Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

doi: 10.3791/53078 Published: September 29, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Voorbereiding van de Native Oplosbare Collageen Solution

  1. Bereid of aankoop 200 mg aangezuurd oplosbaar type I collageen van staarten rat op 1-3 mg / ml middels standaard isolatietechnieken protocollen zoals beschreven door Piez et al. 15
  2. Schaal de hoeveelheid uitgangsmateriaal op basis van het gewenste eindvolume van gemodificeerd collageen oplossingen. Ongeveer maken 25-30 ml methylalcohol en 25-30 ml gesuccinyleerd collageen oplossingen, elk met 3 mg / ml, 200 mg oplosbaar natief collageen.

2. Collageen Methylering

  1. Verdun 100 mg van de natieve, aangezuurd (pH 2-3) collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 mg / met ijskoud steriel water ml en houd de oplossing op ijs gelering te voorkomen.
  2. Stel de pH van het collageen oplossing 9-10 met een paar druppels 1 N NaOH en roer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Let op de collageen neerslag, waardoor de oplossing troebel. Spin down de neergeslagen collageen oplossing bij 3000 x g gedurende 25 min. Een heldere, gelachtige precipitaat moet zichtbaar op de bodem van de buisjes. Aspireren en correct afvoeren van de bovenstaande vloeistof.
  3. Resuspendeer het neergeslagen collageen in 200 ml methanol met 0,1 N HCl en laat de methyleringsreactie optreden onder roeren bij kamertemperatuur gedurende 4 dagen. Het collageen lost niet op, maar moet apart breken in zeer kleine stukjes zichtbaar dat de oplossing troebel maken.
  4. Na methylatie Centrifugeer de oplossing bij 3000 xg gedurende 25 min naar het gemethyleerde collageen pellet. Aspireren en afvoeren van de aangezuurde methanol supernatant.
  5. Los het gemethyleerde collageen in 25 ml steriel PBS, waardoor een concentratie van ongeveer 3 mg / ml, met herhaalde pipetteren, en filtreer de oplossing door een 60 urn zeef cel. Stel de pH van de oplossing 7,3-7,4 via 20 gl stappen van 1 N NaOH.
  6. Beoordeel de concentration van de oplossing met behulp van een commercieel rat collageen ELISA-kit of hydroxyproline testkit. Verdun de oplossing 3 mg / ml met steriele PBS.
  7. Steriliseer de gemethyleerde collageenoplossing door deze naar een glazen flesje met een schroefdop, zorgvuldig lagen 3 ml chloroform op de bodem van de fles, zodat de fles O / N ingesteld op 4 ° C, en vervolgens aseptisch verwijderen en de toplaag, welke de gemethyleerd collageen.
  8. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand.

3. Collageen succinileringsgraad

  1. Verdun de andere 100 mg van de natieve, aangezuurd (pH 2-3) collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 mg / met ijskoud steriel water ml en houd de oplossing op ijs gelering te voorkomen.
  2. Stel de pH van het collageen oplossing 9-10 met een paar druppels 1 N NaOH en roer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Het collageen moet neerslaan, waardoor de oplossing troebel.
  3. Los op 40 mg succinic anhydride (0,4 mg per mg collageen) in 10 ml aceton (1/20 ste het volume van de collageenoplossing). Langzaam (ongeveer 0,5 ml stappen) voeg dit mengsel aan de collageenoplossing onder roeren terwijl continu de pH. Handhaving van de pH boven 9,0 door toevoeging van 1 of 2 druppels 1 N NaOH de pH 9,0 bereikt.
  4. Blijf roeren bij kamertemperatuur 120 min na het toevoegen van alle barnsteenzuuranhydride in aceton. Neem de oplossing duidelijk worden als de gesuccinyleerde collageen oplost. Controleer regelmatig de pH-waarde om ervoor te zorgen dat boven 9,0 blijft.
  5. Stel de pH van de oplossing tot 4,0 met 20 gl stappen van 1 N HCl. Neem de oplossing bewolkt weer, omdat de gesuccinyleerde collageen neerslaat.
  6. Na succinileringsgraad Centrifugeer de oplossing bij 3000 xg gedurende 25 min naar het gesuccinyleerde collageen pellet. Aspireren en afvoeren van de bovenstaande aangezuurd met gereageerde barnsteenzuuranhydride.
  7. Los de gesuccinyleerd collageenin 25 ml steriel PBS, waardoor een concentratie van ongeveer 3 mg / ml, met herhaalde pipetteren, en filtreer de oplossing door een 60 urn zeef cel. Stel de pH van de oplossing 7,3-7,4 via 20 gl stappen van 1 N NaOH.
  8. Beoordeel de concentratie van de oplossing met behulp van een commercieel collageen rat ELISA-kit of hydroxyproline testkit. Verdun de oplossing 3 mg / ml met steriele PBS.
  9. Steriliseer de gesuccinyleerde collageenoplossing door deze naar een glazen flesje met een schroefdop, zorgvuldig lagen 3 ml chloroform op de bodem van de fles, zodat de fles O / N ingesteld op 4 ° C, en vervolgens aseptisch verwijderen en de toplaag, welke de gesuccinyleerde collageen.
  10. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand.

4. Verificatie van de Collagen Wijzigingen

  1. Bereid 1 ml monsters van elk van de natieve, gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen en verdun tot een concentration van 0,1 mg / met steriel zuiver water waterstofionen titratie ml. Verdun de buffer tenminste 1000-voudig door dialyse tegen water door een 10 kDa cutoff membraneusing 3 oplossing verandert gedurende ten minste 4 uur elk.
  2. Stel de pH van de oplossingen tot 7,3 met kleine hoeveelheden NaOH en HCl. Gebruik van pH 7,3 als een willekeurige referentie voeren waterstofionen titratie op elk van de monsters zoals beschreven door Tanford 16 titratie curven voor de natieve, gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen.
  3. Plot de pH verandering per volume zuur versus het aantal gebonden H + -ionen per molecuul toegevoegd. De hoge pH "amino" bereik zou een verschuiving in de gesuccinyleerde collageen aan het sterpunt (verlies van aminegroepen) vertonen, en de lage pH "carboxyl" bereik zou een verschuiving naar links in de gemethyleerde collageen (een verlies van carboxylgroepen blijkt ) en een verschuiving naar rechts in de gesuccinyleerde collageen (een winst in carboxylgroeps), vergeleken met het natief collageen.
  4. Beoordelen van de werkzaamheid van de succinilerings- reactie door bepaling van het% van de aminogroepen in de natieve collageen vervangen door succinyleren met de 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBA) colorimetrische methode volgens standaard protocollen 17,18.

5. Fabricage van microfluïdische apparaten en Cell zaaien

  1. Fabriceren microfluïdische apparaten met behulp van standaard methoden 9. Gebruik replica gieten van PDMS van de SU-8 masters op silicium gedefinieerd met behulp van fotolithografie om microfluïdische celkweek kamers te creëren met 100 micrometer lang, 0,4-1,5 mm breed, en 1-10 mm lange kanalen voor celgroei.
  2. Gebruik een plasma cleaner om de oppervlakken van het apparaat en een glasplaatje oxideren en druk samen om obligatie. Na het steriliseren van de inrichting door blootstelling aan UV licht gedurende ten minste 30 min, vult de kamer met 50 ug / ml fibronectine in steriele PBS en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min. Zaad van de inrichting met cellen, zoals primaire rat en humane hepatocyten, waarbij een collageengel voor het stabiliseren van fenotype of differentiatie toestand vereist. We maken gebruik van 20 ul van vers geïsoleerde primaire rat hepatocyten 7,19 of in de handel verkrijgbaar gecryopreserveerde primaire humane hepatocyten gezaaid met 14 x 10 6 cellen / ml per apparaat.
  3. Laat de cellen te hechten voor 4-6 uur, en daarna wassen uit losse cellen en vervang de beplating media met een groei media. Incubeer O / N op volledige cellen waarborgen spreiding en een confluente monolaag van cellen.

6. Laag-voor-laag collageenafzetting

  1. In een laminaire stroming weefselkweek kap Bereid voldoende hoeveelheden gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen voor 10 toepassingen van elke oplossing per apparaat, evenals een paar ml media. Houd de oplossingen op ijs. We maken gebruik van 20 ul (10-15 keer het totale volume van het apparaat) van collageen per laag per apparaat.
  2. Zijnstrikken met de gemethyleerd (polykationische) oplossing, alternatieve spoelen van de apparaten met 20 ul van gemethyleerd en vervolgens gesuccinyleerd collageen oplossingen, wacht 1 minuut tussen iedere toepassing. Spoel de inrichting in totaal 10 keer per oplossing, die ongeveer 20 minuten moet nemen. Werk snel de tijd de cellen zonder media te minimaliseren.
  3. Observeren collageen langzaam ophopen aan de ingang / uitgang afhankelijk van de grootte. Als de weerstand tegen stroming toeneemt, spoelt het apparaat een of twee keer met de media, en dan verder gelaagdheid.
  4. Na het aanbrengen van alle lagen, de inrichting spoel tweemaal met vers medium en terug naar de incubator. Afhankelijk van het celtype, de extracellulaire matrix geïnduceerde morfologische veranderingen, zoals verhoogde polarisatie in hepatocyten, zichtbaar binnen enkele uren moet zijn.
  5. Bereid representatieve inrichtingen voor transmissie elektronenmicroscopie middels standaardwerkwijzen 9 om de aanwezigheid van een collageen matrix verifiërenmontage bovenop de gekweekte cellen.

7. Stabilisatie van celfenotype en functie

  1. Afbeelding de celmorfologie, levensvatbaarheid en polariteit toepassing van standaardmethoden voor het celtype. Voor hepatocyten, beelden verzamelen van meer dan 14 dagen met behulp van fase microscopie, Live / DEAD kleuring voor levensvatbaarheid en CMFDA kleurstof voor apicale polarisatie om de effecten van de collageen afzetting tonen.
  2. Voor celmorfologie, spoelt het apparaat via de inlaat met een pipet met 20 ul van PBS te spoelen, injecteren 20 pi PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fasecontrastmicroscopie.
  3. Voor Live / DEAD kleuring, spoelt de inrichting door de inlaat met een pipet met 20 pl PBS te spoelen, injecteren 20 ul van LIVE / DEAD kleuroplossing met DAPI bereid volgens de instructies van de fabrikant, incubeer 30 min bij 37 ° C, spoelen weer apparaat met 20 ul van PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fluorescentie microscopie.
  4. Voor gal canaliCuli kleuring, spoelt de inrichting door de inlaat met een pipet met 20 pl PBS te spoelen, injecteer 20 gl 2 pM CMFDA kleuroplossing met DAPI bereid volgens de instructies van de fabrikant, incubeer 30 min bij 37 ° C, spoel het apparaat opnieuw met 20 ul van PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fluorescentie microscopie.
  5. Het verzamelen van de uitgegeven media en meet cellulaire metabolische producten op de juiste tijdstippen over de duur cultuur aan de celfunctie te bepalen. Voor hepatocyten, meet de hoeveelheid albumine en ureum in de media bracht.
  6. Voer eindpunt functionele analyses van de cellen zelf, zoals het beoordelen enzymactiviteit niveaus antilichaamkleuring of RNA analyse. Voor hepatocyten induceren en het meten van cytochroom P450 enzym activiteiten of fase II vervoeging enzym glutathion S-transferase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Natief collageen kan worden gewijzigd met behulp van methylering en succinileringsgraad te polykation en polyanion collageen oplossingen voor gebruik in laag-voor-laag depositie creëren. Succinileringsgraad wijzigt de ε-aminogroepen van natief collageen met succinyl groepen en methylering wijzigt de carboxylgroepen van natief collageen met een methylgroep (Figuur 1A). Deze modificaties aan het collageen eiwit aminozuurzijketens weg pH titratie krommen voor oplossingen. Succinileringsgraad vermindert het aantal aminogroepen en verhoogt het aantal carboxylgroepen, terwijl methylatie heeft geen effect op de aminogroepen en vermindert het aantal carboxylgroepen, vergeleken met natief collageen (Figuur 1B). Deze modificaties veranderen de ladingseigenschappen van de collageenmoleculen. Succinileringsgraad verwijdert positief geladen groepen en vervangt ze door negatief geladen groepen, en methylatie verwijdert negatief geladen groepen (figuur 1C </ strong>).

Layer-by-layer deposition van de gemethyleerde en gesuccinyleerd collageen oplossingen (COL LBL) creëert een ultradunne collageenmatrix montage bovenop geladen oppervlakken, zoals cellen (Figuur 2A). Primaire hepatocyten gezaaid op met fibronectine gecoate glas binnen een microfluïdische inrichting (figuur 2B) kan worden gecoat met een dergelijke zuiver collageen matrix samenstel (figuur 2C). Afzetting van 10 dubbellagen op cellen leidt tot een collageen dikte van ongeveer 140 nm (figuur 2D) laag.

De ultradunne collageen assemblage afgezet met behulp van de COL LBL techniek stabiliseert primaire hepatocyten voor meer dan 14 dagen in microfluïdische apparaten. Hepatocyten zonder top matrix afdekking verliezen hun gedifferentieerd fenotype, contract, en til het oppervlak van microfluïdische apparaten in de tijd (Fig. 3A-C). Daarentegen hepatocyten bedekt met een ultradunne collageen samenstel maintain hun gedifferentieerde morfologie en polarisatie meer dan 14 dagen (Figuur 3D-F). De levensvatbaarheid van de cellen werd op meer dan 90% (Figuur 3G-I). Bovendien, de polarisatie van de hepatocyten behandeld met COL LBL loop der tijd toenemen, toont de ontwikkeling van een apicale gal canaliculaire netwerk (Figuur 3J-L).

Naast cellevensvatbaarheid, morfologie en polarisatie, de COL LBL techniek herstelt en stabiliseert de functie van primaire hepatocyten op niveaus vergelijkbaar met standaardtechnieken voor cellen in platen. De afscheiding van albumine door hepatocyten is vanaf onmiddellijk na plateren en blijft laag, tenzij de cellen geïnduceerd polariseren door een matrix bekleding. Na COL LBL behandeling, de albumine-uitscheiding door de hepatocyten toeneemt dan 8-10 dagen voor het stabiliseren (figuur 4A). Ureum productie is hoog onmiddellijk na cel zaaien en neemt na verloop van tijd in de cellen not bedekt met een matrix, ureumproductie stabiliseert na 8-10 dagen in hepatocyten gestabiliseerd met COL LBL (Figuur 4B). Cytochroom P450 (CYP) enzymexpressie in reactie op stimuli is een gespecialiseerde functie van hepatocyten. De inductie van CYP1A1 in hepatocyten in reactie op 3-methylcholanthreen teruggewonnen en gestabiliseerd tot 14 dagen bij het ​​COL LBL behandeling (Figuur 4C).

Figuur 1
Figuur 1. Rat staart collageen oplossingen werden chemisch gemodificeerd om de netto positief te maken of netto negatief polymeeroplossingen gebracht. (A) Schematische weergave van de succinilerings- en methyleringsreacties dat carboxyl- en ε-aminogroepen te wijzigen, respectievelijk. (B) Waterstof titratiecurve derivaten toont verschuivingen in de relatieve aantallen van H + -ionen nodig pH van de oplossing na col wijzigenlagen wijziging. (C) De netto lasten (gemiddelde ± SD) van de gemodificeerde collageen oplossingen berekend uit de H + verschuivingen in (B) genormaliseerd om native collageen. MC: gemethyleerd collageen. SC: gesuccinyleerd collageen. AA: aminozuren. Re-print met toestemming van 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Laag-voor-laag depositie van collageen gemodificeerde oplossingen creëerde een ultradunne collageenmatrix montage bovenop de hepatocyten. (A) Schematische weergave van hepatocyten gezaaid op fibronectine op een microdevice en geïncubeerd met afwisselend gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen. TEM doorsneden van representatieve (20 cellen per groep onderzocht) control (B) en COL LBL-behandelde (C) hepatocyten na 2 dagen van de cultuur. Pijlen: LBL collageenlaag. Schaal bar: 2 (D) COL LBL dikte urn (gemiddelde ± SD) per cel gemeten van TEM-beelden (n = 20 cellen van 4 apparaten).. Gewijzigd ten opzichte van 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. De COL LBL techniek onderhouden hepatocyte morfologie, levensvatbaarheid en polarisatie in Microdevices meer dan 14 dagen in de cultuur. Hepatocyten zonder toplaag in Microdevices (negatieve controle) contract en til de oppervlakte in de tijd (A-C). LBL afzetting van gemodificeerde collageen onderhoudt hepatocyte morfologie (D-F) en Viabiliteit (G-I) in Microdevices meer dan 14 dagen. CMFDA is een generieke cel merker die in het cytoplasma van niet gepolariseerd hepatocyten (J) blijft. Na verloop van tijd, kan de ontwikkeling van galcanaliculi worden gezien door de uitscheiding van het fluorofoor in de canaliculaire ruimte (K) dat zich rond de cellen in de tijd (L). Afbeelding schaal bar: 100 micrometer. Inzet schaal bar: 50 pm. Gewijzigd ten opzichte van 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 4
Figuur 4. COL LBL stabiliseert hepatocyte albumine en ureum secties en CYP-activiteit meer dan 14 dagen in microfluïdische apparaten. (A) albumine-uitscheiding door hepatocyten in COL LBL begon laag en verhoogd met de tijd until bereiken van een plateau op dag 10. (B) Ureum secretie door COL LBL levercellen verminderd met de tijd tot het bereiken van een plateau op dag 10. (C) De inductie van CYP1A activiteit laag was op dag 2, maar aanzienlijk toegenomen op dag 7, een niveau dat werd gehandhaafd door middel van de dag 14. De gemiddelde ± SEM; COL LBL: hepatocyten gekweekt na LBL collageen afzetting; NoTop: hepatocyten gekweekt met geen top matrix laag; n = 6-8 inrichtingen. Gewijzigd ten opzichte van 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ultradunne pure collageen samenstellingen kunnen worden gestort op rekening gebracht cellen of materiaal oppervlakken met behulp van laag-voor-layer deposition van gemodificeerde collageen. De resultaten van deze studie tonen aan dat methylatie en succinylatie van natief collageen maken polykation en polyanion collageen oplossingen (figuur 1) die kan worden gebruikt met de laag-voor-laag techniek om ultradunne collageen matrix samenstellingen afzetten op cellen (figuur 2) of andere geladen materiaal oppervlakken. Dergelijke matrix ultradunne lagen kan de morfologie, levensvatbaarheid en polarisatie van cellen stabiliseren zoals hepatocyten (figuur 3), na zaaien in microfluïdische inrichtingen, alsmede hun functie (figuur 4).

Voor een succesvolle depositie van collageen ultradunne lagen, de modificatiereacties creëren van de gemethyleerde en gesuccinyleerde collagenen kritisch. Omdat de carboxylgroep methyleringsreactie niet gunstig, decollageen methyleringsreactie moet aangezuurde methanol worden uitgevoerd om de reactie uit op basis principe van Le Chatelier drijven. Daarom is het belangrijk om het overtollige water uit het collageen verwijderen nadat de pH neerslaan voordat het oplossen van het geprecipiteerde collageen in de aangezuurde methanol om de reactie te verhogen. Voor de succinileringsgraad reactie, de pH van de oplossing boven 9 tijdens het toevoegen van de barnsteenzuuranhydride in aceton kritisch. Continue monitoring van de pH en de langzame toevoeging van de barnsteenzuuranhydride aceton oplossing zijn nuttig om te zorgen voor een efficiënte reactie. Tijdens layer-by-layer deposition, is het essentieel om de tijd dat de cellen zonder media te minimaliseren. De procedure voor 10 bilagen duurt ongeveer 20 minuten, ongeveer zo lang als de meeste cellen dient media buiten de incubator. Als er meer dan 10 dubbellagen moet worden gedeponeerd, de rest van de cellen in de media in een incubator voor 3-4 uur tussen collagen afzettingen op de gezondheid van de cellen te waarborgen. Aan de andere kant zal te weinig lagen niet doeltreffend om celmorfologie zijn. In onze tests, hebben 3 lagen niet behouden cel morfologie, terwijl 10 lagen deed.

Verschillende wijzigingen kunnen worden aangebracht aan de procedures om problemen op te lossen. De tijd en temperatuur van de methyleringsreactie worden gevarieerd indien problemen ontstaan. Bijvoorbeeld, het verlagen van de reactietemperatuur tot 4 ° C en het verhogen van de tijd tot 7 dagen kunnen efficiëntie. Ook, afhankelijk van de mate van polymerisatie tijdens de pH extractie, collageen soms volledig oplossen in het aangezuurde methanol tijdens de methyleringsreactie. Als dit gebeurt, voeg 10 M NaOH om de pH naar 9-10 te brengen na de reactie teneinde het collageen neerslaan zodat deze bij de volgende stap kan worden gepelletiseerd voltooid. Terwijl het aanbrengen van de laag-voor-laag afzetting in microfluïdische inrichtingen kunnen kleine kanalen of poorten cl wordenogged met collageen, aangegeven door een verhoging van de inrichting vloeibare weerstand. Spoelen van het apparaat met verse media moeten eventuele blokkades te verwijderen, waardoor de afzetting te blijven.

De handleiding afzetting van de laag-voor-laag collageen zoals hier beschreven is een beperking wat betreft de schaal en automatisering van microfluïdische inrichtingen. Deze techniek is compatibel met standaard microfluïdische hardware, zoals kleppen en pompen kunnen worden gebruikt om de techniek te automatiseren en arrays apparaten tegelijkertijd te bereiden. Een andere beperking van deze techniek voor toepassing in plaat cultuur is dat het een relatief grote hoeveelheid van natief collageen vereist. Voor microfluïdische toepassing kunnen de hoeveelheden gemethyleerd en gesuccinyleerd collagenen worden gebruikt om ultradunne collageenlagen vele apparaten. Met standaard tissue plaat cultuur, anderzijds, de voor het bekleden putjes volumes geworden onbetaalbaar bij toenemende goed formaat.

Deze laag-voor-laag techniek voor de afzetting van collageen matrix ultradunne lagen kan verder worden ontwikkeld door alternatieve of functionele wijzigingen, alsmede door meerdere lagen cellen gescheiden door de dunne matrix samenstellingen. Hoewel het relatief eenvoudige aminozuurzijketen modificatiereacties van methylering en succinileringsgraad hier gebruikt, kunnen alternatieve of aanvullende reacties worden gebruikt in plaats teneinde gefunctionaliseerde collagenen maken. De gefunctionaliseerde zijketens moet nog eiwitten opleveren met netto totale positieve en negatieve ladingen, maar dergelijke functionalisering kan nuttig zijn voor diverse toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33, (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89, (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274, (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21, (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278, (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7, (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2, (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4, (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16, (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19, (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7, (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29, (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2, (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249, (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27, (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).More

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter