Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microtissue स्थिरीकरण के लिए microfluidic उपकरणों में परत-दर-परत कोलेजन बयान

Published: September 29, 2015 doi: 10.3791/53078
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

Protocol

मूल निवासी Soluble कोलेजन समाधान के 1. तैयारी

  1. तैयार है या मैं 1-3 मिग्रा / ऐसे piez एट अल द्वारा रिपोर्ट के रूप में मानक अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग, एमएल। 15 पर चूहे की पूंछ से कोलेजन अम्लीय, घुलनशील, प्रकार के 200 मिलीग्राम की खरीद
  2. संशोधित कोलेजन समाधान के अंत में वांछित मात्रा के आधार पर सामग्री शुरू की राशि स्केल। लगभग soluble मूल निवासी कोलेजन की 200 मिलीग्राम से, 3 मिलीग्राम / एमएल पर 25-30 methylated की मिलीग्राम और succinylated कोलेजन समाधान के 25-30 मिलीलीटर, प्रत्येक बनाते हैं।

2. कोलेजन मेथिलिकरण

  1. बर्फ के ठंडे पानी के साथ बाँझ मिलीलीटर 0.5 मिलीग्राम / की एकाग्रता के लिए देशी, अम्लीय (पीएच 2-3) कोलेजन समाधान के 100 मिलीग्राम पतला और जमाना को रोकने के लिए बर्फ पर समाधान रखें।
  2. 1 एन NaOH की कुछ बूंदों के साथ 9-10 कोलेजन समाधान के पीएच को समायोजित करें और 30 मिनट के लिए आरटी पर हलचल। बादल बन का हल है, जिससे कोलेजन वेग का निरीक्षण करें। 25 मिनट के लिए 3,000 × छ पर उपजी कोलेजन समाधान स्पिन। एक स्पष्ट, जेल की तरह वेग ट्यूबों के नीचे में दिखाई जानी चाहिए। महाप्राण और ठीक से सतह पर तैरनेवाला तरल पदार्थ के निपटान के।
  3. 0.1 एन एचसीएल के साथ मेथनॉल के 200 मिलीलीटर में उपजी कोलेजन Resuspend और मेथिलिकरण प्रतिक्रिया 4 दिनों के लिए आरटी पर सरगर्मी के साथ होने की अनुमति देते हैं। कोलेजन भंग नहीं होगा, लेकिन समाधान बादल करना होगा कि बहुत छोटा सा दिखाई अलग टुकड़ों में तोड़ देना चाहिए।
  4. मिथाइलेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूज 25 मिनट के लिए 3,000 × छ पर समाधान methylated कोलेजन गोली। महाप्राण और अम्लीय मेथनॉल सतह पर तैरनेवाला के निपटान के।
  5. दोहराया pipetting के साथ लगभग 3 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता, दे, बाँझ पीबीएस के 25 एमएल में मिथाइल कोलेजन भंग, और एक 60 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर। 1 एन NaOH के 20 μl वेतन वृद्धि का उपयोग 7.3-7.4 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें।
  6. Concentratio आकलनएक वाणिज्यिक चूहे कोलेजन एलिसा किट या हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन परख किट का उपयोग कर समाधान के एन। 3 मिलीग्राम / बाँझ पीबीएस के साथ मिलीलीटर का हल पतला।
  7. ध्यान से बोतल के तल पर क्लोरोफॉर्म के 3 मिलीलीटर लेयरिंग, एक पेंच टोपी के साथ एक कांच की बोतल के लिए यह हस्तांतरण से मिथाइल कोलेजन समाधान जीवाणुरहित, बोतल 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेट, और फिर aseptically हटाने और स्टोर करने की अनुमति methylated कोलेजन है जो ऊपर की परत,।
  8. 1 महीने के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।

3. कोलेजन Succinylation

  1. बर्फ के ठंडे पानी के साथ बाँझ मिलीलीटर 0.5 मिलीग्राम / की एकाग्रता के लिए देशी, अम्लीय (पीएच 2-3) कोलेजन समाधान के अन्य 100 मिलीग्राम पतला और जमाना को रोकने के लिए बर्फ पर समाधान रखें।
  2. 1 एन NaOH की कुछ बूंदों के साथ 9-10 कोलेजन समाधान के पीएच को समायोजित करें और 30 मिनट के लिए आरटी पर हलचल। कोलेजन बादल बन का हल है, जिससे वेग चाहिए।
  3. सफलता के 40 मिलीग्राम भंग(कोलेजन समाधान की मात्रा वें 1/20) एसीटोन के 10 मिलीलीटर में cinic एनहाइड्राइड (कोलेजन की मिलीग्राम प्रति 0.4 मिलीग्राम)। धीरे धीरे (लगभग 0.5 मिलीलीटर वेतन वृद्धि में) लगातार पीएच की निगरानी करते हुए सरगर्मी के साथ कोलेजन समाधान के लिए इस मिश्रण जोड़ें। पीएच 9.0 दृष्टिकोण के रूप में 1 एन NaOH के 1 या 2 बूँदें जोड़कर 9.0 ऊपर पीएच बनाए रखें।
  4. एसीटोन में succinic एनहाइड्राइड के सभी को जोड़ने के बाद 120 मिनट के लिए आरटी पर सरगर्मी जारी रखें। Succinylated कोलेजन घुल के रूप में स्पष्ट बनने के लिए समाधान का निरीक्षण करें। समय-समय पर यह 9.0 से ऊपर बनी हुई है सुनिश्चित करने के लिए पीएच की जाँच करें।
  5. 1 एन एचसीएल के 20 μl वेतन वृद्धि के साथ 4.0 के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें। Succinylated कोलेजन अवक्षेप के रूप में फिर से बादल छाए रहेंगे समाधान का निरीक्षण करें।
  6. Succinylation के बाद, सेंट्रीफ्यूज 25 मिनट के लिए 3,000 × छ पर समाधान succinylated कोलेजन गोली। महाप्राण और unreacted succinic एनहाइड्राइड साथ अम्लीय सतह पर तैरनेवाला के निपटान के।
  7. Succinylated कोलेजन भंगबाँझ पीबीएस के 25 मिलीलीटर, एक 60 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से समाधान दोहराया pipetting के साथ, मिलीग्राम / लगभग 3 मिलीग्राम की एक एकाग्रता दे रही है, और फिल्टर में। 1 एन NaOH के 20 μl वेतन वृद्धि का उपयोग 7.3-7.4 करने के लिए समाधान के पीएच को समायोजित करें।
  8. एक वाणिज्यिक कोलेजन चूहे एलिसा किट या हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन परख किट का उपयोग कर समाधान की एकाग्रता का आकलन करें। 3 मिलीग्राम / बाँझ पीबीएस के साथ मिलीलीटर का हल पतला।
  9. ध्यान से बोतल के तल पर क्लोरोफॉर्म के 3 मिलीलीटर लेयरिंग, एक पेंच टोपी के साथ एक कांच की बोतल के लिए यह हस्तांतरण से succinylated कोलेजन समाधान जीवाणुरहित, बोतल 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेट, और फिर aseptically हटाने और स्टोर करने की अनुमति succinylated कोलेजन है जो ऊपर की परत,।
  10. 1 महीने के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।

कोलेजन संशोधनों के 4. सत्यापन

  1. , देशी methylated, और succinylated कोलेजन समाधान में से प्रत्येक से 1 मिलीलीटर नमूने तैयार है और एक सान्द्र के लिए पतलाहाइड्रोजन आयन अनुमापन के लिए बाँझ शुद्ध पानी के साथ मिलीलीटर 0.1 मिलीग्राम / के entration। Further कम से कम 4 घंटा प्रत्येक के लिए एक 10 केडीए कटऑफ membraneusing 3 समाधान परिवर्तन के माध्यम से पानी के खिलाफ डायलिसिस द्वारा बफर कम से कम 1,000 गुना पतला।
  2. NaOH और एचसीएल की छोटी मात्रा के साथ 7.3 के समाधान के पीएच को समायोजित करें। , देशी methylated, और succinylated कोलेजन समाधान के लिए अनुमापन घटता बनाने के लिए Tanford 16 द्वारा वर्णित के रूप में एक मनमाना संदर्भ के रूप में पीएच 7.3 का उपयोग करना, नमूनों में से प्रत्येक पर हाइड्रोजन आयन अनुमापन प्रदर्शन करते हैं।
  3. एसिड की मात्रा बाध्य एच + अणु प्रति आयनों की संख्या की तुलना में जोड़ा प्रति पीएच में परिवर्तन प्लॉट। उच्च पीएच "अमीनो" सीमा तटस्थ बात की ओर succinylated कोलेजन में एक पारी (अमाइन समूहों में से एक हानि) दिखाना चाहिए, और कम पीएच "कार्बाक्सिल" सीमा methylated कोलेजन में बाई ओर शिफ्ट (carboxyl समूहों का एक नुकसान दिखाना चाहिए ) और succinylated कोलेजन में एक दाहिनी ओर शिफ्ट (carboxyl समूह में एक लाभएस), देशी कोलेजन की तुलना में।
  4. मानक प्रोटोकॉल 17,18 के बाद, 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic एसिड (TNBA) वर्णमिति विधि का उपयोग succinylation द्वारा प्रतिस्थापित मूल निवासी कोलेजन में एमिनो समूहों के% का निर्धारण करके succinylation प्रतिक्रिया की प्रभावकारिता का आकलन करें।

Microfluidic उपकरणों और सेल बोने की 5. निर्माण

  1. मानक तरीकों 9 का उपयोग microfluidic उपकरणों बनाना। 100 माइक्रोन, लंबा 0.4-1.5 मिमी चौड़ा, और सेल के विकास के लिए लंबे समय चैनलों 1-10 मिमी के साथ microfluidic सेल संस्कृति कक्षों बनाने के लिए फोटोलिथोग्राफी का उपयोग कर परिभाषित सिलिकॉन पर SU-8 स्वामी से PDMS की प्रतिकृति मोल्डिंग का प्रयोग करें।
  2. डिवाइस और एक गिलास स्लाइड की सतहों oxidize के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर का प्रयोग करें, और उसके बाद बांड को एक साथ दबाएँ। कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क से डिवाइस स्टरलाइज़ के बाद, बाँझ पीबीएस में 50 माइक्रोग्राम / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ चैम्बर भरें और 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फेनोटाइप या भेदभाव राज्य के स्थिरीकरण के लिए एक कोलेजन जेल की आवश्यकता होती है, जो इस तरह प्राथमिक चूहे या मानव हेपाटोसाइट्स के रूप में कोशिकाओं, के साथ डिवाइस बीज। हम डिवाइस प्रति 14 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर वरीयता प्राप्त हौसले से पृथक प्राथमिक चूहा हेपाटोसाइट्स 7,19 या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध cryopreserved प्राथमिक मानव हेपाटोसाइट्स के 20 μl का उपयोग करें।
  3. कोशिकाओं 4-6 घंटे के लिए देते हैं, और उसके बाद स्वाधीन कोशिकाओं को बाहर धोने और विकास मीडिया के साथ चढ़ाना मीडिया की जगह करने की अनुमति दें। प्रसार के पूर्ण सेल को सुनिश्चित करने और कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer बनाने के लिए हे / एन सेते हैं।

6. परत-दर-परत कोलेजन बयान

  1. एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में, डिवाइस प्रति प्रत्येक समाधान के 10 अनुप्रयोगों के लिए methylated और succinylated कोलेजन के समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में हैं, साथ ही मीडिया के कुछ एमएलएस तैयार करते हैं। बर्फ पर समाधान रखें। हम डिवाइस प्रति परत प्रति कोलेजन के 20 μl (10-15 बार कुल डिवाइस मात्रा) का उपयोग करें।
  2. होनाmethylated (polycationic) समाधान के साथ ओटाई, तो 20 methylated के μl और के साथ उपकरणों निस्तब्धता वैकल्पिक प्रत्येक आवेदन के बीच 1 मिनट इंतजार कर, कोलेजन समाधान succinylated। डिवाइस लगभग 20 मिनट के लिए ले जाना चाहिए जो समाधान के अनुसार 10 बार की कुल फ्लश। कोशिकाओं मीडिया के बिना कर रहे हैं समय की मात्रा को कम करने के लिए जल्दी से काम करते हैं।
  3. धीरे-धीरे उसके आकार पर निर्भर करता है इनलेट / आउटलेट पर जमा कोलेजन का निरीक्षण करें। द्रव का प्रवाह बढ़ता करने के लिए प्रतिरोध, मीडिया के साथ एक या दो बार डिवाइस फ्लश, और तो लेयरिंग जारी है।
  4. सभी परतों के आवेदन करने के बाद, ताजा मीडिया के साथ दो बार डिवाइस कुल्ला और इनक्यूबेटर पर लौटने। सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, इस तरह के हेपाटोसाइट्स में बढ़ाया ध्रुवीकरण के रूप में बाह्य मैट्रिक्स प्रेरित रूपात्मक बदलाव, कुछ ही घंटों के भीतर दिखाई जानी चाहिए।
  5. एक मैट्रिक्स कोलेजन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए मानक तरीकों 9 का उपयोग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रतिनिधि उपकरणों को तैयारसंवर्धित कोशिकाओं के शीर्ष पर विधानसभा।

सेल phenotype और समारोह के 7. स्थिरीकरण

  1. छवि सेल प्रकार के लिए मानक तरीकों का उपयोग सेल आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, और polarity। हेपाटोसाइट्स के लिए, कोलेजन बयान के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए शिखर ध्रुवीकरण के लिए चरण माइक्रोस्कोपी, व्यवहार्यता के लिए लाइव / मृत धुंधला हो जाना, और CMFDA डाई का उपयोग 14 दिन से अधिक छवियों को इकट्ठा।
  2. सेल आकृति विज्ञान के लिए, कुल्ला 20 पीबीएस के μl, और छवि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर डिवाइस इंजेक्षन करने के लिए पीबीएस के 20 μl के साथ पिपेट द्वारा प्रवेश के माध्यम से डिवाइस फ्लश।
  3. लाइव / मृत धुंधला के लिए, कुल्ला निर्माता के निर्देशों का पालन कर तैयार DAPI साथ लाइव / मृत धुंधला समाधान के 20 μl इंजेक्षन करने के लिए पीबीएस के 20 μl के साथ पिपेट द्वारा प्रवेश के माध्यम से डिवाइस फ्लश, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, कुल्ला डिवाइस फिर 20 पीबीएस के μl, और छवि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग डिवाइस के साथ।
  4. पित्त Canali के लिएculi धुंधला, निर्माता के निर्देशों का पालन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते तैयार DAPI साथ 2 माइक्रोन CMFDA धुंधला समाधान के 20 μl, कुल्ला इंजेक्षन करने के लिए पीबीएस के 20 μl के साथ पिपेट द्वारा प्रवेश के माध्यम से डिवाइस निकलवाने के साथ फिर से डिवाइस कुल्ला 20 पीबीएस के μl, और छवि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग डिवाइस।
  5. खर्च मीडिया लीजिए और सेल समारोह का निर्धारण करने के लिए संस्कृति अवधि से अधिक उचित समय बिंदुओं पर सेलुलर चयापचय उत्पादों को मापने। हेपाटोसाइट्स के लिए, खर्च मीडिया में एल्बुमिन और यूरिया की मात्रा को मापने।
  6. इस तरह के आकलन एंजाइम गतिविधि का स्तर, एंटीबॉडी धुंधला, या शाही सेना के विश्लेषण के रूप में कोशिकाओं को खुद पर समापन बिंदु कार्यात्मक विश्लेषण प्रदर्शन। हेपाटोसाइट्स के लिए, प्रेरित और साइटोक्रोम P450 एंजाइम गतिविधियों या द्वितीय चरण विकार एंजाइम glutathione एस ट्रांस्फ़्रेज़ उपाय।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मूल निवासी कोलेजन परत-दर-परत बयान में उपयोग के लिए polycationic और polyanionic कोलेजन समाधान बनाने के लिए मेथिलिकरण और succinylation का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है। Succinylation succinyl समूहों के साथ देशी कोलेजन की ε-एमिनो समूहों को संशोधित करता है, और मेथिलिकरण एक मिथाइल समूह (चित्रा 1 ए) के साथ देशी कोलेजन की carboxyl समूहों संशोधित करता है। कोलेजन प्रोटीन अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला के लिए इन संशोधनों के समाधान के लिए पीएच अनुमापन घटता बदल। मिथाइलेशन एमिनो समूहों पर कोई प्रभाव नहीं है और carboxyl समूहों की संख्या कम कर देता है, जबकि Succinylation मूल निवासी कोलेजन (चित्रा 1 बी) की तुलना में, एमिनो समूहों की संख्या कम कर देता है और carboxyl समूहों की संख्या बढ़ जाती है। इन संशोधनों कोलेजन अणुओं के प्रभारी विशेषताओं को बदल। Succinylation सकारात्मक आरोप लगाया समूहों को निकालता है और नकारात्मक आरोप लगाया समूहों के साथ उन्हें जगह है, और मिथाइलेशन नकारात्मक आरोप लगाया समूहों को हटा (चित्रा 1C </ Strong>)।

Methylated और succinylated कोलेजन समाधान (सीओएल LbL) की परत-दर-परत बयान ऐसी कोशिकाओं (2A चित्रा) के रूप में चार्ज सतहों के शीर्ष पर एक ultrathin कोलेजन मैट्रिक्स विधानसभा बनाता है। एक microfluidic डिवाइस (चित्रा 2 बी) के भीतर फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित गिलास पर वरीयता प्राप्त प्राथमिक हेपाटोसाइट्स इस तरह के एक विशुद्ध रूप से कोलेजन मैट्रिक्स विधानसभा (चित्रा -2) के साथ लेपित किया जा सकता है। कोशिकाओं पर 10 bilayers के बयान के लगभग 140 एनएम (चित्रा 2 डी) के एक कोलेजन परत मोटाई बनाता है।

सीओएल LBL तकनीक का उपयोग कर जमा Ultrathin कोलेजन विधानसभा परत microfluidic उपकरणों में से 14 दिनों के लिए प्राथमिक हेपाटोसाइट्स स्थिर। एक शीर्ष मैट्रिक्स कवर के बिना Hepatocytes उनकी विभेदित फेनोटाइप, अनुबंध खो देते हैं, और समय (छवि। 3 ए-सी) के ऊपर microfluidic उपकरणों की सतह से उठा। इसके विपरीत, हेपाटोसाइट्स एक ultrathin कोलेजन विधानसभा maintai के साथ कवर किया14 दिनों (चित्रा 3 डी-एफ) के ऊपर एन उनकी विभेदित आकृति विज्ञान और ध्रुवीकरण। कक्षों की व्यवहार्यता 90% से अधिक (चित्रा 3 जी-आई) पर बनाए रखा गया था। इसके अलावा, सीओएल LBL के साथ इलाज हेपाटोसाइट्स का ध्रुवीकरण एक शिखर पित्त canalicular नेटवर्क (चित्रा 3J-एल) के विकास को दिखा रहा है, समय के साथ वृद्धि हुई है।

सेल व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान, और ध्रुवीकरण के अलावा, सीओएल LBL तकनीक ठीक नहीं है और प्लेटों में कोशिकाओं के लिए मानक तकनीक के समान स्तर पर प्राथमिक हेपाटोसाइट्स के समारोह में स्थिर। हेपाटोसाइट्स द्वारा एल्बुमिन के स्राव को तुरंत चढ़ाना के बाद कम है, और कोशिकाओं को एक मैट्रिक्स कवर के माध्यम से ध्रुवीकरण करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं, जब तक कम रहता है। सीओएल LBL उपचार, चित्रा (4 क) स्थिर होने से पहले 8-10 दिनों से अधिक हेपाटोसाइट्स बढ़ द्वारा एल्बुमिन स्राव के बाद। यूरिया उत्पादन सेल बोने के तुरंत बाद उच्च है और एन कोशिकाओं में समय के साथ कम हो जाती हैएक मैट्रिक्स के साथ कवर किया, ot यूरिया उत्पादन सीओएल LBL (चित्रा 4 बी) के साथ स्थिर हेपाटोसाइट्स में 8-10 दिनों के बाद स्थिर। साइटोक्रोम P450 (CYP) उत्तेजनाओं के जवाब में एंजाइम अभिव्यक्ति हेपाटोसाइट्स से एक विशेष समारोह है। 3-methylcholanthrene के जवाब में हेपाटोसाइट्स में CYP1A1 की प्रेरण बरामद और कर्नल LBL उपचार (चित्रा 4C) द्वारा 14 दिनों तक स्थिर हो गया था।

चित्र 1
चित्रा 1. चूहे की पूंछ कोलेजन समाधान रासायनिक सकारात्मक शुद्ध बनाने के लिए संशोधित किया गया है या शुद्ध नकारात्मक बहुलक समाधान का आरोप लगाया। (ए) क्रमश: कार्बाक्सिल और ε अमीनो समूहों को संशोधित कि succinylation और मेथिलिकरण प्रतिक्रियाओं के योजनाबद्ध अभ्यावेदन। कर्नल के बाद समाधान पीएच को बदलने की जरूरत एच + आयनों के सापेक्ष संख्या में बदलाव दिखा (बी) हाइड्रोजन अनुमापन वक्र डेरिवेटिवlagen संशोधन। (सी) शुद्ध आरोपों मूल निवासी कोलेजन के लिए सामान्यीकृत में एच + पारियों से गणना की संशोधित कोलेजन समाधान (बी) के (एसडी ± मतलब है)। एम सी: कोलेजन methylated। अनुसूचित जाति: succinylated कोलेजन। ए.ए.: अमीनो एसिड के अवशेष। फिर से प्रिंट 9 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
संशोधित कोलेजन समाधान की चित्रा 2. परत-दर-परत बयान हेपाटोसाइट्स के शीर्ष पर एक ultrathin कोलेजन मैट्रिक्स विधानसभा बनाया। (ए) एक microdevice पर फ़ाइब्रोनेक्टिन पर वरीयता प्राप्त और methylated और succinylated कोलेजन समाधान के साथ बारी incubated हेपाटोसाइट्स की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रतिनिधि के मंदिर पार वर्गों (प्रति समूह की जांच 20 कोशिकाओं) चोरtrol (बी) और कर्नल संस्कृति के 2 दिन बाद (सी) हेपाटोसाइट्स LBL इलाज। तीर: LBL कोलेजन परत। स्केल पट्टी:। मंदिर छवियों (एन = 4 उपकरणों से 20 कोशिकाओं) से मापा सेल प्रति 2 माइक्रोन (डी) सीओएल LBL परत मोटाई (एसडी ± मतलब है)। 9 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. सीओएल LBL तकनीक Hepatocytes कोई शीर्ष microdevices में परत (नकारात्मक नियंत्रण) के अनुबंध के साथ। संस्कृति में 14 दिनों से अधिक microdevices में hepatocyte आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, और ध्रुवीकरण बनाए रखा और सतह समय के साथ (ए सी) लिफ्ट बंद। संशोधित कोलेजन की LBL बयान hepatocyte आकृति विज्ञान (डी-एफ) और viab रखता हैबड़प्पन 14 दिनों से अधिक microdevices में (जी आई)। CMFDA गैर ध्रुवीकरण हेपाटोसाइट्स (जे) की कोशिका द्रव्य में रहता है कि एक सामान्य कोशिका मार्कर है। समय के साथ, पित्त canaliculi के विकास के समय (एल) के साथ कोशिकाओं के आसपास है कि विकास canalicular रिक्त स्थान (कश्मीर) में fluorophore के उत्सर्जन के द्वारा देखा जा सकता है। छवि पैमाने पर पट्टी: 100 माइक्रोन। इनसेट पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन। 9 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure4
चित्रा 4. सीओएल LBL microfluidic उपकरणों में 14 दिनों से अधिक hepatocyte एल्बुमिन और यूरिया वर्गों और CYP गतिविधि स्थिर। सीओएल LBL में हेपाटोसाइट्स द्वारा (ए) Albumin स्राव कम करना शुरू कर दिया है और समय के साथ वृद्धि हुई U, सीओएल LBL हेपाटोसाइट्स द्वारा दिन 10. (बी) यूरिया स्राव पर एक पठार तक पहुँचने ntil 2 दिन में कम था 10. (सी) के दिन पर CYP1A गतिविधि की प्रेरण एक पठार तक पहुँचने तक समय के साथ कम किया, लेकिन काफी दिन 7 से वृद्धि हुई एक दिन 14. मतलब ± SEM के माध्यम से बनाए रखा गया था उस स्तर; सीओएल LBL: हेपाटोसाइट्स LBL कोलेजन बयान के बाद सुसंस्कृत; NoTop: कोई शीर्ष मैट्रिक्स परत के साथ सुसंस्कृत हेपाटोसाइट्स; एन = 6-8 उपकरणों। 9 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ultrathin शुद्ध कोलेजन विधानसभाओं संशोधित कोलेजन की परत-दर-परत बयान का उपयोग करते हुए आरोप लगाया कोशिकाओं या सामग्री सतहों पर जमा किया जा सकता है। इस अध्ययन के परिणामों मेथिलिकरण और देशी कोलेजन की succinylation कोशिकाओं (चित्रा 2) पर Ultrathin कोलेजन मैट्रिक्स विधानसभाओं जमा करने के लिए परत-दर-परत तकनीक के साथ प्रयोग किया जा सकता है कि चित्रा (1) या अन्य आरोप लगाया polycationic और polyanionic कोलेजन समाधान बनाने दिखाना है कि सामग्री सतहों। इस तरह के Ultrathin मैट्रिक्स परतों ऐसे हेपाटोसाइट्स (चित्रा 3), उनके कार्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, microfluidic उपकरणों में बोने के बाद (चित्रा 4) के रूप में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, और ध्रुवीकरण को स्थिर कर सकते हैं।

Ultrathin कोलेजन परतों के सफल बयान के लिए, methylated और succinylated कोलेजन बनाने modification प्रतिक्रियाओं महत्वपूर्ण हैं। Carboxyl समूह मेथिलिकरण प्रतिक्रिया, अनुकूल नहीं है, क्योंकिकोलेजन मेथिलिकरण प्रतिक्रिया Le Chatelier के सिद्धांत के आधार पर आगे की प्रतिक्रिया, ड्राइव करने के लिए acidified मेथनॉल में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। इसलिए, यह प्रतिक्रिया दक्षता बढ़ाने के लिए अम्लीय मेथनॉल में उपजी कोलेजन भंग होने से पहले पीएच वर्षा के बाद कोलेजन से सभी अतिरिक्त पानी निकालने के लिए महत्वपूर्ण है। Succinylation प्रतिक्रिया के लिए, एसीटोन में succinic एनहाइड्राइड को जोड़ते समय 9 से ऊपर समाधान के पीएच को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। पीएच और succinic एनहाइड्राइड एसीटोन समाधान की धीमी अलावा की सतत निगरानी के लिए एक कुशल प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए सहायक होते हैं। परत-दर-परत बयान के दौरान, यह कोशिकाओं मीडिया के बिना जाना उस समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। 10 bilayers के लिए प्रक्रिया के रूप में लंबे समय के सबसे कोशिकाओं इनक्यूबेटर के बाहर मीडिया के बिना होना चाहिए के बारे में है, जो लगभग 20 मिनट, लेता है। 10 से अधिक bilayers जमा किया जाना चाहिए, तो Colla के बीच 3-4 घंटे के लिए एक मशीन में मीडिया में कोशिकाओं को आरामजनरल बयानों कोशिकाओं के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए। अन्य चरम पर, बहुत कुछ परतों सेल आकृति विज्ञान को बनाए रखने में प्रभावी नहीं होगा। 10 परतों किया था, जबकि हमारे परीक्षण में, 3 परतों, सेल आकारिकी बनाए रखने नहीं दिया।

कई संशोधनों समस्याओं का निवारण करने के लिए प्रक्रियाओं को बनाया जा सकता है। समस्याएं उत्पन्न होती हैं, तो समय और मेथिलिकरण प्रतिक्रिया का तापमान अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रतिक्रिया तापमान को कम करने और कार्यकुशलता में वृद्धि हो सकती है 7 दिन का समय बढ़ रही है। इसके अलावा, पीएच निकासी के दौरान polymerization की सीमा के आधार पर कोलेजन कभी कभी पूरी तरह से मिथाइलेशन प्रतिक्रिया के दौरान अम्लीय मेथनॉल में भंग होगा। यदि ऐसा होता है, प्रतिक्रिया है कि यह अगले कदम के दौरान pelleted किया जा सकता है, ताकि कोलेजन वेग के लिए आदेश में पूरा होने के बाद 9-10 पीएच को ऊपर लाने के लिए 10 एम NaOH जोड़ें। Microfluidic उपकरणों में परत-दर-परत बयान आवेदन करते समय, छोटे चैनलों या बंदरगाहों सीएल बन सकता हैडिवाइस fluidic प्रतिरोध में वृद्धि ने संकेत दिया, कोलेजन के साथ ogged। ताजा मीडिया के साथ डिवाइस निस्तब्धता बयान जारी रखने के लिए अनुमति देता है, किसी भी रुकावटों को दूर करना चाहिए।

यहाँ वर्णित के रूप में परत-दर-परत कोलेजन के मैनुअल बयान microfluidic उपकरणों की स्केलिंग और स्वचालन के मामले में एक सीमा है। हालांकि, इस तकनीक तकनीक को स्वचालित और एक बार में उपकरणों की सरणियों तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वाल्व और पंप सहित मानक microfluidic हार्डवेयर के साथ संगत है। प्लेट संस्कृति में इस्तेमाल के लिए इस तकनीक का एक और सीमा यह देशी कोलेजन की एक अपेक्षाकृत बड़ी राशि की आवश्यकता है। Microfluidic आवेदन के लिए, methylated और succinylated कोलेजन की मात्रा कई उपकरणों में Ultrathin कोलेजन परतों को बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मानक ऊतक प्लेट संस्कृति के साथ, दूसरे हाथ पर, कोट कुओं के लिए आवश्यक मात्रा में अच्छी तरह से आकार में वृद्धि के साथ और अधिक निषेधात्मक हो जाते हैं।

इस परतUltrathin कोलेजन मैट्रिक्स परतों के बयान के लिए दर-परत तकनीक और विकल्प या कार्यात्मक संशोधनों का उपयोग करते हुए, साथ ही द्वारा पतली मैट्रिक्स विधानसभाओं द्वारा अलग कक्षों की कई परतों बनाने के द्वारा विकसित किया जा सकता है। मेथिलिकरण और succinylation की अपेक्षाकृत सरल अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला modification प्रतिक्रियाओं का यहां इस्तेमाल किया गया है, विकल्प या अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं के बजाय क्रियाशील कोलेजन बनाने के क्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है। क्रियाशील पक्ष श्रृंखला अभी भी शुद्ध समग्र सकारात्मक और नकारात्मक आरोप के साथ प्रोटीन की उपज चाहिए, लेकिन इस तरह के functionalization के आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयोगी हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 103 कोलेजन परत-दर-परत बयान microfluidics hepatocyte मेथिलिकरण succinylation जिगर microtissue
Microtissue स्थिरीकरण के लिए microfluidic उपकरणों में परत-दर-परत कोलेजन बयान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale,… More

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter