Protocol
ネイティブ可溶性コラーゲン溶液の調製
- 準備または私は1-3ミリグラム/などPiez らによって報告され、標準の単離プロトコルを使用してML 15でラットの尾からコラーゲン酸性化し、可溶性、タイプの200 mgの購入
- 修正されたコラーゲン溶液の所望の最終容積に基づいて、出発物質の量をスケーリングします。約可溶性天然コラーゲンを200mgから、3 mg / mlの時に25〜30のメチル化のml及びスクシニルコラーゲン溶液の25〜30ミリリットル、それぞれを行います。
2.コラーゲンのメチル化
- 氷冷たい滅菌水でミリリットルの0.5mg /の濃度にネイティブ、酸性化（pHは2-3）コラーゲン溶液100mgを希釈し、ゲル化を防止するために氷の上にソリューションを続けます。
- 1 N NaOHを数滴の9-10のコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で30分間攪拌します。白濁するために溶液を引き起こし、コラーゲン沈殿物を観察します。 25分間3000×gで沈殿したコラーゲン溶液をスピンダウン。明確な、ゲル状の沈殿物がチューブの底に表示されるはずです。吸引し、適切に上澄み液を廃棄。
- 0.1 N HClで200mlのメタノールで沈殿コラーゲンを再懸濁し、メチル化反応を4日間室温で撹拌しながら発生することを可能にします。コラーゲンは溶解しないが、解決策は曇りになります非常に小さく見える片にばらばらにする必要があります。
- メチル化した後、遠心分離器25分間3000×gでソリューションは、メチル化コラーゲンを沈殿させます。吸引除去は、酸性化メタノール上清を処分。
- 繰り返しのピペッティングで約3 mg / mlでの濃度を与える、無菌PBS 25ml中のメチル化コラーゲンを溶解し、60μmの細胞ストレーナーを通して溶液を濾過します。 1 N NaOHを20μlの増分を用いて7.3から7.4への溶液のpHを調整します。
- concentratioを評価商業ラットコラーゲンELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを使用して溶液をN。 3ミリグラム/ミリリットル滅菌PBSでの解決策を希釈します。
- 慎重にボトルの底にクロロホルム3mlのを積層、スクリューキャップ付きガラス瓶に移すことにより、メチル化コラーゲン溶液を滅菌、ボトルを4℃でO / Nを設定し、無菌的に除去して保存することを可能にしますメチル化コラーゲンであるトップ層、。
- 1ヶ月以内に使用するために4℃で溶液を保管してください。
3.コラーゲンスクシニル
- 氷冷たい滅菌水でミリリットルの0.5mg /の濃度にネイティブ、酸性化（pHは2-3）コラーゲン溶液の他の100ミリグラムを希釈し、ゲル化を防止するために氷の上にソリューションを続けます。
- 1 N NaOHを数滴の9-10のコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で30分間攪拌します。コラーゲンは白濁するソリューションを引き起こして、沈殿させる必要があります。
- SUCの40 mgの溶かします（コラーゲン溶液の体積番目の 1/20）をアセトン10ml中cinic無水物（コラーゲン1mg当たり0.4ミリグラム）。ゆっくりと（約0.5ミリリットルずつ）を連続的にpHをモニターしながら、攪拌しながら、コラーゲン溶液に、この混合物を追加します。 pHが9.0に近づくにつれて1 NのNaOHの1または2滴を添加することにより9.0を超えるpHを維持します。
- アセトン中の無水コハク酸のすべてを追加した後、120分間室温で撹拌し続けます。スクシニル化コラーゲンが溶解するよう明確になるために解決策を確認します。定期的にそれが9.0を超えたまま確保するためのpHを確認してください。
- 1 N HClを20μlの刻みを4.0に溶液のpHを調整します。スクシニル化コラーゲン沈殿物として、再び濁った溶液を観察します。
- スクシニル化した後、スクシニル化コラーゲンをペレット化するために25分間3000×gで遠心分離ソリューション。未反応の無水コハク酸を用いて酸性化上清を吸引除去し、廃棄してください。
- スクシニル化コラーゲンを溶かします無菌PBSの25ミリリットル、60ミクロンセルストレーナーを通して溶液をピペッティングを繰り返すと、ミリリットル/約3ミリグラムの濃度を与え、フィルターインチ1 N NaOHを20μlの増分を用いて7.3から7.4への溶液のpHを調整します。
- 商業コラーゲンラットELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて溶液の濃度を評価します。 3ミリグラム/ミリリットル滅菌PBSでの解決策を希釈します。
- 慎重にボトルの底にクロロホルム3mlのを積層、スクリューキャップ付きガラス瓶に移すことによって、スクシニル化コラーゲン溶液を滅菌、ボトルを4℃でO / Nを設定し、無菌的に除去して保存することを可能にしますスクシニル化コラーゲンであるトップ層、。
- 1ヶ月以内に使用するために4℃で溶液を保管してください。
コラーゲン修正4.検証
- 、ネイティブのメチル化、およびスクシニル化コラーゲン溶液のそれぞれから1ミリリットルのサンプルを準備し、濃に希釈します水素イオン滴定のための滅菌純水でミリリットルを0.1mg /のentration。また、少なくとも4時間ごとに、10kDaのカットオフmembraneusing 3溶液の変化を介して水に対して透析によってバッファ、少なくとも1000倍に希釈。
- NaOHおよびHClを少量の7.3に溶液のpHを調整します。天然のメチル化、およびスクシニル化コラーゲン溶液のための滴定曲線を作成するために、タンフォード16で説明したように任意の基準として、pHが7.3を使用して、試料のそれぞれに水素イオン滴定を行います。
- バインドされたH +分子当たりのイオン数に対する酸の添加量あたりのpHの変化をプロットします。高pH「アミノ」の範囲は、中性点に向かってスクシニル化コラーゲンのシフト（アミン基の損失）を示すべきであり、低pH、「カルボキシル」の範囲は、メチル化コラーゲン中左シフト（カルボキシル基の損失を示す必要があります）およびスクシニル化コラーゲンの右シフト（カルボキシル基のゲイン秒）、天然コラーゲンと比較しました。
- 標準的なプロトコール17,18以下、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBA）比色法を用いて、スクシニル化によって置き換え天然コラーゲンでのアミノ基の％を決定することによって、サクシニル化反応の有効性を評価します。
5.マイクロ流体デバイスの作製と細胞播種
- 標準的な方法9を使用して 、マイクロ流体デバイスを製造。 100μmで、背の高い0.4〜1.5ミリメートル幅の広い、および細胞増殖のための長いチャンネル1〜10ミリメートルで、マイクロ流体細胞培養室を作成するために、フォトリソグラフィを使用して定義されたシリコン上にSU-8マスターからPDMSのレプリカ成形を使用してください。
- デバイスとスライドガラスの表面を酸化するためにプラズマクリーナーを使用し、さらに結合を一緒に押します。少なくとも30分間、UV光に露光することによって、デバイスを滅菌した後、滅菌PBS中の50μg/ mlのフィブロネクチンでチャンバを充填し、45分間37℃でインキュベートします。 表現型または分化状態の安定化のためのコラーゲンゲルを必要とするような初代ラットやヒト肝細胞などの細胞、を備えたデバイスをシード。私たちは、デバイスあたり14×10 6細胞/ mlで播種新たに単離した初代ラット肝細胞7,19または市販の凍結保存された初代ヒト肝細胞の20μLを使用しています。
- 細胞は4-6時間アタッチした後、付着していない細胞を洗い流すと、増殖培地でメッキメディアを交換できるようにします。拡散フルセルを確保し、細胞のコンフルエントな単層を作成するために、O / Nインキュベートします。
6.レイヤー・バイ・レイヤーコラーゲン沈着
- 層流の組織培養フードでは、デバイスごとに各溶液の10アプリケーションのためのメチル化およびスクシニル化コラーゲン溶液の十分なボリュームだけでなく、メディアのいくつかのMLSを準備します。氷の上で解決策をしてください。私たちは、デバイスごとに1層当たりのコラーゲンの20μlの（10〜15回総デバイス・ボリューム）を使用します。
- うメチル化された20μlのデバイスをフラッシュメチル（ポリカチオン）溶液に、代替と綿繰りし、各アプリケーションとの間で1分を待って、コラーゲン溶液をスクシニル。デバイスに約20分を取る必要があります解決策につき10回、の合計をフラッシュします。細胞は、培地なしている時間の量を最小にするためにすぐに働きます。
- ゆっくりとその大きさに応じて、入口/出口に蓄積コラーゲンを守ってください。流体の流れが増加に対する耐性は、メディアに一度か二度のデバイスをフラッシュし、場合には、階層化を続けます。
- 全ての層を適用した後、新鮮な培地で二回デバイスをすすぎ、インキュベーターに戻します。細胞の種類に応じて、そのような肝細胞で強化された偏光のような細胞外マトリックスにより誘導される形態学的変化は、数時間以内に表示されるはずです。
- コラーゲンマトリックスの存在を確認するために、標準的な方法9を用いて 、透過型電子顕微鏡のための代表的な装置を準備培養細胞の上に組み立て。
細胞の表現型および機能の安定化7
- 画像の細胞型のための標準的な方法を用いて細胞の形態、生存率、および極性。肝細胞は、コラーゲン沈着の効果を実証するために、頂端の偏光に対する位相顕微鏡、生存のためにLIVE / DEAD染色し、CMFDA色素を使用して、14日間に渡って画像を収集。
- 細胞形態学のために、リンス20μlのPBS、及び画像位相差顕微鏡を使用してデバイスを注入するためにPBS20μlをピペットで注入口を介してデバイスを洗い流します。
- LIVE / DEAD染色のために、すすぎ、製造元の指示に従って調製し、DAPIでLIVE / DEAD染色溶液20μlを注入する20μlのPBSでピペットで注入口を介してデバイスをフラッシュし、37℃で30分間インキュベートし、すすぎデバイスを再び20μlのPBS、及び画像蛍光顕微鏡を用いた装置です。
- 胆汁カナリについてCuLi等の染色、DAPIで2μMCMFDA染色溶液20μlを注入、すすぐために20μlのPBSをピペットで注入口を介してデバイスをフラッシュするには、製造元の指示に従って調製し、37℃で30分間インキュベートし、再びデバイスをすすぎます20μlのPBS、及び画像蛍光顕微鏡を使用してデバイス。
- 使用済み培地を収集し、細胞機能を決定するための培養期間にわたって、適切な時点での細胞代謝産物を測定します。肝細胞の場合は、使用済み培地中のアルブミンおよび尿素の量を測定します。
- このような酵素活性レベル、抗体染色、またはRNA分析を評価するように細胞自体上のエンドポイント機能解析を実行します。肝細胞は、誘導し、シトクロムP450酵素活性または第II相抱合酵素グルタチオンSトランスフェラーゼを測定します。
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Representative Results
天然コラーゲンは、層ごとの堆積に使用するためのポリカチオンおよびポリアニオンコラーゲン溶液を作成するために、メチル化及びスクシニルを使用して変更することができます。サクシニル化は、スクシニル基を有する天然コラーゲンのεアミノ基を変更して、メチル化は、メチル基（ 図1A）と天然コラーゲンのカルボキシル基を修飾します。コラーゲンタンパク質のアミノ酸側鎖のこれらの修飾は、ソリューションのpH滴定曲線を変化させます。メチル化は、アミノ基に影響を及ぼさないし、カルボキシル基の数を減少させながら、スクシニル化は、天然コラーゲン（ 図1B）と比較して、アミノ基の数を減少させ、カルボキシル基の数を増加させます。これらの修飾は、コラーゲン分子の電荷特性を変化させます。サクシニル化は、正に荷電した基を除去し、負に帯電した基に置き換え、およびメチル化は、負に帯電した基を除去し（ 図1C </強いです>）。
メチル化およびスクシニル化コラーゲン溶液（COL LBL）の層ごとの堆積は、そのような細胞（ 図2A）のような荷電表面の上に極薄コラーゲンマトリックスアセンブリを作成します。マイクロ流体デバイス（ 図2B）内のフィブロネクチンでコーティングしたガラス上に播種した初代肝細胞は、純粋なコラーゲンマトリックスのアセンブリ（ 図2C）で被覆することができます。細胞上の10の二重層の堆積は、約140ナノメートル（ 図2D）のコラーゲン層の厚さを作成します。
COL LBL技術を用いて堆積極薄コラーゲン集合層は、マイクロ流体デバイスで14日以上初代肝細胞を安定化させます。トップ行列カバーなしの肝細胞は、それらの分化した表現型、契約を失い、時間（ 図3A-C）を介してマイクロ流体デバイスの表面を持ち上げ。対照的に、肝細胞は、極薄コラーゲンアセンブリmaintaiで覆われ14日（ 図3D-F）を超えるnはその分化の形態と偏光。細胞の生存率は90％以上（ 図3G-I）で維持しました。また、COL LBLで処理された肝細胞の分極は、頂端胆汁小管網（ 図3J-L）の発達を示し、経時的に増加しました。
細胞生存率、形態、および偏光に加えて、COL LBL技術は回復し、プレート中の細胞のための標準的な技術と同様のレベルで初代肝細胞の機能を安定化させます。肝細胞によるアルブミンの分泌はすぐにメッキ後に低く、細胞がマトリクスカバーを通して分極するように誘導されない限り低いままです。 COL LBL処理、（ 図4A）を安定化する前に、8-10日間の肝細胞の増加によるアルブミン分泌後。尿素製造は、細胞播種直後に高く、nは細胞内で経時的に減少しますマトリックスで覆われたOT、尿素製造はCOL LBL（ 図4B）で安定化された肝細胞における8〜10日後に安定します。シトクロムP450（CYP）の刺激に応答して、酵素の発現は、肝細胞の特殊な機能です。 3-メチルに応答した肝細胞におけるCYP1A1の誘導を回収し、COL LBL処理（ 図4C）で14日まで安定化させました。
図1.ラット尾コラーゲン溶液は、化学的に積極的にネットを作成するように変更またはネットが負のポリマー溶液を充填しました。 （A）は、それぞれ 、カルボキシル基およびεアミノ基を修飾スクシニル化およびメチル化反応の概略図。COL後の溶液のpHを変化させるために必要なH +イオンの相対数の変化を示す（B）水素滴定曲線誘導体ラゲン修正。（C）天然コラーゲンに正規化（B）中のH +シフトから計算された修正されたコラーゲン溶液の純費用（平均±SD）。 MC：メチル化コラーゲン。 SC：スクシニル化コラーゲン。 AA：アミノ酸残基。再印刷9からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
修正されたコラーゲン溶液の図2層ごとの堆積は、肝細胞の上に超薄コラーゲンマトリックスのアセンブリを作成しました。 （A）肝細胞の略図は、マイクロデバイス上フィブロネクチン上に播種し、メチル化された交互にインキュベートし、コラーゲン溶液をスクシニル。代表のTEM断面（グループごとに調べた20細胞）コンTROL（B）及びCOL培養の2日後（C）肝細胞LBLが処理されました。矢印：LBLのコラーゲン層。スケールバー：TEM像（n = 4のデバイスから20細胞）から測定セル当たり2マイクロメートル（D）COL LBL層の厚さ（平均±SD）。 9から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. COL LBL技術は、肝細胞は、無上部マイクロデバイスにおける層（ネガティブコントロール）契約に。培養液中で14日間にわたってマイクロデバイスにおける肝細胞の形態、生存能力、及び偏光を保持し、かつ、表面の経時（A-C）を持ち上げ。変更されたコラーゲンのLBL堆積は、肝細胞の形態（D-F）と viabを維持14日間のマイクロデバイスでility（G-I）。 CMFDAは、非偏光の肝細胞（J）の細胞質に残る汎用細胞マーカーです。時間が経つにつれて、毛細胆管の開発は時間（L）を介して細胞の周りに開発小管の空間（K）へのフルオロフォアの排泄によって見ることができます。画像スケールバー：100μmです。挿入図のスケールバー：50μmです。 9から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. COL LBLは、マイクロ流体デバイス内の14日間にわたり、肝細胞アルブミンおよび尿素セクションとCYP活性を安定化させる。COL LBLにおける肝細胞による（A）アルブミン分泌が低く開始し、時間とともに増加したU、COL LBLの肝細胞による10日目（B）尿素分泌でプラトーに達しntil 2日目で低かった10（C）日にCYP1A活性の誘導をプラトーに達するまでの時間で減少したが、大幅に7日目に増加しました14日平均±SEMを通じて維持されたレベル。 COL LBL：LBLのコラーゲン沈着後に培養肝細胞; NoTop：なしトップマトリクス層との培養肝細胞; N = 6-8デバイス。 9から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
極薄純粋なコラーゲンアセンブリが変更されたコラーゲンのレイヤーバイレイヤー堆積を用いて帯電した細胞または材料表面上に堆積することができます。この研究の結果は、メチル化及び天然コラーゲンのスクシニル化は、細胞（ 図2）上の極薄コラーゲンマトリックスアセンブリを堆積させるために層ごとの手法で使用することができる（ 図1）または他の荷電したポリカチオンとポリアニオン性コラーゲン溶液を作成することを実証材料表面。このような極薄マトリックス層は、肝細胞（ 図3）、その機能と同様に、マイクロ流体デバイス内に播種した後（ 図4）のような細胞の形態、生存能力、及び偏光を安定化させることができます。
極薄コラーゲン層の堆積のために成功し、メチル化およびスクシニル化コラーゲンを生成する改質反応が重要です。カルボキシル基のメチル化反応が良好でないためコラーゲンメチル化反応はル・シャトリエの原理に基づいて、正反応を駆動するために、酸性化メタノール中で行われなければなりません。従って、反応効率を向上させるために酸性メタノール中に沈殿したコラーゲンを溶解する前に、pHが沈殿した後、コラーゲンからすべての余分な水を除去することが重要です。サクシニル反応のために、アセトン中の無水コハク酸を加えながら9上記溶液のpHを維持することが重要です。 pH及び無水コハク酸のアセトン溶液をゆっくりと添加の継続的な監視は、効率的な反応を確保するために有用です。層ごとの堆積中に、それは、細胞が培地なしで行く時間を最小限にすることが重要です。 10二重層の手順は限りほとんどの細胞は培養器の外側にメディアなしでなければならないように、約、約20分を取ります。 10以上の二重層を堆積する必要がある場合は、コーラの間に3〜4時間、インキュベーター中で培地中の細胞を休まgenは堆積細胞の健康を確保します。それとは正反対に、あまりにもいくつかの層は、細胞の形態を維持するのに有効ではありません。 10層はなかったが今回のテストでは、3つの層は、細胞の形態を維持していませんでした。
いくつかの変更は、問題のトラブルシューティング手順を行うことができます。問題が発生した場合の時間とメチル化反応の温度を変化させることができます。例えば、4°Cの反応温度を低下させると効率を高めることができる7日間の時間を増加させます。また、pHが抽出中に重合の程度に応じて、コラーゲンは、時には完全にメチル化反応の間に酸性化メタノールに溶解します。この問題が発生した場合、それは次のステップの間にペレット化することができるように、反応は、コラーゲンを沈殿させるために完了した後、9月10日までのpHを10 MのNaOHを追加します。マイクロ流体デバイスにおける層ごとの堆積をかけながら、小さなチャネルまたはポートがCLになることができます装置の流体抵抗の増加によって示される、コラーゲンとogged。新鮮な培地でデバイスをフラッシュすると、堆積が継続できるように、任意の閉塞を削除する必要があります。
ここで説明したように層ごとのコラーゲンのマニュアル沈着は、マイクロ流体デバイスのスケーリングと自動化の面で制限です。しかし、この技術は、技術を自動化し、一度にデバイスのアレイを製造するために使用することができるバルブおよびポンプを含む、標準的なマイクロ流体ハードウェアと互換性があります。平板培養に使用するためのこの技術の他の制限は、それが天然コラーゲンの比較的大量を必要とすることです。マイクロ流体の用途のために、メチル化およびスクシニル化コラーゲンの体積は多くのデバイスにおける極薄コラーゲン層を作成するために使用することができます。標準的な組織培養プレートで、一方、被覆ウェルに必要なボリュームは、ウェルのサイズの増加に伴って、より高額になります。
この層 -極薄コラーゲンマトリックス層の堆積のためのバイレイヤーの技術は、さらなる代替的または機能的修飾を用いて、ならびにによって薄いマトリクスアセンブリによって分離された細胞の複数の層を作成することによって開発することができます。メチル化及びスクシニルの比較的単純なアミノ酸側鎖の修飾反応は、ここで使用されたが、代替的または付加的な反応ではなく、官能化コラーゲンを作成するために使用することができます。官能性側鎖は、まだ全体の正味正電荷と負電荷を有するタンパク質を生じるはずであるが、そのような官能化は、種々の用途に有用であり得ます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen type I, rat tail | Life Technologies | A1048301 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | EMD Millipore | 08-115 | option for concentrated rat tail collagen |
| collagen type I, rat tail | R%D Systems | 3440-100-01 | option for concentrated rat tail collagen |
| succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 239690-50G | succinylation reagent |
| anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | methylation reagent |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | pH precipitation reagent |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | pH precipitation reagent |
| rat collagen type I ELISA | Chondrex | 6013 | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | option for detecting collagen content |
| hydroxyproline assay kit | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | option for detecting collagen content |
References
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