Protocol
1. إعداد الحل الأصلية القابلة للذوبان الكولاجين
- إعداد أو شراء 200 ملغ من حمض، القابلة للذوبان، النوع الأول الكولاجين من ذيول الفئران في 1-3 ملغ / 15 مل باستخدام بروتوكولات العزلة القياسية، مثل ذكرت من قبل Piez وآخرون.
- تسلق كمية من المواد ابتداء على أساس حجم الغاية المرجوة من الحلول الكولاجين تعديلها. حوالي جعل 25-30 مل من مميثل و25-30 مل من الحلول الكولاجين succinylated، كل في 3 ملغ / مل، من 200 ملغ من الكولاجين الأصلي للذوبان.
2. الكولاجين مثلأيشن
- تمييع 100 ملغ من، المحمضة (درجة الحموضة 2-3) حل الكولاجين الأصلي إلى تركيز 0.5 ملغ / مل مع الماء المعقم الجليد البارد والحفاظ على حل على الجليد لمنع دبق.
- ضبط درجة الحموضة من الحل الكولاجين ل10/09 مع بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ويقلب في RT لمدة 30 دقيقة. مراقبة راسب الكولاجين، مما تسبب في حل ليصبح غائما. تدور باستمرار الحل الكولاجين عجلت في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة. وينبغي أن يكون واضحا، مثل هلام يعجل مرئية في الجزء السفلي من الأنابيب. نضح والتخلص السليم من السوائل طاف.
- Resuspend والكولاجين عجلت في 200 مل من الميثانول بنسبة 0.1 N حمض الهيدروكلوريك والسماح للرد فعل مثيلة لتحدث مع التحريك في RT لمدة 4 أيام. والكولاجين لا يحل، ولكن يجب أن تتفكك إلى قطع صغيرة جدا واضحة من شأنها أن تجعل الحل غائم.
- بعد مثيلة، الطرد المركزي الحل في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة لتكوير الكولاجين الميثيلي. نضح والتخلص من طاف الميثانول المحمض.
- حل الكولاجين ميثليته في 25 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، وإعطاء تركيز حوالي 3 ملغ / مل، مع pipetting لالمتكررة، وتصفية حل من خلال مصفاة الخلية 60 ميكرومتر. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7،3-7،4 باستخدام 20 ميكرولتر الزيادات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
- تقييم concentratioن من الحل باستخدام الكولاجين الفئران التجاري ELISA عدة أو هيدروكسي عدة الفحص. تمييع الحل إلى 3 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
- تعقيم الحل الكولاجين ميثليته من قبل نقلها إلى زجاجة مع غطاء المسمار، طبقات بعناية 3 مل من الكلوروفورم في الجزء السفلي من القمقم، والسماح للزجاجة لضبط O / N عند 4 درجات مئوية، ثم جو معقم و مطهر إزالة وتخزين الطبقة العليا، وهو الكولاجين الميثيلي.
- تخزين الحل في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1.
3. الكولاجين Succinylation
- تمييع الآخر 100 ملغ من، المحمضة (درجة الحموضة 2-3) حل الكولاجين الأصلي إلى تركيز 0.5 ملغ / مل مع الماء المعقم الجليد البارد والحفاظ على حل على الجليد لمنع دبق.
- ضبط درجة الحموضة من الحل الكولاجين ل10/09 مع بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ويقلب في RT لمدة 30 دقيقة. الكولاجين يجب أن يعجل، مما تسبب في حل ليصبح غائما.
- حل 40 ملغ من يمثcinic أنهيدريد (0.4 ملغ لكل ملغ من الكولاجين) في 10 مل من الأسيتون (1/20 عشر حجم الحل الكولاجين). ببطء (في ما يقرب من 0.5 مل الزيادات) إضافة هذا الخليط إلى حل الكولاجين مع التحريك في حين رصد مستمر لدرجة الحموضة. الحفاظ على درجة الحموضة فوق 9.0 عن طريق إضافة 1 أو 2 قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم مع اقتراب الرقم الهيدروجيني 9.0.
- تواصل اثارة في RT لمدة 120 دقيقة بعد إضافة كل من السكسينك في الأسيتون. مراقبة الحل لتصبح واضحة كما يذوب الكولاجين succinylated. فحص دوري الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنها لا تزال فوق 9.0.
- ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 4.0 مع 20 الزيادات ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك. مراقبة الحل غائم مرة أخرى، كما يترسب الكولاجين succinylated.
- بعد succinylation، الطرد المركزي الحل في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة لتكوير الكولاجين succinylated. نضح والتخلص من طاف المحمضة مع السكسينك غير المتفاعل.
- حل الكولاجين succinylatedفي 25 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، وإعطاء تركيز حوالي 3 ملغ / مل، مع pipetting لالمتكررة، وتصفية حل من خلال مصفاة الخلية 60 ميكرومتر. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7،3-7،4 باستخدام 20 ميكرولتر الزيادات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
- تقييم تركيز المحلول باستخدام الفئران الكولاجين التجاري ELISA عدة أو هيدروكسي عدة الفحص. تمييع الحل إلى 3 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
- تعقيم الحل الكولاجين succinylated من قبل نقلها إلى زجاجة مع غطاء المسمار، طبقات بعناية 3 مل من الكلوروفورم في الجزء السفلي من القمقم، والسماح للزجاجة لضبط O / N عند 4 درجات مئوية، ثم جو معقم و مطهر إزالة وتخزين الطبقة العليا، وهو الكولاجين succinylated.
- تخزين الحل في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1.
4. التحقق من الكولاجين التعديلات
- إعداد 1 مل عينات من كل الحلول الكولاجين الأم، مثيلة، وsuccinylated وتمييع إلى اضربentration من 0.1 ملغ / مل مع الماء النقي المعقم لأيون الهيدروجين المعايرة. وعلاوة على ذلك تمييع عازلة على الأقل 1000 أضعاف خلال غسيل الكلى ضد المياه من خلال 10 كيلو دالتون قطع membraneusing 3 تغييرات حل للا يقل عن 4 ساعة لكل منهما.
- ضبط درجة الحموضة من الحلول إلى 7.3 مع كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. باستخدام الرقم الهيدروجيني 7.3 باعتبارها مرجعية التعسفي، نفذ الهيدروجين أيون المعايرة على كل من العينات كما وصفها Tanford 16 لإنشاء منحنيات المعايرة للحلول الكولاجين الأم، مثيلة، وsuccinylated.
- رسم التغير في الرقم الهيدروجيني في حجم حمض أضاف مقابل عدد من H ملزمة + الأيونات في الجزيء. درجة الحموضة العالية "الأمينية" مجموعة يجب أن تظهر تحولا في الكولاجين succinylated نحو نقطة محايدة (فقدان مجموعات أمين)، وانخفاض الرقم الهيدروجيني "الكربوكسيل" مجموعة يجب أن تظهر تحولا نحو اليسار في الكولاجين الميثيلي (خسارة مجموعات الكربوكسيل ) والتحول نحو اليمين في الكولاجين succinylated (مكاسب في مجموعة الكربوكسيلالصورة)، بالمقارنة مع الكولاجين الأصلي.
- تقييم فعالية رد الفعل succinylation من خلال تحديد٪ من المجموعات الأمينية في الكولاجين الأصلي استبداله succinylation باستخدام حامض 2،4،6-trinitrobenzenesulfonic (TNBA) الطريقة اللونية، بعد بروتوكولات موحدة 17،18.
5. تصنيع أجهزة ميكروفلويديك والبذر الخلية
- صنع أجهزة ميكروفلويديك باستخدام الأساليب القياسية 9. استخدام صب متماثلة PDMS من SU-8 سادة على السيليكون تعريفها باستخدام ضوئيه لخلق ميكروفلويديك غرف زراعة الخلايا مع 100 ميكرون طويل القامة، 0،4-1،5 مم، و1-10 ملم قنوات طويلة لنمو الخلايا.
- استخدام منظف البلازما لأكسدة أسطح الجهاز وشريحة زجاجية، ثم اضغط معا لالسندات. بعد تعقيم الجهاز عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وملء غرفة مع 50 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني العقيمة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. البذور الجهاز مع الخلايا، مثل الفئران الأساسي أو خلايا الكبد البشرية، والتي تتطلب جل الكولاجين لتحقيق الاستقرار في النمط الظاهري أو دولة التمايز. نحن نستخدم 20 ميكرولتر من طازجة معزولة خلايا الكبد في الفئران الابتدائي 7،19 أو المتاحة تجاريا cryopreserved خلايا الكبد البشرية الأساسية المصنف في 14 × 10 6 خلية / مل لكل جهاز.
- السماح للخلايا لنعلق لمدة 4-6 ساعة، ثم تغسل الخلايا غير مرتبط واستبدال وسائل الإعلام الطلاء مع وسائل الاعلام النمو. احتضان O / N لضمان خلية كاملة الانتشار وإنشاء أحادي الطبقة متموجة من الخلايا.
6. طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب
- في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة، وإعداد كميات كافية من الكولاجين حلول مثيلة وsuccinylated لمدة 10 تطبيقات كل حل لكل جهاز، فضلا عن عدد قليل من ملل من وسائل الاعلام. الحفاظ على الحلول على الجليد. نحن نستخدم 20 ميكرولتر (10-15 أضعاف حجم الجهاز الإجمالي) الكولاجين في طبقة لكل جهاز.
- يكونحلج مع ميثليته (polycationic) الحل البديل بيغ الأجهزة مع 20 ميكرولتر من مميثل ثم succinylated حلول الكولاجين، في انتظار 1 دقيقة بين كل تطبيق. مسح الجهاز ما مجموعه 10 مرات في الحل الذي ينبغي أن تأخذ حوالي 20 دقيقة. العمل بسرعة لتقليل مقدار الوقت الخلايا دون وسائل الاعلام.
- مراقبة الكولاجين تتراكم ببطء في مدخل / مخرج تبعا لحجمها. إذا كانت المقاومة ليزيد من تدفق السوائل، وطرد الجهاز مرة واحدة أو مرتين مع وسائل الإعلام، ومن ثم الاستمرار طبقات.
- بعد تطبيق جميع الطبقات، وشطف الجهاز مرتين مع وسائل الإعلام الجديدة والعودة إلى الحاضنة. اعتمادا على نوع من الخلايا، والتغيرات التي يسببها المصفوفة خارج الخلية الشكلية، مثل تعزيز الاستقطاب في خلايا الكبد، يجب أن تكون مرئية في غضون ساعات قليلة.
- إعداد التمثيلية الأجهزة للانتقال المجهر الإلكتروني باستخدام الأساليب القياسية 9 إلى التحقق من وجود مصفوفة الكولاجينالتجمع على الجزء العلوي من الخلايا المستزرعة.
7. لتحقيق الاستقرار من النمط الظاهري خلية وظيفة
- صورة مورفولوجيا الخلايا، والسلامة، والاستقطاب باستخدام أساليب موحدة لنوع من الخلايا. لخلايا الكبد، وجمع الصور أكثر من 14 أيام باستخدام المجهر المرحلة، ويعيش / تلطيخ الميت للبقاء، وCMFDA صبغ لاستقطاب القمي لإثبات آثار ترسب الكولاجين.
- لمورفولوجيا الخلايا، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام النقيض من المرحلة المجهري.
- لايف / تلطيخ الميت، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من حي / حل تلطيخ الميت مع دابي أعد باتباع إرشادات الشركة المصنعة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، وشطف الجهاز مرة أخرى مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام المجهر مضان.
- لالصفراء كاناليتلطيخ culi، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من 2 ميكرومتر CMFDA حل تلطيخ مع دابي أعد باتباع إرشادات الشركة المصنعة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، شطف الجهاز مرة أخرى مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام المجهر مضان.
- جمع وسائل الإعلام المستهلك وقياس منتجات الأيض الخلوية في نقطة زمنية مناسبة خلال مدة الثقافة لتحديد وظيفة الخلية. لخلايا الكبد، وقياس كمية الزلال واليوريا في وسائل الإعلام المستهلك.
- إجراء تحليلات وظيفية نقطة النهاية على الخلايا نفسها، مثل تقييم مستويات انزيم النشاط، تلوين الأجسام المضادة، أو تحليل الحمض النووي الريبي. لخلايا الكبد، وحمل وقياس إنزيم السيتوكروم P450 الأنشطة أو المرحلة الثانية الاقتران أنزيم الجلوتاثيون S-ترانسفيراز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تعديل الكولاجين الأصلي باستخدام مثيلة وsuccinylation لإيجاد حلول الكولاجين polycationic وpolyanionic لاستخدامها في طبقة تلو طبقة ترسب. Succinylation يعدل مجموعات ε الأمينية الكولاجين الأصلي مع مجموعات succinyl، ومثيلة تعديل مجموعة الكربوكسيل الكولاجين الأصلي مع مجموعة الميثيل (الشكل 1A). هذه التعديلات على بروتين الكولاجين السلاسل الجانبية الأحماض الأمينية تغير منحنيات درجة الحموضة المعايرة للحلول. Succinylation يقلل من عدد من المجموعات الأمينية ويزيد من عدد من المجموعات الكربوكسيل، في حين مثيلة له أي تأثير على المجموعات الأمينية ويقلل من عدد من المجموعات الكربوكسيل، مقارنة مع الكولاجين الأصلي (الشكل 1B). هذه التعديلات تغير خصائص المسؤول عن جزيئات الكولاجين. Succinylation يزيل مجموعة موجبة الشحنة ويستبدلها مع مجموعات سالبة الشحنة، والحامض يزيل مجموعة سالبة الشحنة (الشكل 1C </ قوي>).
طبقة تلو طبقة ترسب الحلول الكولاجين مميثل وsuccinylated (COL LBL) يخلق تجميع مصفوفة سامسونج الكولاجين على أعلى أسطح مشحونة، مثل الخلايا (الشكل 2A). خلايا الكبد الأولية المصنف على الزجاج المطلي فبرونيكتين داخل جهاز ميكروفلويديك (الشكل 2B) يمكن أن تكون مغلفة مع مثل هذا التجمع مصفوفة الكولاجين بحتة (الشكل 2C). ترسب 10 طبقات ثنائية على الخلايا يخلق سماكة طبقة الكولاجين من حوالي 140 نانومتر (الشكل 2D).
طبقة سامسونج التجمع الكولاجين المودعة باستخدام تقنية COL LBL تستقر خلايا الكبد الأولية لأكثر من 14 يوما في أجهزة ميكروفلويديك. خلايا الكبد بدون غطاء مصفوفة كبار يفقدون متباينة النمط الظاهري، العقد، ورفع قبالة سطح الأجهزة ميكروفلويديك على مر الزمن (الشكل 3A-C). في المقابل، خلايا الكبد غطت مع سامسونج الكولاجين التجمع maintaiن التشكل المتمايزة والاستقطاب أكثر من 14 يوما (الشكل 3D-F). تم الإبقاء على حيوية الخلايا في أكثر من 90٪ (الشكل 3G-I). وبالإضافة إلى ذلك، ارتفع استقطاب خلايا الكبد تعامل مع COL LBL على مر الزمن، والتي تبين تطور شبكة نفيقي المرارية قمي (الشكل 3J-L).
بالإضافة إلى بقاء الخلية، مورفولوجيا، والاستقطاب، وتقنية COL LBL يسترد وتستقر وظيفة خلايا الكبد الأولية عند مستويات مماثلة لتقنيات قياسية للخلايا في لوحات. إفراز الزلال بواسطة خلايا الكبد منخفض مباشرة بعد الطلاء، ويظل منخفضا ما لم يتم يسببها الخلايا لاستقطاب من خلال غطاء المصفوفة. بعد العلاج COL LBL، وإفراز الزلال بسبب الزيادات في خلايا الكبد خلال 8-10 أيام قبل أن يستقر الشكل (4A). إنتاج اليوريا عالية على الفور بعد البذر الخلية وبمرور الوقت في الخلايا نبعد التمديد مغطاة مصفوفة، استقرار إنتاج اليوريا بعد 8-10 أيام في خلايا الكبد استقر مع COL LBL (الشكل 4B). السيتوكروم P450 (CYP) التعبير انزيم في استجابة للمؤثرات هو وظيفة واحدة متخصصة في خلايا الكبد. تم العثور على تحريض CYP1A1 في خلايا الكبد استجابة ل3-ميثيل كولانترين واستقرت تصل إلى 14 يوما من العلاج COL LBL (الشكل 4C).
تم تعديل الرقم 1. الجرذ حلول الذيل الكولاجين كيميائيا لإنشاء شبكة إيجابا أو سلبا صافي اتهم حلول البوليمر. (A) تمثيل تخطيطي للsuccinylation ومثيلة ردود الفعل التي تعديل الكربوكسيل وε الأمينية مجموعات، على التوالي. (B) المعايرة الهيدروجين المشتقات منحنى تظهر تحولات في الأعداد النسبية من H + الأيونات اللازمة لتغيير درجة الحموضة حل بعد العقيدتعديل لاجين. (C) ورسوم صافية (يعني ± SD) من حلول الكولاجين تعديل تحسب من H + التحولات في (B) لتطبيع الكولاجين الأصلي. MC: ميثليته الكولاجين. SC: الكولاجين succinylated. AA: بقايا الأحماض الأمينية. إعادة الطباعة بإذن من 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. طبقة تلو طبقة ترسب الكولاجين الحلول المعدلة إنشاء جمعية الكولاجين مصفوفة سامسونج على أعلى من خلايا الكبد. (A) تمثيل تخطيطي للخلايا الكبد المصنف على فبرونيكتين على microdevice وحضنت بالتناوب مع حلول الكولاجين مميثل وsuccinylated. تيم المقاطع العرضية للممثل (20 زنزانة فحص لكل مجموعة) يخدعالمحول المتعدد العادي (B) وCOL LBL المعاملة (C) خلايا الكبد بعد 2 أيام الثقافة. سهام: LBL طبقة الكولاجين. شريط النطاق: 2 ميكرومتر (D) COL LBL سمك طبقة (يعني ± SD) في الخلية تقاس من الصور TEM (ن = 20 الخلايا من 4 أجهزة). تعديل من 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تقنية COL LBL الحفاظ على التشكل الكبدية، والسلامة، والاستقطاب في الأجهزة الصغيرة أكثر من 14 يوما في الثقافة. خلايا الكبد مع عدم وجود الطبقة العليا في الأجهزة الصغيرة (المراقبة السلبية) العقد ورفع من السطح على مر الزمن (A-C). LBL ترسب الكولاجين تعديل يحافظ على التشكل الكبدي (D-F) وviability (G-I) في الأجهزة الصغيرة أكثر من 14 يوما. CMFDA هو علامة الخلية العامة التي لا تزال في سيتوبلازم خلايا الكبد غير مستقطب (J). مع مرور الوقت، وتطوير الصفراء نفيق يمكن أن ينظر إليه من قبل إفراز من fluorophore إلى مساحات القنيوية (K) التي تنمي حول الخلايا مع مرور الوقت (L). صورة مقياس شريط: 100 ميكرون. أقحم نطاق شريط: 50 ميكرومتر. تعديل من 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. COL LBL استقرار الزلال الكبدية وأقسام اليوريا والنشاط CYP أكثر من 14 يوما في أجهزة ميكروفلويديك. (A) إفراز الزلال بواسطة خلايا الكبد في COL LBL بدأ المنخفض وزيادة مع مرور الوقت شntil تصل إلى القاع في يوم 10. (B) إفراز اليوريا بواسطة خلايا الكبد COL LBL تراجعت مع مرور الوقت حتى تصل إلى القاع في يوم 10. (C) والاستقراء النشاط CYP1A كانت منخفضة في يوم 2، ولكن زيادة كبيرة في يوم 7، وهو المستوى الذي تم المحافظة عليه من خلال يوم 14. يعني ± SEM. COL LBL: خلايا الكبد مثقف بعد ترسب الكولاجين LBL. NoTop: خلايا الكبد مثقف مع عدم وجود طبقة مصفوفة أعلى. ن = 6-8 الأجهزة. تعديل من 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن إيداع سامسونج المجالس الكولاجين النقي على الخلايا مشحونة أو أسطح المواد باستخدام طبقة تلو طبقة ترسب الكولاجين تعديلها. وتظهر نتائج هذه الدراسة أن مثيلة وsuccinylation الكولاجين الأصلي إيجاد حلول الكولاجين polycationic وpolyanionic (الشكل 1) التي يمكن استخدامها مع تقنية طبقة تلو طبقة لإيداع سامسونج المجالس الكولاجين مصفوفة على الخلايا (الشكل 2) أو غيرها مشحونة السطوح المادية. هذه الطبقات مصفوفة سامسونج يمكن تحقيق الاستقرار في التشكل، والسلامة، والاستقطاب من الخلايا مثل خلايا الكبد (الشكل 3)، بعد البذر في أجهزة ميكروفلويديك، فضلا عن وظيفتها (الشكل 4).
لترسب الناجح للطبقات الكولاجين سامسونج، ردود فعل التعديل خلق الكولاجين مميثل وsuccinylated حاسمة. لأن رد فعل مثيلة مجموعة الكربوكسيل ليست مواتية، ويجب إجراء رد فعل مثيلة الكولاجين في الميثانول المحمض لحملة رد الفعل إلى الأمام، على أساس مبدأ وشاتلييه ل. وبالتالي، فمن المهم لإزالة جميع المياه الزائدة من الكولاجين بعد هطول الأمطار ودرجة الحموضة قبل حل الكولاجين عجلت في الميثانول المحمض من أجل زيادة كفاءة التفاعل. للتفاعل succinylation، والحفاظ على درجة الحموضة من الحل فوق 9 أثناء إضافة السكسينك في الأسيتون أمر بالغ الأهمية. المراقبة المستمرة لدرجة الحموضة وبالإضافة إلى ذلك بطء الحل أنهيدريد الأسيتون السكسينيك مفيدة لضمان رد فعل فعال. خلال ترسب طبقة تلو طبقة، فمن الأهمية بمكان لتقليل الوقت أن الخلايا تذهب دون وسائل الاعلام. الإجراء لمدة 10 طبقات ثنائية يستغرق حوالي 20 دقيقة، وهي عبارة عن ما دام معظم الخلايا يجب أن يكون دون وسائل الإعلام خارج الحاضنة. إذا يجب أن تودع أكثر من 10 طبقات ثنائية، وبقية الخلايا في وسائل الإعلام في حاضنة لمدة 3-4 ساعة بين أعناقترسبات جنرال لضمان صحة الخلايا. وعلى الطرف الآخر، وعدد قليل جدا من طبقات لن تكون فعالة في الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا. في تجاربنا، لم 3 طبقات لا تحافظ على مورفولوجيا الخلايا، في حين لم 10 طبقات.
ويمكن إجراء عدة تعديلات على إجراءات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الوقت ودرجة الحرارة من رد فعل مثيلة يمكن أن تختلف إذا تنشأ مشاكل. على سبيل المثال، وخفض درجة حرارة التفاعل إلى 4 درجات مئوية، وزيادة الوقت إلى 7 أيام قد تزيد من الكفاءة. أيضا، وهذا يتوقف على مدى البلمرة أثناء استخراج الرقم الهيدروجيني، والكولاجين وأحيانا تذوب تماما في الميثانول المحمض خلال رد فعل مثيلة. إذا حدث هذا، إضافة 10 M هيدروكسيد الصوديوم لتحقيق درجة الحموضة تصل إلى 9-10 بعد اكتمال التفاعل من أجل ترسيب الكولاجين بحيث يمكن مكعبات خلال الخطوة التالية. أثناء تطبيق ترسب طبقة تلو طبقة في أجهزة ميكروفلويديك، يمكن أن قنوات صغيرة أو منافذ تصبح CLogged مع الكولاجين، وأشار إلى زيادة في جهاز المقاومة الموائعية. يجب شطف الجهاز مع وسائل الإعلام الجديدة إزالة أي عراقيل، والسماح ترسب للمتابعة.
ترسب اليدوي من الكولاجين طبقة تلو طبقة كما هو موضح هنا وجود قيود من حيث القياس والتشغيل الآلي من الأجهزة ميكروفلويديك. ومع ذلك، هذه التقنية متوافقة مع الأجهزة ميكروفلويديك القياسية، بما في ذلك الصمامات والمضخات التي يمكن استخدامها لأتمتة تقنية وإعداد مصفوفات من الأجهزة في آن واحد. قيود أخرى من هذه التقنية لاستخدامها في لوحة الثقافة هو أنه يتطلب كمية كبيرة نسبيا من الكولاجين الأصلي. لتطبيق ميكروفلويديك، وكميات من الكولاجين مميثل وsuccinylated يمكن أن تستخدم لخلق طبقات الكولاجين سامسونج في العديد من الأجهزة. مع معيار لوحة الثقافة الأنسجة، من ناحية أخرى، وحدات التخزين اللازمة لآبار معطف تصبح أكثر باهظة مع زيادة حجم جيدا.
هذا layer-من جانب طبقة تقنية لترسب سامسونج طبقات الكولاجين مصفوفة يمكن وضع مزيد باستخدام تعديلات بديلة أو الوظيفية، فضلا عن خلق طبقات متعددة من الخلايا مفصولة المجالس مصفوفة رقيقة. وعلى الرغم من استخدام الأحماض الأمينية ردود الفعل تعديل سلسلة جانبية بسيطة نسبيا من مثيلة وsuccinylation هنا، يمكن أن تستخدم التفاعلات بديلة أو إضافية بدلا من ذلك من أجل خلق الكولاجين functionalized. ينبغي أن sidechains functionalized لا تزال تسفر عن البروتينات مع صافي الشحنات الإيجابية والسلبية الشاملة، ولكن قد يكون هذا functionalization مفيدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
- Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
- Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
- Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
- Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
- McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
- Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
- Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
- Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
- Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
- Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
- Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
- Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
- Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
- Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
