Protocol
원주민 수용성 콜라겐 솔루션 1. 준비
- 준비 또는 내가 1-3 밀리그램 / 등 Piez 등에 의해보고 된 표준 격리 프로토콜을 사용하여 ML. (15)에 쥐의 꼬리에서 콜라겐 산성화, 가용성, 유형의 200 mg의 구입
- 변성 콜라겐 용액의 목적하는 최종 부피를 기준으로 출발 물질의 양을 규모. 약 수용성 천연 콜라겐의 200 mg의에서, 3 ㎎ / ㎖에서 25 ~ 30 메틸화 ㎖의 석신 콜라겐 솔루션 25 ~ 30 ml의 각합니다.
2. 콜라겐 메틸화
- 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액을 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관.
- 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 흐린 될 해결책의 원인이 콜라겐 석출물을 관찰한다. 25 분 동안 3,000 × g에서 침전 된 콜라겐 솔루션을 스핀 다운. 분명, 젤 같은 침전물은 튜브의 바닥에서 볼 수 있어야합니다. 대기음이 제대로 뜨는 유체 폐기하십시오.
- 0.1 N HCl을 메탄올 200ml에 침전 된 콜라겐을 재현 탁하고, 메틸화 반응은 4 일 동안 실온에서 교반하면서 발생할 수 있도록. 콜라겐은 용해되지 않지만 솔루션은 흐린 것 아주 작은 볼 수 조각으로 깨지한다.
- 메틸화 후, 원심 분리기 25 분간 3,000 × g에서 용액은 콜라겐 메틸화 펠렛. 대기음이와 산성화 메탄올 뜨는 폐기하십시오.
- 반복적 피펫으로 약 3 ㎎ / ㎖의 농도를 제공 멸균 PBS 25 ㎖에 메틸화 콜라겐을 녹이고 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다.
- the concentratio 평가상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 N. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석.
- 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전송하여 메틸화 된 콜라겐 용액을 소독 병은 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 분리하고 저장하도록 허용 메틸화 콜라겐 상부층.
- 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
3. 콜라겐 Succinylation
- 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액의 다른 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관.
- 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 콜라겐은 흐린되기 위해 용액을 일으키는 석출한다.
- SUC 40 mg의 해산(콜라겐 용액 부피의 1/20 번째)을 아세톤 10ml에 cinic 무수물 (콜라겐 밀리그램 당 0.4 mg)을 얻었다. 천천히 (약 0.5 ml의 단위) 지속적으로 pH를 모니터링하면서 교반 콜라겐 솔루션이 혼합물을 추가합니다. pH가 9.0에 근접함에 1 N NaOH를 1 ~ 2 방울을 첨가하여 pH를 9.0 위를 유지한다.
- 아세톤 숙신산 무수물 모두를 추가 한 후 120 분 동안 실온에서 계속 교반 하였다. 석신 콜라겐이 용해으로 명확하게하는 솔루션을 관찰한다. 정기적으로는 9.0 이상으로 유지하기 위해 pH를 확인합니다.
- 1 N HCl을 20 μL 씩 증분하여 상기 용액의 pH를 4.0으로 조정한다. 석신 콜라겐 침전으로, 다시 흐린 솔루션을 관찰한다.
- succinylation 후, 원심 분리기 25 분 3,000 × g에서 솔루션은 석신 콜라겐 펠렛합니다. 기음은 미 반응 숙신산 무수물로 산성화 뜨는 폐기하십시오.
- 숙시 콜라겐을 녹여멸균 PBS 25 ㎖, 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 피펫 팅을 반복하여, ㎖ / 약 3의 Mg 농도를 제공하고, 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다.
- 상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 농도를 평가한다. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석.
- 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전사함으로써 석신 콜라겐 용액을 소독 병을 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 제거하고 저장하도록 허용 the 석신 콜라겐입니다 상단 층.
- 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
콜라겐 수정 4. 검증
- 1, 기본 메틸화 및 석신 콜라겐 솔루션의 각 1 ㎖의 샘플을 준비하고 진한 희석수소 이온 적정 멸균 순수 ml의 0.1 밀리그램 /의 entration. 또한 적어도 4 시간마다 10 kDa의 컷오프 membraneusing 3 솔루션의 변화를 통해 물에 대한 투석에 의해 버퍼 적어도 1000 배 희석.
- 수산화 나트륨과 염산 소량의 7.3 용액의 pH를 조절합니다. 네이티브 메틸화 및 숙시 콜라겐 솔루션 적정 곡선을 만들 Tanford (16)에 의해 설명 된 바와 같이 임의의 기준으로 pH가 7.3을 사용하여, 각각의 샘플에 수소 이온 적정을 수행한다.
- 산의 볼륨이 결합 된 H + 분자 당 이온의 수 대 추가 당 pH의 변화를 그린다. 높은 산도 "아미노"범위 중성점 향해 석신 콜라겐 시프트 (아민 기의 손실)를 표시해야하고, 낮은 pH "카르복시"범위는 메틸화 콜라겐 좌측 시프트 (카르복실기의 손실을 표시해야 ) 및 석신 콜라겐 우측 시프트 (카르복실기의 이득S), 천연 콜라겐에 비해.
- 표준 프로토콜 17,18 다음, 2,4,6- 트리니트로 산 (TNBA)를 사용하여 비색법에 의해 대체 succinylation 네이티브 콜라겐 아미노기의 %를 결정함으로써 succinylation 반응의 효능을 평가한다.
미세 유체 장치 및 셀 시드 5. 제작
- 표준 방법 (9)를 사용하여 미세 유체 장치를 제조. 100 ㎛, 높이 0.4 ~ 1.5 mm 폭, 세포 성장을위한 긴 채널 1~10mm로 미세 세포 배양 챔버를 만들 포토 리소그래피를 사용하여 정의 실리콘에 SU-8 마스터에서 PDMS의 복제 성형을 사용합니다.
- 장치와 슬라이드 유리의 표면을 산화시키기 위해 플라즈마 세정기를 사용하고 본드 함께 누른다. 적어도 30 분 동안 UV 광에 노출하여 장치를 멸균 한 후, 멸균 PBS 중 50 μg의 / ml의 피브로넥틴을 가진 챔버를 채우고 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 표현형 또는 분화 상태의 안정화를위한 콜라겐 젤을 필요로 같은 차 쥐 또는 인간의 간세포와 같은 세포와 장치를 시드. 우리는 장치 당 14 × 10 6 세포 / ml에 접종 갓 격리 기본 쥐의 간세포 7,19 또는 시판 냉동 보관 차 인간 간세포의 20 μl를 사용합니다.
- 세포가 4-6 시간 동안 부착하고 부착되지 않은 세포를 씻어 내고 성장 매체와 도금 매체를 대체 할 수 있습니다. 확산 전체 셀을 보장하고 세포의 합류 단층을 만들 O / N을 품어.
6. 레이어로 레이어 콜라겐 증착
- 층류 조직 배양 후드에서, 각각의 디바이스 당 용액 10 애플리케이션 메틸화 및 석신 콜라겐 용액의 충분한 양뿐만 아니라 미디어의 몇 MLS 준비. 얼음에 솔루션을 유지합니다. 우리는 장치 레이어 당 콜라겐의 20 μL (10 ~ 15 배의 전체 장치 볼륨)를 사용합니다.
- 있다메틸화 (폴리 양이온) 솔루션 ginning 후 20 메틸화의 μL와 함께 장치를 세척 대체 각 응용 프로그램 사이에 1 분을 기다리고, 콜라겐 솔루션을 숙시. 장치를 약 20 분 소요됩니다 솔루션 당 10 회, 총 플래시합니다. 세포가없는 미디어 아르 시간의 양을 최소화하기 위해 신속하게 작동한다.
- 천천히 그 크기에 따라 입구 / 출구에 축적 콜라겐을 준수하십시오. 유체 흐름에 대한 저항성 증가가 미디어 한두번 장치를 세척 한 경우 축성을 계속한다.
- 모든 층을 적용한 후, 새로운 미디어로 두 번 장치를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 세포 유형에 따라, 그러한 간세포의 향상된 편광 같은 세포 외 기질 - 유도 된 형태 적 변화는, 몇 시간 내에 볼 수 있어야한다.
- 콜라겐 매트릭스의 존재를 확인하기 위해 표준 방법을 사용하여 (9) 투과형 전자 현미경 장치를 준비 대표배양 된 세포의 상단에 조립.
세포 표현형 및 기능 7. 안정화
- 화상 세포 유형에 대한 표준 방법을 사용하여 세포 형태, 생존 및 극성. 간세포를 들어, 콜라겐 침착의 효과를 입증하기위한 정점 편광 위상 현미경에 대한 생존 LIVE / DEAD 염색 및 CMFDA 염료를 사용 14일 위에 이미지를 수집한다.
- 세포 형태에 대해, 린스 PBS 20 μL의, 화상, 위상차 현미경을 사용하여 장치를 주입하기 위해 PBS 20 μL 피펫으로하여 입구를 통해 장치를 세척.
- 라이브 / 죽은 얼룩 들어, 린스 제조업체의 지침에 따라 제조 DAPI와 라이브 / 죽은 염색 용액 20 μl를 주입하는 PBS의 20 μL에 피펫으로 입구를 통해 장치를 세척, 37 ℃에서 30 분 동안 품어, 린스 다시 디바이스 (20)의 PBS μL, 화상 형광 현미경을 사용하여 장치.
- 담즙 날리 들어culi 염색은 제조자의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안 배양하여 제조 DAPI와 2 μM CMFDA 염색 용액 20 μL를, 린스 주입하는 PBS 20 μL로 피펫으로 유입구를 통해 장치를 세척하여 장치를 다시 린스 20 μL의 PBS 및 이미지 형광 현미경을 사용하여 장치.
- 소비 된 매체를 수집하고 세포의 기능을 결정하기 위해 배양 기간 동안 적절한 시점에서 세포 대사의 제품을 측정한다. 간세포를 들어, 소비 된 배지에서 알부민 및 우레아의 양을 측정한다.
- 이러한 평가 효소 활동 수준, 항체 염색, 또는 RNA 분석과 같은 세포 자체에 엔드 포인트 기능 분석을 수행합니다. 간세포를 들어, 유도 및 시토크롬 P450 효소 활동이나 위상 공액 II 효소 글루타티온 S 트랜스퍼를 측정한다.
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Representative Results
네이티브 콜라겐 층별 증착에 사용하기위한 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 만들 메틸화 및 succinylation를 사용하여 수정 될 수있다. Succinylation가 숙시 닐기로 네이티브 콜라겐의 ε 아미노 그룹을 수정하고 메틸화는 메틸기 (도 1a)와 네이티브 콜라겐 카르복실기를 수정한다. 콜라겐 단백질 아미노산 측쇄에 이러한 변형은 용액의 pH에 대한 적정 곡선을 변경. 메틸화는 아미노기에 영향을주지 않으며 카르복실기의 수를 감소하면서 Succinylation은 네이티브 콜라겐 (도 1b)에 비해, 아미노기의 수를 감소시키고, 카르복실기의 수를 증가시킨다. 이러한 변형은 콜라겐 분자의 전하 특성을 변화. Succinylation는 양으로 대전 된 그룹을 제거하고 음전하 단체로 대체하고, 메틸화는 음으로 대전 된 그룹을 제거합니다 (그림 1C </ STRONG>).
메틸화 및 석신 콜라겐 솔루션 (COL LBL)의 계층 별 층 증착은 세포 (그림 2A)로 대전 된 표면 위에 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 생성합니다. 미세 유체 장치 (그림 2B) 내에서 피브로넥틴 코팅 유리에 시드 차 간세포는 이러한 순수 콜라겐 매트릭스 어셈블리 (그림 2C)로 코팅 할 수있다. 세포에 10 이중층의 증착은 약 140 nm의 (그림 2D)의 콜라겐 층 두께를 만듭니다.
COL 요소 LBL 기술을 사용하여 증착 된 얇은 콜라겐 집합 층은 미세 유체 소자에서 14 일 이상 차 간세포를 안정화시킨다. 최고 매트릭스 커버없이 간세포는 차별화 된 표현형, 계약을 잃고, 시간 (그림. 3A-C)을 통해 미세 유체 장치의 표면을 들어 올립니다. 대조적으로, 간세포 초박 콜라겐 어셈블리 maintai 덮여십사일 (그림 3D-F)를 통해 N 그들의 차별화 된 형태와 편광. 세포의 생존율은 90 % 이상 (도 3G-I)로 유지 하였다. 또한, COL LBL 처리 간세포의 편광 혀끝 담도 누소관 네트워크 (도 3J-L)의 발전을 보여주는 시간에 걸쳐 증가시켰다.
세포 생존, 형태, 및 편광 이외에 COL LBL 기술은 복구 및 플레이트에서 세포 용 표준 기술과 유사한 수준에서 일차 간세포의 기능을 안정화시킨다. 간세포에 의한 알부민의 분비 즉시 도금 후 낮고, 세포 매트릭스 커버링 통해 편광 유도하지 않는 한 낮게 유지된다. COL LBL 처리, (그림 4A)를 안정화하기 전에 8~10일을 통해 간세포의 증가에 의한 알부민 분비 후. 우레아 생산 세포 파종 후 즉시 높은 n은 세포에서 시간이지나면서 감소매트릭스 덮여 OT, 우레아 생산 COL LBL (도 4b)로 안정화 간세포 80-10 일 후에 안정화시킨다. 사이토 크롬 P450 (CYP) 자극에 반응하여 효소의 발현은 간세포의 한 전문화 된 기능입니다. 3 methylcholanthrene에 응답하여 간세포에서 CYP1A1의 유도를 복구하고 COL LBL 처리 (그림 4C)에서 14 일까지 안정화되었다.
그림 1. 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션은 화학적으로 positively 그물을 만들기 위해 수정 된 또는 그물에 부정적인 폴리머 솔루션을 충전. (A) 각각 카르복실기 및 ε 아미노 그룹을 수정 succinylation과 메틸화 반응의 개략도. COL 후 용액의 pH를 변경하는데 필요한 H + 이온의 상대적인 수의 변화를 나타내는 (B) 수소 적정 곡선 유도체변형 lagen. (C) 순 전하 네이티브 콜라겐 정규화에 H + 쉬프트로부터 계산 변성 콜라겐 용액 (B)의 (평균 ± SD). MC는 : 콜라겐을 메틸화. SC : 숙시 콜라겐. AA : 아미노산 잔기. 다시 인쇄 (9)의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
변성 콜라겐 솔루션도 2 층별 증착은 간세포의 위에 얇은 콜라겐 매트릭스 조립체를 만들었다. (A) 마이크로 디바이스에 피브로넥틴에 시드 및 메틸화 및 석신 콜라겐 용액을 교대로 배양 간세포의 도식 표현. 대표의 TEM 단면 (그룹 당 검사 20 세포) 콘트롤 (B) 및 COL 배양 2 일 후에 (C)는 간세포를 LBL 처리. 화살표 : LBL 콜라겐 층. 스케일 바 :. TEM 이미지 (N = 4 장치에서 20 세포)에서 측정 한 셀 당 2 μm의 (D) COL LBL 층 두께 (평균 ± SD). (9)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. COL LBL 기술은 간세포없이 최고 마이크로 디바이스의 층 (음성 대조군) 계약. 문화 14 일 동안 마이크로 디바이스에서 간세포의 형태, 생존 능력, 편광을 유지하고 표면 시간에 (A-C)를 들어 올립니다. 콜라겐의 변성 LBL 증착 간세포 형태 (D-F)을 유지하고 viability 십사일 동안 마이크로 디바이스에서 (G-1). CMFDA 비 편광 간세포 (J)의 세포질에 남아 일반적인 세포 마커이다. 시간이 지남에 따라, 담즙 누소관의 개발 시간 (L)을 통해 셀 간 개발 누소관 공간 (K)로 형광의 배설에 의해 알 수있다. 이미지 스케일 바 : 100 μm의. 삽입 된 스케일 바 : 50 μm의. (9)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. COL LBL은 미세 유체 장치를 14 일 동안 간세포 알부민 및 요소 섹션과 CYP 활동을 안정화시킨다. COL LBL의 간세포에 의해 (A) 알부민 분비가 낮은 시작 시간이 증가 U, COL LBL 간세포에 의해 하루 10 (B) 우레아 분비에 고원에 도달 ntil 2 일에서 낮았다 (10) (C) 날에 CYP1A 활동의 유도를 고원에 도달 할 때까지 시간이 감소하지만, 크게 7 일째 증가 하루 14 평균 ± SEM을 통해 유지 수준; COL LBL : 간세포 LBL 콜라겐 증착 후 배양; NoTop : 없음 최고 매트릭스 층 배양 간세포; 여기서 n은 = 6-8 장치. (9)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
얇은 순수 콜라겐 어셈블리 변성 콜라겐의 층별 증착을 이용하여 충전 재료 또는 세포 표면 상에 증착 될 수있다. 이 연구의 결과는 메틸화 네이티브 콜라겐 succinylation 세포 (도 2) 상에 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 증착하기 위해 레이어 - 바이 - 레이어 기술로 사용될 수있다 (도 1) 또는 다른 충전 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 생성 함을 입증 재료 표면. 이러한 초박막 매트릭스 층은 간세포 (도 3), 그 기능뿐만 아니라, 미세 유체 소자에 파종 후 (도 4)으로 세포의 형태, 생존율, 및 편광을 안정화시킬 수있다.
얇은 콜라겐 층의 성공적인 증, 메틸화 및 석신 콜라겐을 생성 개질 반응은 중요하다. 카르복실기 메틸화 반응은 바람직하지 않기 때문에콜라겐 메틸화 반응 르 샤 틀리에의 원리에 기초하여 순방향 반응을 이용시 산성화 메탄올에서 수행되어야한다. 따라서, 반응 효율을 높이기 위해 산성화 메탄올에 침전 된 콜라겐을 용해하기 전에 pH를 침전 후 콜라겐으로부터 모든 과량의 물을 제거하는 것이 중요하다. succinylation 반응 들어 아세톤에 숙신산 무수물을 첨가하면서 9 위에 용액의 pH를 유지하는 것은 중요하다. 산도 및 숙신산 무수물 아세톤 용액을 천천히 첨가의 연속 모니터링은 반응 효율을 보장하는데 도움이된다. 계층 별 층 증착 동안, 세포 매체없이 이동 시간을 최소화하는 것이 중요하다. 10 이중층 절차는 한 대부분의 세포 배양기 외부 미디어없이해야 약 약 20 분 걸립니다. 10 개 이상의 이중층 증착해야하는 경우 COLLA 사이에 3 ~ 4 시간 동안 인큐베이터에서 미디어 세포를 휴식겐 증착은 셀의 상태를 보장한다. 다른 극단에서, 너무 적은 층은 세포 형태 유지에 적용되지 않습니다. 10 층이 한 동안 우리의 테스트에서, 3 층은 세포 형태를 유지하지 않았다.
몇 가지 수정이 문제를 해결하는 절차를 만들 수 있습니다. 문제가 발생하면 시간과 메틸화 반응의 온도는 변화 될 수있다. 예를 들어, 4 ℃로 반응 온도를 감소시키고 효율을 증가 월 7 일의 시간을 증가시킨다. 또한, pH를 추출 동안 중합의 정도에 따라, 콜라겐 때때로 완전히 메틸화 반응 동안 산성화 된 메탄올에 용해된다. 이 경우, 반응이 다음 단계 동안 펠렛 화 될 수 있도록 콜라겐을 침전시키기 위해 완료된 후 pH를 9-10로 손가락을 가지고 10 M NaOH를 추가. 미세 유체 장치의 층별 증착을인가하면서, 작은 채널 또는 포트 (CL)이 될 수있다장치의 유체 저항의 증가에 의해 표시된, 콜라겐 ogged. 신선한 미디어 장치를 비우기 증착을 계속 할 수 있도록, 어떤 방해를 제거해야합니다.
여기에 설명 된대로 층별 콜라겐 침착은 수동 미세 유체 소자의 스케일링 및 자동화 측면에서 제한된다. 그러나,이 기술은 자동화 기술과 동시에 디바이스의 어레이를 제조하는데 사용될 수있는 밸브 및 펌프를 비롯한 표준 미세 하드웨어와 호환된다. 평판 배양에 사용하기위한이 기술의 또 다른 한계는 네이티브 콜라겐 비교적 많은 양을 필요로한다는 것이다. 미세 유체 응용 들어 메틸화 숙시 및 콜라겐의 양이 많은 장치에서 얇은 콜라겐 층을 만드는 데 사용될 수있다. 표준 조직 배양 플레이트에, 다른 한편으로는, 코팅 웰에 필요한 볼륨은 물론 크기를 더 엄청나게 증가하게된다.
이 층 -얇은 콜라겐 기질 층의 증착에 의한 층 기술은 또 다른 대안적인 또는 기능적인 변형을 이용함으로써뿐만 아니라 얇은 매트릭스 조립체로 구분 세포의 여러 층을 생성하여 개발 될 수있다. 메틸화 및 succinylation의 비교적 간단한 아미노산 측쇄 개질 반응은 여기에 사용되었지만, 대체 또는 부가 반응 관능 대신 콜라겐을 생성하기 위해 사용될 수있다. 기능화 측쇄 여전히 순 전반 플러스, 마이너스 전하에 단백질을 수득한다,하지만 그러한 기능화는 다양한 응용에 유용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
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