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Bioengineering

层与层胶原沉积在微流体装置的Microtissue稳定

doi: 10.3791/53078 Published: September 29, 2015

Protocol

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1.准备本机可溶性胶原溶液中

  1. 制备或购买200mg的酸化,可溶的,I型大鼠尾胶原在1-3毫克/毫升使用标准的分离协议,诸如报告Piez 等人 15
  2. 比例基于改性胶原溶液的所需的最终体积上起始原料的量。大约使25-30毫升甲基化和25-30毫升琥珀酰化的胶原蛋白溶液中,每个在3毫克/毫升,从200毫克的可溶性天然胶原。

2.胶原蛋白甲基化

  1. 稀释100毫克天然,酸化(pH 2-3)的胶原溶液的为0.5毫克/毫升用冰冷无菌水的浓度,并保持该溶液在冰上,以防止凝胶化。
  2. 调节胶原溶液以9-10的PH值用几滴1N NaOH和在RT搅拌30分钟。观察胶原沉淀,使溶液变浑浊。 降速在3000×g下沉淀的胶原溶液25分钟。一种透明,凝胶状沉淀物应当是在管的底部可见。吸并妥善处理上清液的。
  3. 重悬沉淀的胶原在200ml甲醇中,用0.1N HCl和使甲基化反应,以发生在室温下搅拌4天。胶原蛋白不会解散,而应该分裂成非常小的可见部分,这将使解决方案浑浊。
  4. 甲基化后,离心该溶液在3000×g的25分钟以沉淀甲基化胶原。吸和处置酸化甲醇上清液。
  5. 溶解甲基化胶原在25毫升无菌PBS,得到浓度大约为3毫克/毫升,反复移液,并过滤通过60微米的细胞过滤的溶液。调节溶液的使用1N的NaOH 20μl递增pH至7.3-7.4。
  6. 评估concentratioN使用商业鼠胶原ELISA试剂盒或羟脯氨酸检测试剂盒的解决方案。稀释至3毫克/毫升,用无菌PBS洗涤。
  7. 通过将其与一螺丝帽转移到玻璃瓶中,小心地分层3毫升氯仿在瓶底消毒甲基化胶原溶液,使瓶子以设置O / N在4℃,然后在无菌条件下取出并存储顶层,它是甲基化的胶原蛋白。
  8. 存储1个月内溶液在4℃下使用。

3.胶原蛋白琥珀酰化

  1. 稀释其他100毫克天然,酸化(pH 2-3)的胶原溶液的为0.5毫克/毫升用冰冷无菌水的浓度,并保持该溶液在冰上,以防止凝胶化。
  2. 调节胶原溶液以9-10的PH值用几滴1N NaOH和在RT搅拌30分钟。胶原应沉淀,使溶液变浑浊。
  3. 溶解SUC 40毫克互联网络信息中心酸酐(每胶原毫克0.4毫克)的10毫升丙酮的(1/20的胶原溶液的体积)。缓慢(在大约0.5 ml的增量)加该混合物的胶原溶液在搅拌下,同时连续监测pH。通过加入1或2滴的1N NaOH作为pH值接近9.0维持大于9.0的pH值。
  4. 继续在RT下加入所有的琥珀酸酐的丙酮后搅拌120分钟。观察溶液变得清澈如琥珀酰化的胶原蛋白溶解。定期检查pH值,以确保它仍然高于9.0。
  5. 调节溶液至4.0将pH用1N的盐酸20μl递增。再观察溶液混浊,如琥珀酰化的胶原蛋白沉淀。
  6. 琥珀酰化后,离心该溶液在3000×g的25分钟以沉淀的琥珀酰化的胶原蛋白。吸并丢弃上清液酸化与未反应的琥珀酸酐。
  7. 化解琥珀胶原蛋白在25ml无菌PBS,得到约3毫克/ ml的浓度,反复移液,并过滤通过60微米的细胞过滤的溶液。调节溶液的使用1N的NaOH 20μl递增pH至7.3-7.4。
  8. 评估使用市售的大鼠胶原ELISA试剂盒或羟脯氨酸测定试剂盒的溶液的浓度。稀释至3毫克/毫升,用无菌PBS洗涤。
  9. 通过将其与一螺丝帽转移到玻璃瓶中,小心地分层3毫升氯仿在瓶底消毒琥珀酰化的胶原蛋白溶液,使瓶子以设置O / N在4℃,然后在无菌条件下取出并存储顶层,这是琥珀酰化的胶原蛋白。
  10. 存储1个月内溶液在4℃下使用。

4.验证了胶原蛋白修饰的

  1. 制备1 ml的样品从每个本地,甲基化,以及琥珀酰化的胶原蛋白溶液稀释到浓entration 0.1毫克/毫升,用无菌纯水的氢离子滴定。进一步稀释缓冲至少1000倍通过用水透析通过10kDa的截止membraneusing 3溶液的变化对于每个至少4小时。
  2. 调节溶液的pH至7.3与少量的NaOH和HCl的。用pH 7.3作为任意的基准,由16 Tanford如所述创建滴定曲线用于母体,甲基化,以及琥珀酰化胶原溶液在每个样品进行氢离子滴定。
  3. 绘制在pH变化每酸的体积加入与结合的H +的每个分子的离子数。高pH值“氨基”的范围应显示在琥珀酰化的胶原蛋白的移位朝中性点(胺基团的损失),并且低pH值“羧基”的范围应显示在甲基化胶原左移(羧基基团的损失),并用琥珀酰化的胶原右移(在羧基的增益多个),相比于天然胶原。
  4. 通过测定氨基的%在天然胶原使用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBA)比色法由琥珀酰化取代,下列标准协议17,18评估琥珀酰化反应的功效。

5.制造微流体装置和细胞接种

  1. 编造使用标准方法9的微流体装置。使用PDMS从SU-8大师副本成型硅使用光刻制造微流体细胞培养室,100微米高,0.4-1.5毫米宽,1〜10毫米长的通道,细胞生长定义。
  2. 使用等离子体清洁器以氧化装置和载玻片的表面上,然后按共同键。通过暴露杀菌设备在UV光下至少30分钟后,填充腔室50微克/毫升纤连蛋白在无菌PBS孵育在37℃下45分钟。 种子设备用的细胞,如原代大鼠或人类肝细胞,这需要对表型或分化状态的稳定胶原凝胶。我们使用20微升新鲜分离原代大鼠肝7,19或市售冷冻保存的原代人肝细胞以14×10 6个细胞/每毫升设备。
  3. 允许细胞附着4-6小时,然后洗出独立的细胞和生长介质取代电镀媒体。孵育O / N,以确保充分细胞扩散,创造细胞的融合单层。

6.层 - 层胶原沉积

  1. 在一个层流组织培养罩,准备足够的卷对每个器件的各溶液10应用甲基化和琥珀酰化的胶原蛋白溶液,以及媒体几毫升。置于冰上的解决方案。我们用20微升胶原蛋白(10〜15倍,总装置容量)每一层的每个设备。
  2. 是轧花与甲基化(聚阳离子)溶液,交替与20μl的甲基化,然后冲洗设备琥珀酰化的胶原蛋白溶液,等待每个应用之间1分钟。冲洗设备总共每溶液10次,这大约需要20分钟。加速工作,以最大限度地减少时间的细胞是没有介质的数量。
  3. 观察胶原慢慢聚集在入口/出口取决于其大小。如果流体流的阻力增加,冲洗装置一次或两次的介质,然后继续分层。
  4. 施加所有的层之后,冲洗装置两次用新鲜培养基并返回到培养箱中。取决于细胞类型,所述细胞外基质诱导形态学变化,如在肝细胞中增强的偏振,应是在几个小时内可见。
  5. 使用标准方法9来验证胶原基质的存在下制备用于透射电子显微镜代表性装置装配上培养的细胞的顶端。

7.稳定细胞表型和功能的

  1. 图像的细胞形态,活力,和极性使用标准方法的细胞类型。对于肝细胞,采集图像上使用相差显微镜,LIVE / DEAD染色的可行性,并CMFDA染料心尖极化以证明胶原沉积的影响14天。
  2. 对于细胞形态,用移液管通过入口冲洗装置与20μl的PBS漂洗,注入20微升PBS,并使用图像相差显微镜设备。
  3. 对活/死染色,通过入口用移液管与20μl的PBS漂洗,注入20微升用DAPI LIVE / DEAD染色溶液制备下列制造商的说明冲洗装置中,温育30分钟,在37℃,冲洗设备再次用20微升PBS,和图像用荧光显微镜的装置。
  4. 对于胆汁CANALIculi染色,用移液管通过入口冲洗装置与20μl的PBS漂洗,注入20微升2用DAPIμMCMFDA染色溶液制备按照生产商的说明,孵育30分钟,在37℃,再次冲洗装置20微升PBS,和图像用荧光显微镜的装置。
  5. 收集用过的培养基和测量细胞代谢产物在适当的时间点在培养持续时间,以确定细胞的功能。对于肝细胞,测量在用过的培养基白蛋白和尿素的量。
  6. 上的细胞本身,例如评估酶活性的水平,抗体染色,或RNA分析执行对端点功能分析。对于肝细胞,诱导和测量细胞色素P450酶的活性或II期缀合的酶谷胱甘肽S-转移酶。

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Representative Results

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天然胶原可以使用甲基化和琥珀酰化创建用于在层 - 层沉积用聚阳离子和聚阴离子胶原溶液进行修改。琥珀酰化修饰天然胶原的ε-氨基与琥珀基团,和甲基化修饰天然胶原的羧基与甲基图1A)。这些修改到胶原蛋白的氨基酸侧链改变pH滴定曲线的解决方案。琥珀酰化降低氨基团的数目,增加羧基基团的数目,而甲基化对氨基没有影响,并减少羧基基团的数目,相比于天然胶原图1B)。这些修饰改变胶原分子的电荷特征。琥珀酰化除去带正电荷的基团,并将它们替换负电荷的基团,和甲基化去除带负电荷的基团图1C </ STRONG>)。

甲基化和琥珀酰化的胶原蛋白溶液(COL LBL)的层-层沉积上创建电荷的表面,如细 ​​胞 (图2A)的顶部的超薄胶原基质组件。一个微流体装置图2B)内接种于纤维连接蛋白包被的玻璃原代肝细胞可涂覆有这样的纯粹的胶原基质组件图2C)。 10双层对细胞沉积产生的大约140纳米( 图2D)的胶原层的厚度。

使用COL LBL技术沉积的超薄胶原蛋白聚集层稳定原代肝细胞超过14天,微流体装置。肝细胞没有顶部矩阵罩失去其分化表型,合同和抬离的微流体装置的表面上随时间3A-C)。与此相反,覆盖着超薄的胶原蛋白组装maintai肝细胞ñ其分化的形态和偏振超过14 (图3D-F)。细胞的生存力保持在大于90%(3G-1)。此外,与COL LBL处理的肝细胞的偏振随时间增加,表示心尖胆汁小管网络 (图3J-L)的发展。

除了细胞活力,形态和偏振,所述COL LBL技术恢复并稳定原代肝细胞中的类似的细胞板的标准技术水平的功能。白蛋白由肝细胞分泌低下电镀后,并保持低电平,除非细胞被诱导极化通过矩阵覆盖。后COL LBL治疗剂,稳定剂图4A)前白蛋白分泌由肝细胞的增加超过8-10天。尿素生产细胞接种后立即高,随时间下降的电池NOT覆盖有基质,后在肝细胞中稳定化COL LBL(图4B)8-10天尿素生产稳定。细胞色素P450(CYP)响应于刺激酶表达是肝细胞中的一个专门的功能。 CYP1A1在肝细胞的诱导响应于3-甲基胆回收并稳定长达14天由COL LBL治疗图4C)。

图1
图1.鼠尾胶原溶液化学修饰,以积极创造净利润或净负电荷的高分子溶液。 (A)中的琥珀酰化和甲基化反应,修改羧基和ε氨基组分别的示意图。(B)中示出的H +离子以改变关口后溶液的pH值所需要的相对数量移位氢滴定曲线衍生物拉根修饰。(C)的净电荷(平均值±SD)从H +轮换着算出的改性胶原溶液(B)的标准化为天然胶原的。 MC:甲基化的胶原蛋白。 SC:琥珀胶原蛋白。 AA:氨基酸残基。重新打印许可的9。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.层-层改性的胶原溶液沉积在肝细胞的顶端产生的超薄胶原基质组件。 (A)中的肝细胞接种于纤维连接蛋白上的微型装置和温育具有交替的甲基化和琥珀酰化的胶原蛋白溶液的示意图。 TEM横截面代表(20个细胞每组检查)CON控制(B)和 COL LBL处理后第2天的培养三)肝细胞。箭头:LBL胶原层。比例尺:2微米(D)COL LBL层每从TEM照片(N = 20个细胞的4个设备)来测量电池厚度(平均值±SD)。从9修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. COL LBL技术,文化保持肝细胞形态,活力,并在微器件极化超过14天,肝细胞,没有顶层的微型器件(阴性对照)合同,并抬离地面随着时间的推移(A-C)。改性胶原的LBL沉积维持肝细胞形态(D-F)和VIABility(G-I)的微型器件超过14天。 CMFDA是一个通用的细胞标记保留在非极化细胞(J)的细胞质中。随着时间的推移,胆小管的发展可以通过荧光团进入泪小管空间(K)的周围的细胞随着时间的发展(L)的排泄可以看出。图片比例尺:100微米。插图比例尺:50微米。从9修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

Figure4
图4. COL LBL稳定肝白蛋白和尿素的部分和CYP活性超过在微流体装置14天。(A)的白蛋白分泌由COL LBL肝细胞开始低和随时间增加ùNTIL在第10天(B)的尿素分泌COL LBL肝细胞达到平台随时间降低直至达到平台在第10天(C)的 CYP1A活性的诱导低,为2天,但在第7天显著增加,一这是经过14天平均值±SEM保持水平; COL LBL:肝细胞LBL胶原沉积后培养的; NoTop:肝细胞无顶基质层培养; N = 6-8的设备。从9修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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超薄纯胶原组件可以沉积在使用改性胶原的层 - 层淀积带电的细胞或材料的表面。这项研究的结果表明,甲基化和天然胶原的琥珀酰化创建聚阳离子和聚阴离子胶原溶液图1)可与层-层技术用于沉积超薄胶原基质组件上的细胞( 图2)或其它带电材料表面。这种超薄基质层可以稳定形态,存活率,和偏振细胞如肝细胞图3),播种在微流体装置,以及它们的功能之后图4)。

对于超薄胶原层的成功沉积,改性反应创建甲基和琥珀酰化胶原是至关重要的。因为羧基甲基化反应是不利的,则胶原甲基化反应必须在酸化的甲醇中进行,以驱动反应向前,根据勒夏特列原理。因此,从胶原pH值沉淀后,为了提高反应效率溶解沉淀的胶原蛋白在酸化甲醇中之前除去所有过量的水是很重要的。为琥珀酰化反应,保持溶液的pH值高于9同时加入琥珀酸酐的丙酮是至关重要的。连续监测pH并缓慢加入琥珀酐丙酮溶液的是确保进行有效的反应有帮助的。在层 - 层沉积,关键是要尽量减少时间使细胞去无介质。 10双层的过程需要大约20分钟,大约是只要大多数细胞应该没有媒体的保育箱的外侧。如果超过10双层必须存入,休息中的细胞培养基在培养箱中科拉之间3-4小时根沉积,以确保细胞的健康。在另一个极端,太少层不会有效地维持细胞形态。在我们的测试中,3层并没有维持细胞的形态,而10层做到了。

若干修改可以作出的程序来解决问题。时间和甲基化反应的温度可以在出现问题时进行改变。例如,降低反应温度至4℃,并增加时间7天可能提高效率。另外,根据聚合的pH提取期间的范围内,胶原有时会完全甲基化反应过程中溶解在酸化的甲醇中。如果发生这种情况,加10 M氢氧化钠以使pH达9-10后的反应,以便沉淀出胶原蛋白,以便它可以在下一步骤中被沉淀已完成。同时施加所述层 - 层沉积在微流体装置,小通道或端口可以成为厘ogged与胶原蛋白,通过增加该装置的流体阻力来表示。冲洗设备用新鲜媒体应消除任何障碍,使沉积的继续。

如这里所描述的层 - 层的胶原的手册沉积是在微流体装置的缩放和自动化方面的限制。然而,这种技术与标准的微流体的硬件,包括阀和泵可用于自动化的技术中,并在一次准备设备的阵列兼容。这种技术用于平板培养使用的另一个限制是,它需要相对大量天然胶原的。微流体应用,甲基化和琥珀酰化胶原的体积可以用于创建在很多设备超薄胶原层。用标准的组织培养板,另一方面,需要涂覆的孔的容积变得更加令人望而却步随阱大小。

这层 -由层技术的超薄胶原基质层的沉积可以通过使用替代的或功能上的修改,以及通过创建细胞由薄矩阵组件分离的多个层得到进一步的发展。虽然甲基化和琥珀酰化的相对简单的氨基酸侧链改性反应均用在这里,可替代的或额外的反应可以被用来代替,以创建官能胶原。官能化侧链应该仍然产生的蛋白质与整体正负电荷净,但是这样的官能化可以是用于各种应用是有用的。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

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References

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McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).More

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