les activités enzymatiques du cytochrome P450 ou la phase II conjugaison enzyme glutathion-S-transférase.
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Representative Results
Le collagène natif peut être modifié en utilisant la méthylation et succinylation pour créer des solutions de collagène polycationiques et polyanioniques pour une utilisation dans le dépôt couche par couche. Succinylation modifie les groupes de collagène natif e-amino avec des groupes succinyle, et la méthylation modifie les groupes carboxyle du collagène natif avec un groupe méthyle (figure 1A). Ces modifications de la protéine de collagène chaînes latérales d'acides aminés modifier les courbes de titrage pH des solutions. Succinylation réduit le nombre de groupes amino et augmente le nombre de groupes carboxyle, alors que la méthylation est sans effet sur les groupes amino et réduit le nombre de groupes carboxyle, par rapport au collagène natif (figure 1B). Ces modifications changent les caractéristiques de charge des molécules de collagène. Succinylation supprime groupes chargés positivement et les remplace par des groupes chargés négativement, et la méthylation supprime groupes chargés négativement (figure 1C </ strong>).
Dépôt couche par couche de la solution de collagène dénaturé et succinylées COL (LBL) crée une matrice de collagène ultra-mince montage sur des surfaces chargées, telles que des cellules (figure 2A). Des hépatocytes primaires ensemencées sur de la fibronectine verre revêtu à l'intérieur d'un dispositif microfluidique (figure 2B) peuvent être revêtues d'un tel ensemble de matrice purement collagène (figure 2C). Le dépôt de cellules sur 10 bicouches crée une épaisseur de couche de collagène d'environ 140 nm (Figure 2D).
La couche ultra-mince d'assemblage de collagène déposé en utilisant la technique COL LBL stabilise hépatocytes primaires depuis plus de 14 jours dans des dispositifs microfluidiques. Hépatocytes sans une couverture de matrice supérieure perdent leur phénotype différencié, contrat, et soulever hors de la surface de dispositifs microfluidiques au fil du temps (Fig. 3A-C). En revanche, les hépatocytes couverts avec un ultra-mince collagène entretenir cet ensemblen et leur morphologie différenciée polarisation de plus de 14 jours (Figure 3D-F). La viabilité des cellules a été maintenue à plus de 90% (figure 3G-I). En outre, la polarisation des hépatocytes traités avec COL LBL a augmenté au fil du temps, montrant le développement d'un réseau canaliculaire biliaire apical (Figure 3J-L).
En plus de la viabilité cellulaire, la morphologie et la polarisation, la technique COL LBL récupère et stabilise la fonction des hépatocytes primaires à des niveaux similaires à des techniques standard pour les cellules dans des plaques. La sécrétion d'albumine par les hépatocytes est faible immédiatement après placage, et reste faible, sauf si les cellules sont induites à polariser par un revêtement de matrice. Après traitement COL LBL, la sécrétion d'albumine par les hépatocytes augmente avec 8-10 jours avant de se stabiliser (figure 4A). La production d'urée est élevée immédiatement après l'ensemencement des cellules et diminue au fil du temps dans les cellules nOT recouvert d'une matrice, la production d'urée se stabilise après 8-10 jours dans les hépatocytes stabilisées avec COL LBL (figure 4B). Le cytochrome P450 (CYP) d'expression de l'enzyme en réponse à des stimuli est une fonction spécialisée des hépatocytes. L'induction de CYP1A1 dans les hépatocytes en réponse à la 3-méthylcholanthrène a été récupéré et est stabilisé jusqu'à 14 jours de traitement par le COL LBL (Figure 4C).
Figure 1. Rat solutions queue de collagène ont été modifiés chimiquement pour créer nette positive ou négative nette facturés solutions de polymères. (A) des représentations schématiques des réactions de méthylation et succinylation qui modifient des groupes carboxyle et e-amino, respectivement. (B) des dérivés de l'hydrogène titrage courbe montrant des changements dans le nombre relatif de ions H + nécessaires pour modifier pH de la solution après la colmodification Lagen. (C) Les charges nettes (moyenne ± écart type) des solutions de collagène modifiés à compter de la H + décalages dans (B) normalisés au collagène natif. MC: collagène méthylé. SC: collagène succinylé. AA: résidus d'acides aminés. Re-print avec la permission de 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. dépôt couche par couche de solutions de collagène modifiés créé un ensemble de matrice de collagène ultra-mince sur le dessus des hépatocytes. (A) Représentation schématique de la fibronectine sur les hépatocytes ensemencés sur un microdispositif et incubées avec une alternance de solutions de collagène dénaturé et succinylées. TEM sections des représentant (20 cellules examinées par groupe) concontrôle (B) et COL LBL-traitée (C) hépatocytes après 2 jours de culture. Flèches: LBL couche de collagène. Barre d'échelle:. 2 um d'épaisseur de la couche (D) COL LBL (moyenne ± écart type) par cellule mesurée à partir d'images TEM (n = 20 cellules de 4 appareils). Modifié à partir de 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La technique COL LBL maintenu hépatocytes morphologie, la viabilité et la polarisation dans microdispositifs de plus de 14 jours dans la culture. Les hépatocytes sans couche supérieure dans microdispositifs contrat (contrôle négatif) et soulevez la surface au fil du temps (A-C). LBL dépôt de collagènes modifiés maintient hépatocytes morphologie (D-F) et viabilité (G-I) dans microdispositifs de plus de 14 jours. CMFDA est un marqueur de cellule générique qui reste dans le cytoplasme des hépatocytes non polarisée (J). Au fil du temps, le développement des canalicules biliaires peut être vu par l'excrétion du fluorophore dans des espaces canaliculaires (K) qui se développent autour des cellules dans le temps (L). Image barre d'échelle: 100 um. Encadré barre d'échelle: 50 um. Modifié à partir de 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. COL LBL stabilise hépatocytaire albumine et sections de l'urée et de l'activité de CYP plus de 14 jours dans des dispositifs microfluidiques. (A) sécrétion d'albumine par les hépatocytes dans COL LBL a commencé à faible et augmente avec le temps uusqu'à atteindre un plateau au jour 10. (B) Urée la sécrétion par les hépatocytes COL LBL diminué avec le temps jusqu'à atteindre un plateau au jour 10. (C) L'induction de l'activité de CYP1A était faible au jour 2, mais a augmenté de manière significative au jour 7, une niveau qui a été maintenu jusqu'au jour 14. Moyenne ± SEM; COL LBL: hépatocytes en culture, après LBL dépôt de collagène; NoTop: hépatocytes cultivés sans couche de matrice supérieure; n = 6-8 dispositifs. Modifié à partir de 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ultraminces ensembles de collagène pur peuvent être déposés sur les cellules chargées ou des surfaces de matériaux à l'aide de dépôt couche par couche de collagènes modifiés. Les résultats de cette étude démontrent que la méthylation et succinylation de collagène natif créer des solutions de collagène polycationiques et polyanioniques (figure 1) qui peut être utilisé avec la technique couche par couche à déposer les assemblages de matrice de collagène ultra-minces sur des cellules (figure 2) ou autre chargés surfaces de matériaux. De telles couches ultra-minces de la matrice peuvent stabiliser la morphologie, la viabilité et la polarisation de cellules telles que les hépatocytes (Figure 3), après l'ensemencement dans des dispositifs microfluidiques, ainsi que leur fonction (figure 4).
Pour le dépôt de couches de succès de collagène ultra-minces, les réactions de modification créant les collagènes méthylés et succinylés sont critiques. Parce que la réaction de méthylation d'un groupe carboxyle ne sont pas favorables, leréaction de méthylation de collagène doit être effectuée dans le méthanol acidifié à conduire la réaction directe, basée sur le principe de Le Chatelier. Par conséquent, il est important d'enlever tout excès d'eau du collagène après la précipitation du pH avant la dissolution du collagène précipité dans le méthanol acidifié en vue d'accroître l'efficacité de la réaction. Pour la réaction de succinylation, en maintenant le pH de la solution au-dessus de 9, tout en ajoutant l'anhydride succinique dans de l'acétone est critique. La surveillance continue du pH et lente addition de la solution de l'anhydride succinique d'acétone sont utiles pour assurer une réaction efficace. Lors du dépôt couche par couche, il est essentiel de réduire le temps que les cellules passent sans support. La procédure de 10 bicouches prend environ 20 min, ce qui est à peu près aussi longtemps que la plupart des cellules devrait être sans médias à l'extérieur de l'incubateur. Si plus de 10 bicouches doivent être déposés, reposer les cellules dans des milieux dans un incubateur pendant 3-4 heures entre colladépositions gen pour assurer la santé des cellules. À l'autre extrême, trop peu de couches ne seront pas efficaces dans le maintien de la morphologie des cellules. Lors de nos tests, 3 couches ne maintiennent pas la morphologie des cellules, tandis que 10 couches ont fait.
Plusieurs modifications peuvent être apportées aux procédures pour résoudre les problèmes. Le temps et la température de la réaction de méthylation peuvent être modifiés en cas de problème. Par exemple, en diminuant la température de réaction à 4 ° C et en augmentant le temps de 7 jours peut augmenter l'efficacité. En outre, en fonction du degré de polymérisation lors de l'extraction du pH, le collagène peut parfois se dissoudre complètement dans le méthanol acidifié au cours de la réaction de méthylation. Si cela se produit, ajouter 10 M de NaOH pour amener le pH jusqu'à 10.09 après la réaction est terminée afin de précipiter le collagène de sorte qu'il peut être sédimenté au cours de l'étape suivante. Lors de l'application du dépôt couche par couche dans des dispositifs microfluidiques, de petits canaux ou ports peuvent devenir clogged avec du collagène, indiquée par une augmentation de la résistance du dispositif fluidique. Rinçage du dispositif avec les médias frais devrait supprimer tous les blocages, permettant le dépôt de continuer.
Le dépôt manuel du collagène couche par couche, comme décrit ici est une limitation en termes de mise à l'échelle et l'automatisation des dispositifs microfluidiques. Cependant, cette technique est compatible avec le matériel microfluidique standard, y compris les vannes et les pompes qui peuvent être utilisées pour automatiser la technique et préparer matrices de dispositifs à la fois. Une autre limite de cette technique pour une utilisation dans la culture en forme de plaque est qu'elle nécessite une quantité relativement importante de collagène natif. Pour l'application micro-fluidique, les volumes des collagènes méthylés et succinylés peuvent être utilisés pour créer des couches ultra-minces de collagène dans de nombreux appareils. Avec la culture de la plaque de tissu standard, d'autre part, les volumes nécessaires pour revêtir les puits deviennent plus prohibitifs avec l'augmentation de la taille du puits.
Cette layer-technique sous-couche pour le dépôt de couches ultra-minces de la matrice de collagène pourrait être développée en utilisant des modifications fonctionnelles ou autres, ainsi que par la création de plusieurs couches de cellules séparées par les ensembles de matrice minces. Bien que les réactions de modification de la chaîne latérale relativement simples d'acides aminés de la méthylation et la succinylation ont été utilisés ici, les réactions de substitution ou supplémentaires pourraient être utilisés à la place, afin de créer des collagènes fonctionnalisés. Les chaînes latérales fonctionnalisés doivent encore donnent des protéines avec des charges positives et négatives nettes globales, mais cette fonctionnalisation peuvent être utiles pour une variété d'applications.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
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