Protocol
1. Forberedelse af Native Opløselig Collagen Solution
- Forbered eller købe 200 mg syrnet, opløselig, type I collagen fra rotte haler på 1-3 mg / ml ved anvendelse af standard isolation protokoller, såsom beskrevet af Piez et al. 15
- Skalere mængde udgangsmateriale baseret på den ønskede slutvolumen af modificerede kollagen løsninger. Ca. gøre 25-30 ml methyleret og 25-30 ml succinylerede kollagenopløsninger, hver ved 3 mg / ml, fra 200 mg af opløseligt nativt collagen.
2. Collagen Methylering
- Fortynd 100 mg af det native, syrnet (pH 2-3) collagen-opløsning til en koncentration på 0,5 mg / ml med iskoldt sterilt vand og opløsningen opbevares på is for at undgå gelering.
- PH indstilles kollagenopløsningen til 9-10 med et par dråber 1 N NaOH og omrøres ved stuetemperatur i 30 minutter. Observere collagen bundfald, hvilket opløsningen at blive uklar. Spin ned udfældede collagen-opløsning ved 3000 x g i 25 min. En klar, gellignende bundfald skal være synlig i bunden af rørene. Aspirer og korrekt bortskaffelse af supernatanten.
- Resuspender udfældede collagen i 200 ml methanol med 0,1 N HCI og lade metyleringen at forekomme under omrøring ved stuetemperatur i 4 dage. Kollagen vil ikke opløses, men bør bryde ud i meget små synlige stykker, der vil gøre opløsningen uklar.
- Efter methylering, centrifugeres opløsningen ved 3000 x g i 25 min for at pelletere den methylerede collagen. Aspirér og bortskaffe det sur methanol supernatanten.
- Opløs methyleret collagen i 25 ml sterilt PBS, hvilket gav en koncentration på ca. 3 mg / ml, ved gentagen pipettering og filtreres opløsningen gennem en 60 um cellefilter. Justere pH af opløsningen til 7,3-7,4 ved anvendelse af 20 pi trin på 1 N NaOH.
- Vurdere concentration af opløsningen under anvendelse af et kommercielt rotte-collagen ELISA-kit eller hydroxyprolin assay kit. Løsningen på 3 mg / ml med sterilt PBS fortyndet.
- Steriliser methyleret collagen-opløsning ved at overføre den til en glasflaske med skruelåg, omhyggeligt lagdeling 3 ml chloroform ved bunden af flasken, lader man flasken for at indstille O / N ved 4 ° C, og derefter aseptisk fjerne og lagre øverste lag, som er methyleret collagen.
- Opløsningen opbevares ved 4 ° C til brug inden for 1 måned.
3. Kollagen succinylering
- Fortynd den anden 100 mg af det native, syrnet (pH 2-3) collagen-opløsning til en koncentration på 0,5 mg / ml med iskoldt sterilt vand og opløsningen opbevares på is for at undgå gelering.
- PH indstilles kollagenopløsningen til 9-10 med et par dråber 1 N NaOH og omrøres ved stuetemperatur i 30 minutter. Kollagen skal udfældes, hvilket opløsningen at blive uklar.
- Opløs 40 mg succinic anhydrid (0,4 mg per mg collagen) i 10 ml acetone (1/20 th volumenet af kollagen opløsning). Langsomt (i ca. 0,5 ml intervaller) tilsættes denne blanding til collagen opløsningen under omrøring under kontinuerlig overvågning af pH. Opretholde pH over 9,0 ved tilsætning af 1 eller 2 dråber 1 N NaOH, når pH nærmer 9,0.
- Fortsæt omrøring ved stuetemperatur i 120 minutter efter tilsætning alle de ravsyreanhydrid i acetone. Overhold løsningen på at blive klar som succinylerede kollagen opløses. Regelmæssigt kontrollere pH for at sikre den forbliver over 9,0.
- Indstil opløsningens pH til 4,0 med intervaller 20 pi af 1 N HCI. Overhold løsningen uklar igen, som den succinylerede kollagen udfældes.
- Efter succinylering, centrifugeres opløsningen ved 3000 x g i 25 minutter til pelletering af succinyleret collagen. Aspirér og bortskaffe det syrnede supernatanten med uomsat ravsyreanhydrid.
- Opløs succinyleret collageni 25 ml sterilt PBS, hvilket giver en koncentration på ca. 3 mg / ml, ved gentagen pipettering og filtreres opløsningen gennem en 60 um cellefilter. Justere pH af opløsningen til 7,3-7,4 ved anvendelse af 20 pi trin på 1 N NaOH.
- Vurdere koncentrationen af opløsningen ved hjælp af et kommercielt rotte-collagen ELISA-kit eller hydroxyprolin assay kit. Løsningen på 3 mg / ml med sterilt PBS fortyndet.
- Steriliser succinylerede collagen opløsning ved at overføre den til en glasflaske med skruelåg, omhyggeligt lagdeling 3 ml chloroform ved bunden af flasken, lader man flasken for at indstille O / N ved 4 ° C, og derefter aseptisk fjerne og lagre øverste lag, som er succinyleret collagen.
- Opløsningen opbevares ved 4 ° C til brug inden for 1 måned.
4. Verifikation af Collagen Ændringer
- Forbered 1 ml prøver fra hver af de indfødte, methylerede og succinylerede kollagen løsninger og fortyndes til en koncentration på 0,1 mg / ml med sterilt rent vand for hydrogen ion titrering. Fortynd bufferen mindst 1000 gange ved dialyse mod vand gennem en 10 kDa cutoff membraneusing 3 opløsning ændringer i mindst 4 timer hver.
- Justere pH af opløsningerne til 7,3 med små mængder NaOH og HCI. Brug af pH 7,3 som en vilkårlig reference, udføre hydrogen ion titrering på hver af prøverne som beskrevet af Tanford 16 at skabe titreringskurver for de native, methylerede og succinylerede kollagenopløsninger.
- Plot ændringen i pH per volumen af tilsat syre versus antallet af bundet H + ioner pr molekyle. Den høje pH "amino" interval bør vise et skift i succinylerede collagen imod den neutrale punkt (et tab af aminogrupper), og den lave pH "carboxyl" interval bør vise en venstregående forskydning i methyleret collagen (et tab af carboxylgrupper ) og en mod højre skift i succinylerede collagen (en gevinst i carboxylgruppes), sammenlignet med det native collagen.
- Vurdere effektiviteten af succinyleringsmidlet reaktionen ved at bestemme% af aminogrupper i det native collagen erstattet af succinylering hjælp af 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBA) kolorimetri, ifølge standardprotokoller 17,18.
5. Fabrikation af mikrofluidenheder og cellepodning
- Fabrikere mikrofluidenheder hjælp standardmetoder 9. Brug replika støbning af PDMS fra SU-8 mestre på silicium defineres ved hjælp fotolitografi at skabe mikrofluide cellekultur kamre med 100 um høje, 0,4-1,5 mm bred og 1-10 mm lange kanaler for cellevækst.
- Brug en plasma renere at oxidere overfladerne af enheden og et objektglas, og tryk derefter sammen til binding. Efter sterilisering af anordningen ved udsættelse for UV-lys i mindst 30 minutter, fylde kammeret med 50 ug / ml fibronectin i sterilt PBS og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter. Seed enheden med celler, såsom primære rotte eller humane hepatocytter, som kræver en kollagen gel til stabilisering af fænotype eller differentiering tilstand. Vi bruger 20 pi frisk isolerede primære rottehepatocytter 7,19 eller kommercielt tilgængelige kryopræserverede primære humane hepatocytter podet ved 14 × 10 6 celler / ml pr enhed.
- Lade cellerne fæstne sig i 4-6 timer, og derefter udvaske separate celler og erstatte klædningen medier med vækstmedie. Inkuber O / N at sikre fuld cellespredning og skabe et konfluent monolag af celler.
6. Layer-på-lag collagendeponering
- I en laminar flow vævskultur hætte, udarbejde tilstrækkelige mængder methylerede og succinylerede kollagen løsninger til 10 anvendelser af hver opløsning per device, samt et par ml medier. Hold løsninger på is. Vi bruger 20 pi (10-15 gange den samlede enhed volumen) collagen per lag per enhed.
- Væreegrenering med methylerede (polycationic) løsning, skiftevis rødmen enhederne med 20 ul methylerede og derefter succinyleret kollagen løsninger, venter 1 min mellem hver ansøgning. Skyl anordningen i alt 10 gange per opløsning, som bør tage ca. 20 min. Arbejde hurtigt for at minimere den tid, cellerne er uden medier.
- Overhold kollagen langsomt ophobes ved indløb / udløb afhængigt af dens størrelse. Hvis modstanden til fluid flow stiger, skylle enheden en gang eller to gange med medierne, og derefter fortsætte lagdeling.
- Efter påføring alle lagene, skylles enheden to gange med frisk medium og vende tilbage til inkubatoren. Afhængigt af celletypen, den ekstracellulære matrix-induceret morfologiske ændringer, såsom øget polarisering i hepatocytter, skal være synlig inden for et par timer.
- Forbered repræsentative indretninger til transmissionselektronmikroskopi ved hjælp af standardmetoder 9 for at verificere tilstedeværelsen af en collagenmatrixmontering på toppen af dyrkede celler.
7. Stabilisering af cellefænotype og funktion
- Billede cellemorfologien, levedygtighed og polaritet ved anvendelse af standardmetoder for celletypen. For hepatocytter, indsamle billeder over 14 dage ved hjælp fasemikroskopi, LIVE / DEAD farvning for levedygtighed, og CMFDA farvestof til apikal polarisering at demonstrere effekten af kollagenaflejring.
- For cellemorfologi, skylle enheden gennem indløbet med pipette med 20 pi PBS at skylle, injicere 20 pi PBS, og billedet enheden ved hjælp fasekontrastmikroskopi.
- For LIVE / DEAD farvning, skylle enheden gennem indløbet med pipette med 20 pi PBS at skylle, injicere 20 ul LIVE / DEAD farvning løsning med DAPI udarbejdet efter producentens anvisninger, inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, skylles enheden igen med 20 pi PBS, og billedet enheden ved hjælp af fluorescens mikroskopi.
- For galde canaliculi farvning, skylle enheden gennem indløbet med pipette med 20 pi PBS for at skylle, injiceres 20 pi 2 uM CMFDA farveopløsning med DAPI fremstillet ved at følge producentens instruktioner, inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, skylles enheden igen med 20 pi PBS, og billedet enheden ved hjælp af fluorescens mikroskopi.
- Saml de brugte medier og måle cellulære metaboliske produkter til passende tidspunkter i løbet af kulturen varighed til at bestemme cellens funktion. For hepatocytter, måle mængden af albumin og urinstof i de brugte medier.
- Udfør endpoint funktionelle analyser på cellerne selv, såsom vurdering enzym aktivitetsniveauer, antistoffarvning eller RNA-analyse. For hepatocytter, fremkalde og måle cytokrom P450 enzym aktiviteter eller fase II-konjugation enzym glutathion S-transferase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Native kollagen kan ændres ved hjælp af methylering og succinylering at skabe polycationic og polyanioniske kollagen-løsninger til brug i lag-på-lag deposition. Succinylering modificerer e-aminogrupper af nativt collagen med succinylgrupper og methylering modificerer carboxylgrupperne af nativ collagen med en methylgruppe (figur 1A). Disse ændringer kollagenproteinet aminosyresidekæder ændrer pH titreringskurver for løsningerne. Succinylering reducerer antallet af aminogrupper og øger antallet af carboxylgrupper, mens methylering har ingen effekt på aminogrupperne og reducerer antallet af carboxylgrupper, sammenlignet med nativt collagen (figur 1B). Disse modifikationer ændre det omhandlede beløb karakteristika kollagenmolekylerne. Succinylering fjerner positivt ladede grupper, og erstatter dem med negativt ladede grupper, og methylering fjerner negativt ladede grupper (figur 1C </ strong>).
Lag-på-lag aflejring af de methylerede og succinylerede kollagenopløsninger (COL LBL) skaber en ultratynd collagenmatrix montering oven på ladede overflader, såsom celler (figur 2A). Primære hepatocytter podet på fibronectin-coatede glas inden en mikrofluidanordning (figur 2B) kan overtrækkes med en sådan rent collagenmatrix samling (figur 2C). Deponering af 10 dobbeltlag på celler skaber et collagen lagtykkelse på ca. 140 nm (figur 2D).
Den ultratynde kollagen forsamling lag aflejret ved hjælp af COL LBL teknikken stabiliserer primære hepatocytter i over 14 dage i mikrofluidenheder. Hepatocytter uden en top matrix dæksel mister deres differentierede fænotype, kontrakt, og løft overfladen af mikrofluidenheder over tid (fig. 3A-C). I modsætning hertil hepatocytter dækket med en ultratynd kollagen samling maintain deres differentierede morfologi og polarisering over 14 dage (Figur 3D-F). Levedygtigheden af cellerne blev holdt på mere end 90% (figur 3G-I). Hertil kommer, at polariseringen af hepatocytterne behandles med COL LBL steg over tid, viser udviklingen af en apikal biliær canaliculære netværk (Figur 3J-L).
Ud over cellelevedygtighed, morfologi og polarisering, COL LBL teknikken genopretter og stabiliserer funktionen af primære hepatocytter på et niveau svarende til standardteknikker for celler i plader. Udskillelsen af albumin ved hepatocytter er lav umiddelbart efter udpladning, og fortsat lav, medmindre cellerne induceres til at polarisere gennem en matrix dækker. Efter COL LBL behandlingen, albuminsekretion af hepatocytter stigninger over 8-10 dage før stabilisering (Figur 4A). Urea produktion er høj umiddelbart efter celle såning og aftager over tid i celler not dækket med en matrix, urinstofproduktionen stabiliserer efter 8-10 dage i hepatocytter stabiliseret med COL LBL (figur 4B). Cytokrom P450 (CYP) enzym-ekspression i respons på stimuli er en specialiseret funktion af hepatocytter. Induktionen af CYP1A1 i hepatocytter som reaktion på 3-methylcholanthren blev udvundet og stabiliseret op til 14 dage ved COL LBL behandling (figur 4C).
Figur 1. rottehalecollagen opløsninger blev kemisk modificeret for at skabe netto positivt eller negativt ladet netto polymeropløsninger. (A) Skematisk fremstilling af succinyleringsmidlet og methylering reaktioner, der modificerer carboxyl- og e-aminogrupper, henholdsvis. (B) Hydrogen titreringskurve derivater viser ændringer i det relative antal af H + ioner, der er nødvendige for at ændre opløsningens pH-værdi efter collagen modifikation. (C) De nettoladninger (middelværdi ± SD) af de modificerede kollagenopløsninger beregnet fra H + skift i (B) normaliseret til nativt collagen. MC: methyleret collagen. SC: succinyleret collagen. AA: aminosyrerester. Re-print med tilladelse fra 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. lag-på-lag aflejring af modificerede kollagenopløsninger skabt en ultratynd collagenmatrix montering oven på hepatocytterne. (A) Skematisk gengivelse af hepatocytter podet på fibronectin på en microdevice og inkuberet med skiftevis methylerede og succinylerede kollagen løsninger. TEM tværsnit af repræsentant (20 celler undersøgt pr gruppe) conTROL (B) og COL LBL-behandlet (C) hepatocytter efter 2 dages dyrkning. Pile: LBL kollagen lag. Målestok:. 2 um (D) COL LBL lagtykkelse (gennemsnit ± SD) per celle målt fra TEM billeder (n = 20 celler fra 4 enheder). Modificeret fra 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. COL LBL teknik fastholdt hepatocyt morfologi, levedygtighed, og polarisering i microdevices over 14 dage i kultur. Hepatocytter uden øverste lag i microdevices (negativ kontrol) kontrakt og løft overfladen over tid (A-C). LBL aflejring af modificerede collagener fastholder hepatocyt morfologi (D-F) og viaBility (G-I) i microdevices over 14 dage. CMFDA er en generisk celle markør, der forbliver i cytoplasmaet af upolariseret hepatocytter (J). Over tid, kan udviklingen af galde-canaliculi ses ved udskillelsen af fluoroforen i canaliculære rum (K), der udvikler omkring cellerne over tid (L). Billede skala bar: 100 um. Indsat skala bar: 50 pm. Modificeret fra 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. COL LBL stabiliserer hepatocyt albumin og urinstof sektioner og CYP-aktivitet over 14 dage i mikrofluidapparater. (A) albuminsekretion af hepatocytter i COL LBL startede lav og steg med tiden until nå et plateau på dag 10. (B) Urinstof sekretion af COL LBL hepatocytter faldt med tiden, indtil den når et plateau på dag 10. (C) Induktion af CYP1A aktivitet var lav på dag 2, men signifikant forøget på dag 7, en niveau, der blev opretholdt i dag 14. Mean ± SEM; COL LBL: hepatocytter dyrket efter LBL kollagenaflejring; NoTop: hepatocytter dyrket uden øverste matricelag; n = 6-8 enheder. Modificeret fra 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultratynde ren kollagen samlinger kan deponeres på ladede celler eller materiale overflader ved hjælp lag-på-lag aflejring af modificerede collagener. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at methylering og succinylering af nativt collagen skaber polycationic og polyanioniske kollagenopløsninger (figur 1), der kan anvendes sammen med lag-på-lag teknik til at deponere ultratynde collagenmatrix samlinger på celler (figur 2) eller andre ladede materialeoverflader. Sådanne ultratynde matrixlag kan stabilisere morfologi, levedygtighed og polarisering af celler, såsom hepatocytter (figur 3), efter podning i mikrofluidapparater, samt deres funktion (figur 4).
For vellykkede aflejring af ultratynde kollagen lag, de modifikationsreaktioner skaber de methylerede og succinylerede kollagener er kritiske. Fordi carboxylgruppen metyleringen ikke er gunstig, dekollagen methylering Reaktionen udføres i sur methanol at drive reaktionen fremad, baseret på Le Chateliers princip. Derfor er det vigtigt at fjerne alt overskydende vand fra collagen efter pH udfældning før opløse det udfældede collagen i sur methanol med henblik på at forøge reaktionshastigheden effektivitet. For succinyleringsmidlet reaktionen opretholdelse af pH af opløsningen over 9, mens tilsætning af ravsyreanhydrid i acetone er kritisk. Kontinuerlig overvågning af pH og langsom tilsætning af ravsyreanhydrid acetoneopløsning er nyttige for at sikre en effektiv reaktion. Under lag-på-lag deposition, er det vigtigt at minimere den tid, at cellerne gå uden medier. Proceduren for 10 dobbeltlag tager ca. 20 minutter, hvilket er omkring så længe de fleste celler bør ikke medier uden for inkubatoren. Hvis mere end 10 dobbeltlag skal deponeres, hvile cellerne i medierne i en inkubator for 3-4 timer mellem collagen depositioner at sikre sundheden for cellerne. I den anden ende, også vil få lag ikke være effektiv i at bevare cellemorfologi. I vores test, havde 3 lag ikke opretholde cellemorfologi, mens 10 lag gjorde.
Adskillige modifikationer kan foretages til de procedurer, der fejlfinding af problemer. Tiden og temperaturen af metyleringen kan varieres, hvis der opstår problemer. For eksempel faldende reaktionstemperaturen til 4 ° C og forøgelse af tiden til 7 dage kan øge effektiviteten. Også, afhængigt af omfanget af polymerisering under pH udvinding, kollagen vil undertiden opløses fuldstændigt i sur methanol under metyleringen. Hvis dette sker, tilsættes 10 M NaOH for at bringe pH op til 9-10 efter reaktionen er færdig med henblik på at udfælde collagen, så det kan pelleteres i det næste trin. Mens anvendelse af lag-på-lag aflejring i mikrofluidapparater, kan små kanaler eller havnene bliver clogged med kollagen, indikeret ved en stigning i indretningen fluide modstand. Gennemskylning af enheden med friske medier bør fjerne eventuelle blokeringer, så deposition at fortsætte.
Den manuelle aflejring af lag-på-lag kollagen som beskrevet her er der en begrænsning med hensyn til skalering og automatisering af mikrofluidenheder. Men denne teknik er kompatibel med standard mikrofluid hardware, herunder ventiler og pumper, der kan anvendes til at automatisere teknikken og forberede arrays af enheder på én gang. En anden begrænsning ved denne teknik til anvendelse i pladekultur er, at det kræver en relativt stor mængde af nativt collagen. For mikrofluid anvendelse, kan mængden af methylerede og succinyleres collagener bruges til at skabe ultratynde kollagenlagene i mange enheder. Med standard væv pladekultur, på den anden side, de er nødvendige for at coate brønde mængder bliver mere uoverkommelige med stigende godt størrelse.
Denne Lag-på-lag-teknik til udfældning af ultratynde collagenmatrix lag kan videreudvikles ved anvendelse af alternative eller funktionelle ændringer, samt ved at oprette flere lag af celler adskilt af tynde matrix samlinger. Selv de relativt enkle aminosyresidekæde modifikationsreaktioner af methylering og succinylering her blev anvendt kunne alternative eller yderligere reaktioner anvendes i stedet for at skabe funktionaliserede collagener. Den funktionaliserede sidekæder skal stadig give proteiner med netto samlede positive og negative ladninger, men en sådan funktionalisering kan være nyttige til en lang række applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
- Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
- Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
- Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
- Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
- McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
- Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
- Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
- Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
- Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
- Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
- Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
- Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
- Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
- Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
