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Bioengineering

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

doi: 10.3791/53078 Published: September 29, 2015

Protocol

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1. Preparazione della soluzione nativa Solubile Collagene

  1. Preparare o acquistare 200 mg di acidificato, solubile, collagene di tipo I da code di ratto a 1-3 mg / ml utilizzando i protocolli di isolamento standard, come riportato da Piez et al. 15
  2. Scalare la quantità di materiale di partenza in base al volume finale desiderato soluzioni collagene modificati. Circa fare 25-30 ml di metilato e 25-30 ml di soluzione di collagene succinilate, ciascuno a 3 mg / ml, da 200 mg di collagene nativo solubile.

2. Collagene metilazione

  1. Diluire 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione.
  2. Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Osservare il precipitato collagene, causando la soluzione per diventare torbida. Spin giù la soluzione di collagene precipitato a 3.000 g per 25 min. Un chiaro, precipitato gelatinoso dovrebbe essere visibile nel fondo delle provette. Aspirare e smaltire il liquido surnatante.
  3. Risospendere il precipitato collagene in 200 ml di metanolo con HCl 0,1 N e lasciare che la reazione di metilazione di verifica con agitazione a temperatura ambiente per 4 giorni. Il collagene non si dissolvono, ma dovrebbe rompersi in pezzi molto piccoli visibili che renderanno la soluzione torbida.
  4. Dopo la metilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene denaturato. Aspirare e smaltire il surnatante metanolo acidificato.
  5. Sciogliere il collagene metilata in 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH.
  6. Valutare la concentration della soluzione con un commerciale collagene topo kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile.
  7. Sterilizzare la soluzione di collagene denaturato trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene denaturato.
  8. Conservare la soluzione a 4 ° C per l'uso entro 1 mese.

3. Il collagene succinilazione

  1. Diluire l'altra 100 mg del, acidificata (pH 2-3) soluzione di collagene nativo ad una concentrazione di 0,5 mg / ml con ghiaccio acqua sterile fredda e mantenere la soluzione in ghiaccio per evitare la gelificazione.
  2. Regolare il pH della soluzione di collagene di 9-10 con poche gocce di NaOH 1 N e agitare a temperatura ambiente per 30 min. Il collagene non precipitare, provocando la soluzione per diventare torbida.
  3. Sciogliere 40 mg di succinico anidride (0,4 mg per mg di collagene) in 10 ml di acetone (1/20 il volume della soluzione di collagene). Lentamente (in circa 0,5 ml incrementi) aggiungere il composto alla soluzione di collagene sotto agitazione mentre continuo monitoraggio del pH. Mantenere il pH superiori a 9,0 aggiungendo 1 o 2 gocce di NaOH 1 N come il pH si avvicina 9,0.
  4. Continua agitazione a temperatura ambiente per 120 minuti dopo l'aggiunta di tutti i anidride succinica in acetone. Osservare la soluzione a diventare chiaro come il collagene succinilata dissolve. Controllare periodicamente il pH per garantire che rimanga sopra 9,0.
  5. Regolare il pH della soluzione a 4,0 con 20 microlitri di 1 incrementi N HCl. Osservare la soluzione torbida di nuovo, come il collagene succinilata precipita.
  6. Dopo la succinilazione, centrifugare la soluzione a 3.000 × g per 25 minuti per far sedimentare il collagene succinilata. Aspirare e smaltire il surnatante acidificato con reagito anidride succinica.
  7. Sciogliere il collagene succinilatain 25 ml di PBS sterile, dando una concentrazione di circa 3 mg / ml, con pipettaggio ripetute, e filtrare la soluzione attraverso un colino cella di 60 micron. Regolare il pH della soluzione a 7,3-7,4 usando 20 ml incrementi di 1 N NaOH.
  8. Valutare la concentrazione della soluzione con un commerciale topo collagene kit ELISA o kit di analisi idrossiprolina. Diluire la soluzione di 3 mg / ml con PBS sterile.
  9. Sterilizzare la soluzione di collagene succinilata trasferendolo ad una bottiglia di vetro con tappo a vite, stratificazione accuratamente 3 ml di cloroformio sul fondo della bottiglia, consentono la bottiglia per impostare O / N a 4 ° C, e poi asetticamente rimuovere e conservare la strato superiore, che è il collagene succinilata.
  10. Conservare la soluzione a 4 ° C per l'uso entro 1 mese.

4. Verifica del collagene Modifiche

  1. Preparare 1 ml campioni da ciascuna delle soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilate e diluire ad una concentration di 0,1 mg / ml con acqua pura sterile per ioni idrogeno titolazione. Diluire ulteriormente il buffer almeno 1.000 volte con la dialisi contro acqua attraverso un taglio di 10 kDa membraneusing 3 soluzione cambia per almeno 4 ore ciascuna.
  2. Aggiustare il pH delle soluzioni a 7.3 con piccole quantità di NaOH e HCl. Utilizzando pH 7,3 come riferimento arbitraria, eseguire ione idrogeno titolazione su ciascuno dei campioni come descritto da Tanford 16 per creare curve di titolazione per le soluzioni collagene nativo, metilato, e succinilata.
  3. Tracciare la variazione di pH per volume di acido aggiunto rispetto al numero di ioni per molecola H + bound. La gamma "amino" alto pH dovrebbe mostrare un cambiamento nel collagene succinilata verso il punto neutro (perdita di gruppi amminici), e il basso pH range "carbossile" dovrebbe mostrare uno spostamento verso sinistra del collagene denaturato (perdita di gruppi carbossilici ) e uno spostamento verso destra della collagene succinilata (un guadagno in gruppo carbossilicos), rispetto al collagene nativo.
  4. Valutare l'efficacia della reazione succinilazione determinando la% di gruppi amminici in collagene nativo sostituito da succinilazione utilizzando acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBA) metodo colorimetrico, seguendo protocolli standard 17,18.

5. Realizzazione di dispositivi Microfluidic e il seeding cellulare

  1. Realizzare dispositivi microfluidici utilizzando metodi standard di 9. Utilizzare replica stampaggio di PDMS da SU-8 master sul silicio definita utilizzando fotolitografia per creare microfluidica camere di coltura cellulare con 100 micron di altezza, 0,4-1,5 mm e 1-10 mm di lunghezza canali per la crescita delle cellule.
  2. Utilizzare un detergente plasma per ossidare le superfici del dispositivo e un vetrino, quindi premere insieme al legame. Dopo la sterilizzazione del dispositivo per esposizione a luce UV per almeno 30 minuti, riempire la camera con 50 ug / ml di fibronectina in PBS sterile e incubare a 37 ° C per 45 min. Inizializzare il dispositivo con le cellule, come ratto primaria o epatociti umani, che richiedono un gel di collagene per la stabilizzazione del fenotipo o stato di differenziazione. Usiamo 20 l di appena isolate di ratto primario epatociti 7,19 o disponibili in commercio crioconservati epatociti umani primari seminati a 14 × 10 6 cellule / ml al dispositivo.
  3. Permettono alle cellule di allegare per 4-6 ore, e poi lavare le cellule non attaccati e sostituiscono i terreni in piastra con i media di crescita. Incubare O / N a garantire cella piena diffusione e creare un monostrato confluente di cellule.

6. strato per strato deposizione di collagene

  1. In una cappa coltura tissutale flusso laminare, preparare volumi sufficienti di soluzioni collagene denaturato e succinilate per 10 applicazioni di ciascuna soluzione per dispositivo, nonché alcuni ml di media. Mantenere le soluzioni su ghiaccio. Usiamo 20 l (10-15 volte il volume totale del dispositivo) di collagene per strato per dispositivo.
  2. Esseresgranatura con la soluzione di metilato (policationico), si alternano gli scarichi dei dispositivi con 20 ml di metilato e poi succinilata soluzioni di collagene, in attesa 1 minuto tra ogni applicazione. Lavare il dispositivo per un totale di 10 volte al di soluzione, che dovrebbe durare circa 20 minuti. Lavorare velocemente per minimizzare la quantità di tempo le cellule sono prive di mezzi.
  3. Osservare collagene lentamente accumularsi in ingresso / uscita in funzione della sua dimensione. Se la resistenza al flusso fluido aumenta, a filo il dispositivo una o due volte con i media, e poi continuare stratificazione.
  4. Dopo aver applicato tutti gli strati, sciacquare il dispositivo due volte con mezzi freschi e ritornare alla incubatore. A seconda del tipo di cellula, i cambiamenti morfologici extracellulare dalla matrice, ad esempio maggiore polarizzazione in epatociti, dovrebbero essere visibili entro poche ore.
  5. Preparare dispositivi rappresentativi per microscopia elettronica a trasmissione utilizzando metodi standard 9 per verificare la presenza di una matrice di collagenemontaggio sulla parte superiore delle cellule in coltura.

7. Stabilizzazione del fenotipo delle cellule e funzione

  1. Immagine la morfologia cellulare, la vitalità, e la polarità utilizzando metodi standard per il tipo di cella. Per epatociti, raccogliere le immagini più di 14 giorni utilizzando la microscopia di fase, LIVE / colorazione MORTO per la vitalità, e CMFDA tintura per la polarizzazione apicale per dimostrare gli effetti della deposizione di collagene.
  2. Per morfologia cellulare, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo tramite microscopio a contrasto di fase.
  3. Per LIVE / colorazione MORTO, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per lavare, iniettare 20 ml di soluzione colorante LIVE / MORTO con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il Dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo tramite microscopia a fluorescenza.
  4. Per bile canalicolorazione culi, lavare il dispositivo attraverso l'ingresso da pipetta con 20 ml di PBS per sciacquare, iniettare 20 ml di 2 soluzione colorante mM CMFDA con DAPI preparati secondo le istruzioni del produttore, incubare per 30 minuti a 37 ° C, lavare il dispositivo di nuovo con 20 ml di PBS, e l'immagine del dispositivo usando la microscopia a fluorescenza.
  5. Raccogliere i media spesi e misurare prodotti metabolici cellulari in appositi punti di tempo per tutta la durata della cultura per determinare la funzione delle cellule. Per epatociti, misurare la quantità di albumina e urea nei media spesi.
  6. Effettuare analisi funzionali endpoint sulle cellule stesse, come la valutazione dei livelli degli enzimi di attività, colorazione degli anticorpi, o analisi di RNA. Per epatociti, indurre e misurare le attività enzimatici del citocromo P450 o di fase II coniugazione enzima glutatione S-transferasi.

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Representative Results

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Collagene nativo può essere modificato con metilazione e succinilazione per creare soluzioni di collagene policationici e polianionici per l'uso in strato per strato di deposizione. Succinilazione modifica i gruppi ε-amino di collagene nativo con gruppi succinil e metilazione modifica i gruppi carbossilici di collagene nativo con un gruppo metilico (Figura 1A). Queste modifiche alle catene laterali di aminoacidi della proteina collagene alterano le curve di titolazione del pH per le soluzioni. Succinilazione riduce il numero di gruppi amminici e aumenta il numero di gruppi carbossilici, mentre metilazione ha alcun effetto sui gruppi amminici e riduce il numero di gruppi carbossilici, rispetto al collagene nativo (Figura 1B). Queste modifiche alterano le caratteristiche di carica delle molecole di collagene. Succinilazione rimuove i gruppi a carica positiva e li sostituisce con i gruppi a carica negativa, e la metilazione rimuove i gruppi carichi negativamente (Figura 1C </ strong>).

Deposizione layer-by-layer delle soluzioni collagene metilati e succinilate (COL LBL) crea un gruppo a matrice ultrasottile collagene su superfici cariche, come le cellule (Figura 2A). Epatociti primari seminate su vetro fibronectina rivestite all'interno di un dispositivo microfluidico (Figura 2B) possono essere rivestiti con un tale gruppo a matrice puramente collagene (Figura 2C). Deposizione di 10 bistrati sulle cellule crea uno spessore dello strato di collagene di circa 140 nm (Figura 2D).

Lo strato ultrasottile assemblea collagene depositato con la tecnica COL LBL stabilizza epatociti primari per oltre 14 giorni in dispositivi microfluidici. Gli epatociti senza copertura matrice superiore perdono la loro fenotipo differenziato, contratto, e sollevare la superficie di dispositivi microfluidici nel tempo (Fig. 3A-C). Al contrario, gli epatociti coperti con un ultrasottile collagene assemblaggio manutenzione sun loro morfologia differenziata e polarizzazione oltre 14 giorni (Figura 3D-F). La vitalità delle cellule è stata mantenuta a più del 90% (Figura 3G-I). Inoltre, la polarizzazione degli epatociti trattati con COL LBL aumentata nel tempo, mostrando sviluppo di una rete canalicolare apicale biliare (Figura 3J-L).

Oltre alla vitalità cellulare, la morfologia e la polarizzazione, la tecnica COL LBL recupera e stabilizza la funzione di epatociti primari a livelli simili a tecniche standard per le celle a piastre. La secrezione di albumina da epatociti è basso immediatamente dopo la placcatura, e rimane basso a meno che le cellule sono indotte a polarizzare attraverso un rivestimento a matrice. Dopo il trattamento COL LBL, la secrezione di albumina dagli epatociti aumenta nel 8-10 giorni prima di stabilizzarsi (figura 4A). La produzione di urea è elevata immediatamente dopo la semina delle cellule e diminuisce nel tempo in cellule nOT coperto con una matrice, la produzione di urea stabilizza dopo 8-10 giorni in epatociti stabilizzati con COL LBL (Figura 4B). Citocromo P450 (CYP) espressione degli enzimi in risposta a stimoli è una funzione specializzata di epatociti. L'induzione di CYP1A1 in epatociti in risposta a 3-metilcolantrene stato recuperato e stabilizzata fino a 14 giorni dal trattamento COL LBL (Figura 4C).

Figura 1
Figura 1. Rat soluzioni coda di collagene sono stati modificati chimicamente per creare positivamente rete o rete caricate negativamente soluzioni polimeriche. (A) le rappresentazioni schematiche delle reazioni di metilazione succinilazione e che modificano gruppi carbossilici e ε-amino, rispettivamente. (B) di idrogeno titolazione derivati ​​curve mostrano spostamenti relativi numeri di ioni H + necessari per alterare pH della soluzione dopo colmodifica lagen. (C) Gli oneri netti (media ± SD) delle soluzioni di collagene modificati calcolate dal H + si sposta a (B) normalizzati al collagene nativo. MC: metilato collagene. SC: collagene succinilata. AA: residui amminoacidici. Ristampa con il permesso di 9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. deposizione strato per strato di soluzioni collagene modificati creato un gruppo a matrice di collagene ultrasottile sopra degli epatociti. (A) Rappresentazione schematica di epatociti seminate su fibronectina su microdispositivi e incubati con alternanza di soluzioni di collagene denaturato e succinilati. TEM sezioni di rappresentante (20 cellule esaminati per gruppo) della truffacontrollo (B) e COL LBL-trattati (C) epatociti dopo 2 giorni di coltura. Frecce: LBL strato di collagene. Scala bar:. 2 micron spessore (D) COL LBL (media ± DS) per cella misurata da immagini TEM (n = 20 celle da 4 dispositivi). Modificato da 9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. La tecnica COL LBL mantenuto epatociti morfologia, la vitalità, e la polarizzazione in microdispositivi oltre 14 giorni nella cultura. Gli epatociti senza strato superiore in microdispositivi (controllo negativo) del contratto e sollevare la superficie nel tempo (A-C). LBL deposizione di collagene modificati mantiene epatociti morfologia (D-F) e viabilità (G-I) in microdispositivi superiori a 14 giorni. CMFDA è un marcatore generica cella che rimane nel citoplasma degli epatociti non polarizzato (J). Nel corso del tempo, lo sviluppo di canalicoli biliari può essere visto dalla escrezione del fluoroforo in spazi canalicolari (K) che si sviluppano attorno alle cellule nel tempo (L). Immagine barra della scala: 100 micron. Inserto barra della scala: 50 micron. Modificato da 9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura4
Figura 4. COL LBL stabilizza epatociti albumina e le sezioni di urea e l'attività CYP oltre 14 giorni in dispositivi microfluidici. (A) Albumina secrezione da epatociti in COL LBL iniziato basso e aumenta con il tempo uino raggiunge un plateau a giorno 10. (B) la secrezione di urea dagli epatociti COL LBL diminuita con il tempo fino a raggiungere un plateau a giorno 10. (C) L'induzione dell'attività CYP1A è stata bassa in giorno 2, ma notevolmente aumentato al giorno 7, un livello che è stato mantenuto attraverso giorno 14. Media ± SEM; COL LBL: epatociti colto dopo LBL deposizione di collagene; NoTop: epatociti in coltura senza strato di matrice superiore; n = 6-8 dispositivi. Modificato da 9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Ultrasottili assiemi collagene puro possono essere depositati su cellule caricate o superfici dei materiali utilizzando deposizione layer-by-layer di collageni modificati. I risultati di questo studio dimostrano che la metilazione e succinilazione di collagene nativo creare soluzioni collagene policationici e polianionici (Figura 1) che può essere utilizzato con la tecnica layer-by-layer depositare assiemi matrice di collagene ultrasottili sulle cellule (Figura 2) o altro addebitate superfici di materiali. Tali strati ultrasottili matrice possono stabilizzare la morfologia, la vitalità e la polarizzazione delle cellule, come epatociti (figura 3), dopo la semina in dispositivi microfluidici, così come la loro funzione (Figura 4).

Per il successo di collagene deposizione di strati ultrasottili, le reazioni di modifica che creano il collagene denaturato e succinilati sono critici. Poiché la reazione di metilazione gruppo carbossilico non è favorevole, lacollagene reazione di metilazione deve essere eseguita in metanolo acidificato a provocare la reazione in avanti, sulla base di principio di Le Chatelier. Pertanto, è importante rimuovere tutta l'acqua in eccesso dal collagene dopo la precipitazione pH prima sciogliendo il collagene precipitato in metanolo acidificato per aumentare l'efficienza di reazione. Per la reazione succinilazione, mantenendo il pH della soluzione sopra 9 durante l'aggiunta della anidride succinica in acetone è critica. Monitoraggio continuo del pH e lenta aggiunta della soluzione di anidride succinica acetone sono utili per assicurare una reazione efficace. Durante la deposizione layer-by-layer, è fondamentale ridurre al minimo il tempo che le cellule andare senza supporto. La procedura per 10 doppi strati dura circa 20 minuti, che è circa il più a lungo maggior parte delle cellule dovrebbero lasciare al di fuori dei media dell'incubatrice. Se più di 10 doppi strati devono essere depositate, riposo le cellule in media in un incubatore per 3-4 ore tra colladeposizioni gen per garantire la salute delle cellule. All'altro estremo, anche alcuni strati non saranno efficaci nel mantenere la morfologia cellulare. Nel nostro test, 3 strati non hanno mantenuto la morfologia cellulare, mentre 10 strati hanno fatto.

Diverse possono essere apportate modifiche alle procedure per risolvere i problemi. Il tempo e la temperatura della reazione di metilazione possono essere variati in caso di problemi. Ad esempio, diminuendo la temperatura di reazione a 4 ° C e aumentando il tempo di 7 giorni può aumentare l'efficienza. Inoltre, a seconda della misura della polimerizzazione durante l'estrazione pH, il collagene talvolta dissolve completamente in metanolo acidificato durante la reazione di metilazione. In questo caso, aggiungere 10 M NaOH per portare il pH fino a 9-10 dopo che la reazione è completata per precipitare il collagene in modo che possa essere pellettizzato nella fase successiva. Durante l'applicazione la deposizione strato per strato in dispositivi microfluidici, piccoli canali o porte possono diventare clogged con collagene, indicato da un aumento nel dispositivo fluidico resistenza. Lavaggio del dispositivo con mezzi freschi dovrebbe rimuovere eventuali blocchi, consentendo la deposizione per continuare.

La deposizione manuale del collagene layer-by-layer come qui descritto è una limitazione in termini di scala e automazione di dispositivi microfluidici. Tuttavia, questa tecnica è compatibile con l'hardware microfluidico standard, tra valvole e pompe che potrebbero essere utilizzati per automatizzare la tecnica e preparare array di dispositivi contemporaneamente. Un altro limite di questa tecnica per l'uso in coltura in piastra è che richiede una quantità relativamente grande di collagene nativo. Per l'applicazione microfluidica, i volumi di collagene denaturato e succinilate possono essere usati per creare strati di collagene ultrasottili in molti dispositivi. Con piastra di coltura tissutale di serie, invece, i volumi richiesti per pozzi cappotto diventare più proibitivi all'aumentare dimensioni ben.

Questo Layer-tecnica per strato per la deposizione di strati ultrasottili matrice collagene potrebbe essere ulteriormente sviluppata utilizzando modifiche alternative o funzionali, nonché creando più strati di cellule separate dalle assemblee matrice sottili. Sebbene le reazioni di modificazione catena laterale di aminoacidi relativamente semplici di metilazione e succinilazione stati usati qui, reazioni alternative o aggiuntive possono essere utilizzati invece per creare collageni funzionalizzati. Le catene laterali funzionalizzati devono comunque producono proteine ​​con cariche positive e negative complessive nette, ma tale funzionalizzazione può essere utile per una varietà di applicazioni.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

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References

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McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).More

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).

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