Protocol
1. Herstellung der Mutter Soluble Collagen-Lösung
- Bereiten Sie oder kaufen 200 mg angesäuert, lösliche, Kollagen Typ I aus Rattenschwänzen bei 1-3 mg / 15 ml mit Standard-Isolierung-Protokolle, wie durch Piez et al.
- Skalieren der Menge des Ausgangsmaterials, bezogen auf das gewünschte Endvolumen modifizierte Kollagenlösungen. Etwa machen 25-30 ml methylierter und 25-30 ml succinylierte Kollagenlösungen, die jeweils auf 3 mg / ml, 200 mg lösliches natives Kollagen.
2. Collagen Methylierung
- Verdünnen Sie 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern.
- Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Beachten Sie die Kollagenniederschlag, so dass die Lösung trüb zu werden. Spin down das ausgefallene Kollagenlösung bei 3.000 · g für 25 min. Eine klare, gelartige Ausfällung sollte der Boden der Röhrchen sichtbar. Absaugen und entsorgen der überstehenden Flüssigkeit.
- Resuspendieren fällte Kollagen in 200 ml Methanol mit 0,1 N HCl und ermöglichen dem Methylierungsreaktion unter Rühren bei RT für 4 Tage auf. Das Kollagen wird nicht auflösen, sollte aber abgesehen in sehr kleine Stücke, die sichtbar die Lösung trübe machen zu brechen.
- Nach der Methylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die methylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Methanolstand.
- Auflösen methyliertes Kollagen in 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 & mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 & mgr; l in Schritten von 1 N NaOH.
- Beurteilen Sie die concentration-Wert der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits Ratten Kollagen oder Hydroxyprolin-Testkit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS.
- Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die methylierte Kollagen ist.
- Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat.
3. Kollagen Succinylierung
- Verdünnen Sie die anderen 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern.
- Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Das Kollagen muss ausfallen, wodurch die Lösung trüb zu werden.
- Man löst 40 mg succinic Anhydrid (0,4 mg pro mg Kollagen) in 10 ml Aceton (1/20 des Volumens der Kollagenlösung). Langsam (in ca. 0,5 ml-Schritten) diese Mischung zu der Kollagenlösung unter Rühren, während der pH kontinuierlich überwacht. Aufrechterhaltung des pH-Wertes über 9,0 durch Zugabe von 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH der pH-Wert 9,0 nähert.
- Weiterhin Rühren bei RT 120 Minuten nach Zugabe des gesamten Bernsteinsäureanhydrid in Aceton. Beachten Sie die Lösung klar zu werden, wie die succinylierte Kollagen löst. Den pH-Wert in regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass es über 9,0 bleibt.
- Einstellen des pH der Lösung auf 4,0 mit 20 ul Schritten von 1 N HCl. Beachten Sie die Lösung trüb wieder, wie die succinylierte Kollagen ausfällt.
- Nach der Succinylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die succinylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Überstand mit nicht umgesetztem Bernsteinsäureanhydrid.
- Man löst den succinyliert Kollagenin 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 & mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 & mgr; l in Schritten von 1 N NaOH.
- Beurteilen Sie die Konzentration der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen Collagen Ratten ELISA-Kit oder Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS.
- Sterilisieren Sie die succinylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die succinylierte Kollagen ist.
- Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat.
4. Überprüfung des Collagen Änderungen
- Bereiten Sie 1 ml-Proben von jedem der nativen, methylierte und succinylierte Kollagenlösungen und mit Wasser auf eine konzentration von 0,1 mg / mit sterilem Reinwasser für die Wasserstoffionen-Titration ml. Weitere verdünnen Puffer mindestens 1000-fach durch Dialyse gegen Wasser durch eine 10 kDa Cutoff membraneusing 3-Lösung Änderungen für jede mindestens 4 Std.
- Einstellen des pH der Lösungen auf 7,3 mit kleinen Mengen von NaOH und HCl. Verwenden von pH 7,3 als eine willkürliche Referenz, führen Wasserstoffionen-Titration auf jede der Proben, wie durch Tanford 16 beschrieben, um Titrationskurven für die nativen, methylierte und succinyliert Kollagenlösungen erstellen.
- Zur Erstellung der pH-Änderung pro Volumen an zugesetzter Säure gegenüber der Anzahl der gebundenen H + -Ionen pro Molekül. Der hohe pH-Wert "Amino" Bereich sollte eine Verschiebung in der succinylierte Kollagen in Richtung der Sternpunkt (ein Verlust von Amingruppen) zeigen, und der niedrige pH-Wert "Carboxy" Bereich sollte eine Linksverschiebung im methyliertes Kollagen (ein Verlust von Carboxylgruppen zeigen ) und eine Rechtsverschiebung in der succinyliertes Kollagen (eine Verstärkung in Carboxylgruppes), im Vergleich zur nativen Kollagen.
- Beurteilen Sie die Wirksamkeit des Succinylierung Reaktion durch die Bestimmung der% der Aminogruppen in der nativen Kollagens durch Succinylierung ersetzt mit dem 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBA) kolorimetrisches Verfahren, nach Standardprotokollen 17,18.
5. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte und Zellaussaat
- Fertigen mikrofluidischen Systemen mit Standardverfahren 9. Verwenden Replik Formen von PDMS aus SU-8 Master auf Silizium unter Verwendung der Photolithographie zur mikrofluidischen Zellkulturkammern mit 100 & mgr; m groß, 0,4-1,5 mm breit und 1-10 mm lange Kanäle für das Zellwachstum zu schaffen definiert.
- Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Gerätes und einen Glasobjektträger zu oxidieren, und drücken Sie dann zusammen zu binden. Nach der Sterilisierung der Vorrichtung durch Exposition gegenüber UV-Licht für mindestens 30 min, Füllen der Kammer mit 50 & mgr; g / ml Fibronectin in sterilem PBS und Inkubation bei 37 ° C für 45 min. Samen der Vorrichtung mit Zellen, wie primären Ratten oder menschliche Hepatozyten, die ein Kollagen-Gel für die Stabilisierung des Phänotyps oder Differenzierungszustand erfordern. Wir verwenden 20 ul frisch isolierten primären Ratten-Hepatozyten 7,19 oder handelsübliche kryokonservierten primären humanen Hepatozyten in 14 × 10 6 Zellen / ml pro Gerät ausgesät.
- Lassen Sie die Zellen für 4-6 h zu befestigen, und dann waschen Sie ungebundene Zellen und ersetzen Sie die Plattenmedien mit Wachstumsmedien. Inkubieren Sie O / N, um volle Zelle sicherzustellen verbreiten und eine konfluente Monoschicht von Zellen.
6. Schicht-für-Schicht Kollagenablagerung
- In einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze, vorzubereiten ausreichenden Mengen methylierter und succinylierte Kollagenlösungen für 10 Anwendungen jeder Lösung pro Gerät, sowie ein paar ml Medium. Bewahren Sie die Lösung auf Eis. Wir verwenden 20 & mgr; l (10-15-fache des gesamten Gerätevolumen) Kollagen pro Schicht pro Gerät.
- Seinfang mit der methylierten (polykationische) Lösung, alternative Spülen der Geräte mit 20 & mgr; l von methylierten und dann succinyliert Kollagenlösungen, wartet 1 Minute zwischen jeder Anwendung. Spülen Sie das Gerät insgesamt 10-mal pro Lösung, die etwa 20 Minuten dauern sollte. Arbeiten Sie schnell auf der Höhe der Zeit sind die Zellen ohne Medien minimieren.
- Beobachten Kollagen langsam ansammeln am Einlass / Auslass in Abhängigkeit von seiner Größe. Wenn der Strömungswiderstand erhöht, spülen Sie das Gerät einmal oder zweimal mit Medien, und dann weiter Schichtung.
- Nach der Anwendung alle Schichten, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und zum Inkubator. Je nach Zelltyp, der extrazellulären Matrix-induzierte morphologische Veränderungen, wie erhöhte Polarisation in Hepatozyten, sollte innerhalb von wenigen Stunden sichtbar.
- Vorbereitung repräsentativen Vorrichtungen für die Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Standardverfahren, 9, um die Anwesenheit von einer Kollagenmatrix zu überprüfenAnordnung auf der Oberseite der kultivierten Zellen.
7. Die Stabilisierung der Zell-Phänotyp und Funktion
- Bild der Zellmorphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarität mit Standardmethoden für den Zelltyp. Hepatozyten, Bilder zu sammeln über 14 Tage unter Verwendung der Phasenmikroskopie lebend / tot-Färbung auf Lebensfähigkeit und CMFDA Farbstoff zur apikalen Polarisation, um die Wirkungen des Kollagenablagerung zu demonstrieren.
- Für Zellmorphologie, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul PBS und Bild das Gerät unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie.
- Für lebend / tot-Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul von LIVE / DEAD Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie die Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
- Für Gallen canaliculi Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul 2 uM CMFDA Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie das Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
- Sammeln der verbrauchten Medien und messen zellulären Stoffwechselprodukte zu geeigneten Zeitpunkten über die Kulturdauer, um die Zellfunktion zu bestimmen. Hepatozyten, messen die Menge von Albumin und Harnstoff in den verbrauchten Medien.
- Zuführen Endpunktfunktionsanalysen auf den Zellen selbst, wie die Beurteilung Enzymaktivitätsniveaus, Antikörperfärbung oder RNA-Analyse. Für Hepatozyten, zu induzieren und zu messen Cytochrom-P450-Enzymaktivitäten oder Phase-II-Konjugation Enzym Glutathion-S-Transferase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Natives Kollagen kann durch Methylierung und Succinylierung an polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zur Verwendung in Schicht-für-Schicht-Abscheidungs schaffen modifiziert werden. Succinylierung modifiziert die ε-Aminogruppen des nativen Kollagens mit Succinylgruppen und Methylierung modifiziert die Carboxylgruppen des nativen Kollagens mit einer Methylgruppe (1A). Diese Modifikationen der Kollagen-Protein Aminosäure-Seitenketten verändern die pH-Titrationskurven für die Lösungen. Succinylierung reduziert die Anzahl der Aminogruppen und erhöht die Anzahl der Carboxylgruppen, während Methylierung hat keine Auswirkung auf den Aminogruppen und reduziert die Anzahl der Carboxylgruppen, im Vergleich zu nativem Kollagen (1B). Diese Modifikationen verändern die Ladungseigenschaften der Kollagenmoleküle. Succinylierung entfernt positiv geladenen Gruppen und ersetzt sie durch die negativ geladene Gruppen und Methylierung entfernt negativ geladenen Gruppen (1C </ strong>).
Schicht-für-Schicht-Abscheidungs der methylierten und succinylierte Kollagenlösungen (COL LBL) erzeugt ein ultradünner Kollagenmatrixanordnung auf der Oberseite der geladenen Oberflächen, wie beispielsweise Zellen (2A). Primären Hepatozyten auf Fibronectin-beschichtete Glas innerhalb einer Mikrofluidik-Vorrichtung (2B) ausgesät kann mit einer solchen rein Kollagenmatrix Anordnung (2C) beschichtet werden. Ablagerung von 10 Doppelschichten auf Zellen schafft eine Kollagenschichtdicke von etwa 140 nm (Figur 2D).
Die ultradünne Kollagenaufbau Schicht unter Verwendung der COL LBL-Technik abgeschieden stabilisiert primären Hepatozyten für mehr als 14 Tage im mikrofluidischen Bauteilen. Hepatozyten ohne eine obere Abdeckung Matrix verlieren ihren differenzierten Phänotyp, Vertrag, und heben Sie die Oberfläche des Mikrofluidvorrichtungen mit der Zeit (Fig. 3A-C). Im Gegensatz dazu Hepatozyten mit einer ultradünnen Kollagen Montage der Wartung des abgedecktn ihre differenzierte Morphologie und Polarisation über 14 Tage (Abbildung 3D-F). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bei mehr als 90% (Figur 3G-I) erhalten. Darüber hinaus ist die Polarisation der mit COL LBL behandelten Hepatozyten erhöht über die Zeit und zeigt die Entwicklung von einem apikalen Gallen canalicular Netzwerk (3J-L).
Neben der Zelllebensfähigkeit, Morphologie und Polarisation, erholt sich der COL LBL-Technik und stabilisiert die Funktion der primären Hepatozyten auf einem Niveau ähnlich dem Standardverfahren für Zellen in Platten. Die Sekretion von Albumin durch Hepatozyten niedrig ist unmittelbar nach dem Beschichten, und nach wie vor gering, es sei denn die Zellen veranlasst, durch eine Matrix Belag polarisieren. Nach COL LBL Behandlung der Albumin-Sekretion durch die Hepatozyten über 8-10 Tage ansteigt bevor sie sich stabilisiert (4A). Harnstoffproduktion hoch ist unmittelbar nach Zellaussaat und nimmt mit der Zeit in den Zellen not mit einer Matrix bedeckt, stabilisiert Harnstoffherstellung nach 8-10 Tagen in Hepatozyten mit COL LBL (4B) stabilisiert. Cytochrom P450 (CYP) Enzyme-Expression in Reaktion auf Reize ist eine spezialisierte Funktion von Hepatozyten. Die Induktion von CYP1A1 in Hepatocyten in Abhängigkeit von 3-Methylcholanthren wurde gewonnen und bis zu 14 Tage nach der Behandlung COL LBL (4C) stabilisiert.
Abbildung 1. Rattenschwanz Kollagen Lösungen wurden chemisch modifiziert, um Netto-positiv zu erstellen oder net negativ geladenen Polymerlösungen. (A) Schematische Darstellungen der Succinylierung und Methylierungsreaktionen, die Carboxyl- und ε-Aminogruppen zu modifizieren sind. (B) Wasserstoff Titrationskurve Derivate zeigen Veränderungen in der relativen Anzahl von H + Ionen benötigt wird, um den Lösungs-pH nach col verändernlagen Modifikation. (C) Die Nettoaufwendungen (Mittelwert ± SD) der von der H + Verschiebungen berechnet modifizierten Kollagenlösungen (B) normiert auf nativen Kollagens. MC: methylierte Kollagen. SC: succinyliert Kollagen. AA: Aminosäurereste. Re-print mit Genehmigung aus 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schicht-für-Schicht-Abscheidung von modifizierten Kollagenlösungen erzeugt einen ultradünnen Kollagenmatrixanordnung auf der Oberseite der Hepatozyten. (A) Schematische Darstellung der Hepatocyten ausgesät Fibronektin auf einer Mikrovorrichtung und mit abwechselnden methylierte und succinylierte Kollagenlösungen inkubiert. TEM-Querschnitte der repräsentativen (20 Zellen pro Gruppe untersucht) conSteuerung (B) und COL LBL behandelten (C) Hepatozyten nach 2 Tagen Kultur. Arrows: LBL Kollagenschicht. Maßstab:. 2 um (D) COL LBL Schichtdicke (Mittelwert ± SD) pro Zelle von TEM-Aufnahmen (n = 20 Zellen von 4 Geräte) gemessen. Geändert von 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die COL LBL-Technik gehalten Hepatozyten-Morphologie, die Lebensfähigkeit und Polarisierung in Kleinstgeräten mehr als 14 Tagen in Kultur. Hepatozyten ohne obere Schicht in Mikrovorrichtungen (Negativkontrolle) Vertrag und heben Sie die Oberfläche im Laufe der Zeit (A-C). LBL Ablagerung von modifizierten Kollagene hält Hepatozyten-Morphologie (D-F) und VIABility (G-I) in Kleinstgeräten über 14 Tage. CMFDA ist ein generischer Zellmarker, die im Cytoplasma von nichtpolarisierten Hepatozyten (J) verbleibt. Im Laufe der Zeit kann die Entwicklung von Gallenkanälchen durch Ausscheidung des Fluorophors in canalicular Räume (K), die um die Zellen entwickeln sich im Laufe der Zeit (L) gesehen werden. Bildmaßstabsbalken: 100 & mgr; m. Inset Maßstab: 50 & mgr; m. Geändert von 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. COL LBL stabilisiert Hepatozyten-Albumin und Harnstoff Schnitte und CYP-Aktivität über 14 Tage in mikrofluidischen Systemen. (A) Albumin-Sekretion von Hepatozyten in COL LBL begann niedrig und erhöht sich mit der Zeit until erreichte ein Plateau bei Tag 10 (B) Harnstoff-Sekretion von COL LBL Hepatozyten nahm mit der Zeit bis zum Erreichen einer Hochebene am Tag 10 (C) die Induktion von CYP1A Aktivität niedrig war am Tag 2, aber deutlich am Tag 7 erhöht wird, ein Ebene, die durch Tag 14 Mittelwert ± SEM wurde beibehalten; COL LBL: Hepatozyten nach LBL Kollagenablagerung kultiviert; NoTop: Hepatozyten ohne oberen Matrix-Schicht kultiviert; n = 6-8 Geräte. Geändert von 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultradünne reinem Kollagen Baugruppen auf geladenen Zellen oder Materialoberflächen mit Layer-by-Layer Deposition von modifizierten Kollagene hinterlegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Methylierung und Succinylierung von nativem Kollagen polykationische und polyanionische Kollagenlösungen (Abbildung 1), die mit der Schicht-für-Schicht-Technik verwendet werden kann, um ultradünne Kollagenmatrix Anordnungen an Zellen (2) zu hinterlegen oder andere geladene erstellen Materialoberflächen. Solche ultradünnen Matrixschichten die Morphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarisation von Zellen wie Hepatozyten (Figur 3), nach dem Aussäen in Mikrofluidik-Vorrichtungen als auch ihre Funktion (Figur 4) zu stabilisieren.
Für eine erfolgreiche Abscheidung von ultradünnen Kollagenschichten, die Modifikationsreaktionen Schaffung der methylierte und succinylierte Kollagene sind kritisch. Weil die Carboxylgruppe Methylierungsreaktion nicht günstig ist, dasKollagen Methylierungsreaktion muss in angesäuertem Methanol durchgeführt werden, um die Reaktion nach vorn, basierend auf Prinzip von Le Chatelier fahren. Daher ist es wichtig, alle überschüssige Wasser aus dem Kollagen nach der pH-Ausfällung vor der Auflösung des präzipitierten Kollagen in angesäuertem Methanol, um die Reaktionseffizienz zu erhöhen, zu entfernen. Für die Succinylierung Reaktion, wobei der pH-Wert der Lösung oberhalb von 9 während der Zugabe des Bernsteinsäureanhydrids in Aceton ist kritisch. Kontinuierliche Überwachung des pH-Werts und die langsame Zugabe des Bernsteinsäureanhydrids Acetonlösung sind hilfreich für die Gewährleistung einer effizienten Reaktion. Während des Schicht-für-Schicht-Abscheidungs, ist es wichtig, die Zeit, die die Zellen gehen ohne Medien minimieren. Das Verfahren für die 10 Doppelschichten dauert etwa 20 min, die etwa so lang wie die meisten Zellen sollten ohne Medien außerhalb des Inkubators sein soll. Wenn mehr als 10 Doppelschichten abgeschieden werden muss, ruhen die Zellen in Medien in einem Inkubator für 3-4 Stunden zwischen Collagen Abscheidungen, um die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten. Am anderen Extrem wird zu wenige Schichten nicht wirksam bei der Aufrechterhaltung der Zellmorphologie. Bei unseren Tests haben 3 Schichten nicht pflegen Zellmorphologie, während 10 Schichten hat.
Verschiedene Modifikationen an den Verfahren vorgenommen werden, um Probleme zu beheben. Die Zeit und die Temperatur der Methylierungsreaktion kann variiert werden, wenn Probleme auftreten. Beispielsweise die Verringerung der Reaktionstemperatur auf 4 ° C und erhöht die Zeit bis 7 Tagen können die Effizienz zu erhöhen. Auch in Abhängigkeit von dem Ausmaß der Polymerisation während der pH-Extraktion, das Kollagen manchmal vollständig in der angesäuerten Methanol auflösen während der Methylierungsreaktion. Wenn dies auftritt, mit 10 M NaOH, um den pH auf 9-10 zu bringen, nachdem die Reaktion, um das Collagen auszufällen, so dass es während des nächsten Schrittes kann pelletiert werden abgeschlossen. Während der Anwendung der Schicht-für-Schicht-Abscheidungs in mikrofluidischen Vorrichtungen können kleine Kanäle oder Ports cl werdenogged mit Kollagen, durch einen Anstieg in dem Gerät Strömungswiderstand angegeben. Spülen Sie das Gerät mit frischen Medien sollten keine Blockaden zu entfernen, so dass Abscheidung, um fortzufahren.
Das manuelle Aufbringen der Schicht-für-Schicht Kollagen, wie hier beschrieben ist eine Einschränkung in Bezug auf die Skalierung und Automatisierung der Mikrofluidik-Vorrichtungen. Jedoch ist diese Technik mit Standard-Mikrofluid-Hardware, einschließlich Ventilen und Pumpen, die verwendet werden könnten, um das Verfahren zu automatisieren und bereiten Anordnungen von Geräten gleichzeitig kompatibel. Eine weitere Einschränkung dieser Technik für die Verwendung in Plattenkultur ist, dass es eine relativ große Menge von nativem Kollagen erfordert. Mikrofluidik-Anwendung können die Volumina von methylierten und succinyliertes Kollagen verwendet werden, um ultradünne Kollagenschichten in vielen Geräten zu schaffen. Mit Standard-Gewebekulturplatte, auf der anderen Seite, die zur Beschichtung von Brunnen erforderlichen Volumina geworden prohibitive mit zunehmender Größe auch.
Diese Schicht-by-layer-Technik für die Abscheidung von ultradünnen Kollagenmatrixschichten könnten durch den Einsatz alternativer und Funktionsänderungen sowie durch die Schaffung von mehreren Schichten von Zellen, die durch den dünnen Matrixanordnungen getrennt entwickelt werden. Obwohl die relativ einfache Aminosäureseitenkettenmodifikation Reaktionen der Methylierung und Succinylierung wurden hier verwendet, könnten alternative oder zusätzliche Reaktionen statt, um funktionalisierte Kollagene angelegt werden. Die funktionalisierten Seitenketten sollte noch ergeben Proteine mit Netto-Gesamt positiven und negativen Ladungen, aber solche Funktionalisierung kann für eine Vielzahl von Anwendungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
- Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
- Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
- Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
- Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
- McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
- Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
- Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
- Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
- Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
- Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
- Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
- Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
- Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
- Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
