Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lag-på-lag Kollagen Nedfall i mikrofluid Enheter for Microtissue Stabilization

Published: September 29, 2015 doi: 10.3791/53078
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

Protocol

1. Klargjøring av Native Soluble Collagen Solution

  1. Forberede eller kjøpe 200 mg av syrnet, løselige, type I kollagen fra rottehaler på 1-3 mg / ml ved hjelp av standard isolerings protokoller, som rapportert av Piez et al. 15
  2. Skalere mengden av utgangsmateriale basert på det ønskede sluttvolum av modifiserte kollagenløsninger. Omtrent gjør 25-30 ml metylert og 25-30 ml succinylated kollagenløsninger, hver på 3 mg / ml, fra 200 mg til løselig naturlig kollagen.

2. Kollagen Metylering

  1. Fortynn 100 mg av det native, surgjort (pH 2-3) kollagenoppløsning til en konsentrasjon på 0,5 mg / ml med iskaldt sterilt vann, og holder oppløsningen på is for å forhindre gelering.
  2. Juster pH-verdien i løsningen til 9-10 kollagen med noen få dråper av 1 N NaOH og omrørt ved RT i 30 min. Observere kollagen bunnfall, slik at løsningen for å bli grumsete. Spinne ned de utfelte kollagen oppløsningen ved 3000 x g i 25 min. En klar, gel-lignende bunnfallet skal være synlig i bunnen av rørene. Aspirer og avhende supernatantvæsken.
  3. Resuspender utfelte kollagen i 200 ml metanol med 0,1 N HCl og tillate metyleringsreaksjonen å skje under omrøring ved RT i 4 dager. Kollagen vil ikke oppløses, men bør bryte hverandre i veldig små synlige biter som vil gjøre løsningen skyet.
  4. Etter metylering, sentrifuger løsningen ved 3000 x g i 25 minutter for å klumpe denaturert kollagen. Aspirer og kast den sur metanol supernatant.
  5. Oppløs det metylerte kollagen i 25 ml steril PBS, noe som gir en konsentrasjon på omtrent 3 mg / ml, med gjentatt pipettering og filtrer løsningen gjennom et 60 mikrometer celle sil. Juster pH-verdien i oppløsningen til 7,3 til 7,4 ved hjelp av 20 ul trinn på 1 N NaOH.
  6. Vurdere-konsentrasjonn av løsningen ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett rotte kollagen eller hydroksyprolin-assay kit. Fortynn løsningen på 3 mg / ml med steril PBS.
  7. Steril det metylerte kollagenløsningen ved å overføre den til en glassflaske med skrukork, omhyggelig lagdeling 3 ml kloroform ved bunnen av flasken, at flasken for å sette O / N ved 4 ° C, og deretter aseptisk fjerne og lagre Topplaget, som er denaturert kollagen.
  8. Oppbevar løsningen ved 4 ° C for bruk innen en måned.

3. Kollagen Succinylering

  1. Fortynn den andre 100 mg av det native, surgjort (pH 2-3) kollagenoppløsning til en konsentrasjon på 0,5 mg / ml med iskaldt sterilt vann, og holder oppløsningen på is for å forhindre gelering.
  2. Juster pH-verdien i løsningen til 9-10 kollagen med noen få dråper av 1 N NaOH og omrørt ved RT i 30 min. Kollagen skal utfelles, slik at oppløsningen blir uklar.
  3. Oppløs 40 mg succinic anhydrid (0,4 mg pr mg kollagen) i 10 ml aceton (1 tyvendedel th volumet av kollagen-oppløsning). Langsomt (i løpet av ca. 0,5 ml inkrementer) legge denne blandingen til kollagen løsning under omrøring under kontinuerlig overvåking av pH-verdien. Opprettholde pH over 9,0 ved tilsetning av 1 eller 2 dråper 1 N NaOH som pH-verdien nærmer seg 9,0.
  4. Fortsett omrøringen ved romtemperatur i 120 min etter tilsetning av alt av ravsyreanhydrid i aceton. Observere løsningen for å bli klar som succinylated kollagen oppløses. Regelmessig sjekke pH å sikre at den holder seg over 9,0.
  5. Juster pH-verdien i løsningen til 4,0 med 20 mL trinn på 1 N HCl. Observere løsningen overskyet igjen, som succinylated kollagen utfellinger.
  6. Etter Succinylering, sentrifuger løsningen ved 3000 x g i 25 minutter for å klumpe succinylated kollagen. Aspirer og kast den syrnet supernatanten med ureagert ravsyreanhydrid.
  7. Oppløse succinylated kollageni 25 ml steril PBS, noe som gir en konsentrasjon på omtrent 3 mg / ml, med gjentatt pipettering og filtrere oppløsningen gjennom et 60 mikrometer celle sil. Juster pH-verdien i oppløsningen til 7,3 til 7,4 ved hjelp av 20 ul trinn på 1 N NaOH.
  8. Bedømme konsentrasjonen av oppløsningen ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett kollagen rotte eller hydroksyprolin-assay kit. Fortynn løsningen på 3 mg / ml med steril PBS.
  9. Steriliser succinylated kollagenløsningen ved å overføre den til en glassflaske med skrukork, omhyggelig lagdeling 3 ml kloroform ved bunnen av flasken, at flasken for å sette O / N ved 4 ° C, og deretter aseptisk fjerne og lagre øverste laget, som er den succinylated kollagen.
  10. Oppbevar løsningen ved 4 ° C for bruk innen en måned.

4. Verifisering av kollagen Modifikasjoner

  1. Forbered 1 ml prøver fra hver av de innfødte, denaturert, og succinylated kollagen løsninger og fortynne til en konsentration på 0,1 mg / ml med sterilt renset vann til hydrogen-ion-titrering. Ytterligere fortynning av buffer på minst 1000 ganger ved dialyse mot vann gjennom en 10 kDa cutoff membraneusing 3. løsningen endringer i minst 4 timer hver.
  2. Juster pH-verdien av oppløsningene til 7,3 med små mengder NaOH og HCl. Ved hjelp av pH 7,3 som en vilkårlig referanse, utføre hydrogenion titrering på hver av prøvene som beskrevet av Tanford 16 for å skape titreringskurver for native, denaturert, og succinylated kollagenløsninger.
  3. Plott endringen i pH-verdi per volum av tilsatt syre i forhold til antall av bundet H + -ioner per molekyl. Den høye pH "amino" rekkevidde bør vise en vridning i succinylated kollagen mot nøytralpunktet (et tap av amingrupper), og den lave pH "carboxyl" rekkevidde bør vise en bevegelse mot venstre i den metylerte kollagen (tap av karboksylgrupper ) og en mot høyre skift i succinylated kollagen (en gevinst i karboksylgruppes), sammenlignet med det native kollagen.
  4. Vurdere effekten av den Succinylering reaksjonen ved å bestemme% av aminogruppene i den opprinnelige kollagen erstattet med Succinylering ved hjelp av 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre syre (TNBA) kolorimetrisk metode, som følge standardprotokoller 17,18.

5. Fabrikasjon av microfluidic Enheter og Cell Seeding

  1. Dikte microfluidic enheter ved hjelp av standardmetoder 9. Bruk replica støping av PDMS fra SU-8 mestere på silisium defineres med fotolitografi for å skape microfluidic cellekultur kamre med 100 mikrometer høy, 0,4-1,5 mm bred, og 1-10 mm lang kanaler for cellevekst.
  2. Bruk en plasma renere å oksidere overflater av enheten og en glassplate, og trykk deretter sammen for å obligasjon. Etter sterilisering av anordningen ved eksponering for UV-lys i minst 30 min, fylle kammeret med 50 pg / ml fibronectin i steril PBS og inkuberes ved 37 ° C i 45 min. Seed enheten med celler, slik som primær rotte eller humane hepatocytter, som krever en kollagen-gel for stabilisering av fenotype eller differensiering tilstand. Vi bruker 20 ul nylig isolerte primære leverceller fra rotte 7,19 eller kommersielt tilgjengelige cryopreserved primære humane hepatocytter seeded på 14 × 10 6 celler / ml per enhet.
  3. La cellene til å feste i 4-6 timer, og deretter vaske ut ufestede celler og erstatte plating media med vekstmedier. Inkuber O / N for å sikre full celle spredning og skape et konfluent monolag av celler.

6. Lag-på-lag Collagen Nedfall

  1. I en laminær vev kultur hette, utarbeide tilstrekkelige mengder denaturert og succinylated kollagen løsninger for 10 anvendelser av hver løsning per enhet, samt noen få ml media. Hold løsninger på is. Vi bruker 20 ul (10-15 ganger totalt enhet volum den) av kollagen per lag per enhet.
  2. Værebomull med metylert (polykationiske) løsning, alternativ spyle enhetene med 20 pl metylert og deretter succinylated kollagen løsninger, venter 1 min mellom hver påføring. Skyll enheten totalt 10 ganger per løsning, som bør ta ca 20 min. Arbeide raskt for å minimalisere mengden av tid cellene er uten media.
  3. Observere kollagen sakte akkumuleres ved innløpet / utløpet avhengig av sin størrelse. Hvis motstanden mot strømnings øker, skylle apparatet en eller to ganger med media, og deretter fortsette lagdeling.
  4. Etter påføring av alle lagene, skyll anordningen to ganger med friskt medium, og går tilbake til inkubatoren. Avhengig av celletypen, de ekstracellulære matriks-indusert morfologiske endringer, for eksempel forbedret polarisering i hepatocytter, som skal være synlige i løpet av få timer.
  5. Forbered representative anordninger for transmisjonselektronmikroskopi ved bruk av standardmetoder 9 for å bekrefte tilstedeværelsen av en kollagen matriksmontering på toppen av de dyrkede celler.

7. Stabilisering av cellefenotype og funksjon

  1. Bilde cellens morfologi, levedyktighet og polaritet ved hjelp av standardmetoder for celletypen. For hepatocytter, samle bilder over 14 dager ved hjelp av fasemikroskopi, LIVE / DEAD farging for levedyktighet, og CMFDA fargestoff for apikal polarisering for å demonstrere effekten av kollagen deponering.
  2. For cellemorfologi, skylle enheten gjennom innløpet av pipette med 20 mL PBS å skylle, injisere 20 mL PBS og bilde enheten med fasekontrastmikroskopi.
  3. For LIVE / DEAD farging, skylle enheten gjennom innløpet av pipette med 20 mL PBS å skylle, injiserer 20 ul LIVE / DEAD farging løsning med DAPI fremstilt etter produsentens anvisninger, inkuber i 30 minutter ved 37 ° C, skyll enheten igjen med 20 mL PBS og bilde enheten med fluorescens mikroskopi.
  4. For galle canaliculi farging, skylle enheten gjennom innløpet av pipette med 20 mL PBS å skylle, injisere 20 ul 2 mikrometer CMFDA fargeløsning med DAPI fremstilt etter produsentens anvisninger, inkuber i 30 minutter ved 37 ° C, skyll enheten på nytt med 20 mL PBS og bilde enhetens med fluorescens mikroskopi.
  5. Samle brukt media og måle mobilnettet metabolske produkter på riktige tidspunkter over varigheten kultur å bestemme cellefunksjon. For hepatocytter, måle mengden av albumin og urea i de brukte media.
  6. Utfør endepunkt funksjonelle analyser på cellene selv, for eksempel vurdere enzymaktivitetsnivå, antistoffarging eller RNA-analyse. For hepatocytter, indusere og måle cytokrom P450-enzymaktivitet eller fase II konjugering enzymet glutation S-transferase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Native kollagen kan modifiseres ved hjelp av metylering og Succinylering å skape polykationiske og polyanioniske kollagenløsninger for anvendelse ved lag-på-lag avsetning. Succinylering endrer c-aminogruppene i naturlig kollagen med succinyl-grupper, og metylering modifiserer karboksylgruppene naturlig kollagen med en metylgruppe (figur 1A). Disse modifikasjoner av collagen protein aminosyre sidekjeder forandre pH titreringskurver for løsningene. Succinylering reduserer antall aminogrupper og øker antallet av karboksylgrupper, mens metylering har ingen effekt på aminogruppene og reduserer antallet carboxylgrupper, sammenlignet med naturlig kollagen (figur 1B). Disse modifikasjonene endre ladnings egenskapene av kollagenmolekylene. Succinylering fjerner positivt ladede grupper og erstatter dem med negativt ladede grupper, og metylering fjerner negativt ladede grupper (figur 1C </ strong>).

Lag-for-lag avsetning av metylerte og succinylated kollagenløsninger (COL LBL) skaper et ultratynt kollagenmatriksen montering på toppen av ladede overflater, slik som celler (figur 2A). Primære hepatocytter seeded på fibronektin-belagt glass i et mikrofluidinnretningen (figur 2B) kan være belagt med et slikt rent kollagen matriks sammenstillingen (figur 2C). Avsetning av 10 dobbeltlag på celler som danner et kollagensjikttykkelse på ca 140 nm (figur 2D).

Den ultratynne kollagen montering lag deponert ved hjelp av COL LBL teknikk stabiliserer primære hepatocytter i over 14 dager i microfluidic enheter. Hepatocytter uten en topp matrise deksel mister differensiert fenotype, kontrakt, og løft av overflaten av microfluidic enheter over tid (3A-C fig.). I motsetning til dette, hepatocytter dekket med en ultratynn kollagen sammenstilling maintain differensiert deres morfologi og polarisering i løpet av 14 dager (figur 3D-F). Levedyktigheten av cellene ble opprettholdt på høyere enn 90% (figur 3G-I). I tillegg er polarisasjonen av hepatocyttene ble behandlet med COL LBL økt over tid, som viser utviklingen av en apikal biliær canalicular nettverk (figur 3J-L).

I tillegg til cellenes levedyktighet, morfologi, og polarisering, gjenoppretter den COL LBL teknikk og stabiliserer funksjon av primære hepatocytter på et nivå tilsvarende til standardteknikker for celler i form av plater. Sekresjon av albumin ved hepatocytter er lavt umiddelbart etter plating, og forblir lave hvis cellene er indusert til å polarisere gjennom en matrise som dekker. Etter COL LBL behandling, albumin sekresjon av hepatocytes øker over 8-10 dager før stabiliserende (Figur 4A). Ureaproduksjonen er høy umiddelbart etter celle seeding og avtar over tid i celler not dekket med en matrise, stabiliserer ureaproduksjonen etter 8-10 dager i hepatocytter stabilisert med COL LBL (figur 4B). Cytokrom P450 (CYP) enzymet uttrykk som svar på stimuli er en spesialisert funksjon av hepatocytter. Induksjon av CYP1A1 i hepatocytter i respons til 3-methylcholanthrene ble utvunnet og stabilisert opp til 14 dager ved COL LBL behandling (figur 4C).

Figur 1
Figur 1. rottehalecollagen løsninger ble kjemisk modifisert for å skape netto positivt eller netto negativt ladede polymerløsninger. (A) Skjematisk representasjon av Succinylering og metylering reaksjoner som modifiserer karboksyl- og c-aminogrupper, henholdsvis. (B) Hydrogen titreringskurven derivater som viser endringer i de relative antall av H + ioner som trengs for å forandre oppløsningens pH etter colLagen modifikasjon. (C) Netto kostnader (gjennomsnitt ± SD) av de modifiserte kollagen løsninger beregnet fra H + skift i (B) normalisert til mors kollagen. MC: metylert kollagen. SC: succinylated kollagen. AA: aminosyrerester. Re-print med tillatelse fra 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. lag-på-lag avsetning av modifiserte kollagenløsninger opprettet et ultratynt kollagenmatriksen montering på toppen av hepatocytter. (A) Skjematisk fremstilling av hepatocytter seeded på fibronektinet på en microdevice og inkuberes med vekslende denaturert og succinylated kollagen løsninger. TEM tverrsnitt av representant (20 celler undersøkt per gruppe) controll (B) og COL LBL-behandlet (C) hepatocytter etter 2 dager med kultur. Piler: LBL kollagen lag. Skala:. 2 mikrometer (D) COL LBL tykkelse (gjennomsnitt ± SD) per celle målt fra TEM-bilder (n = 20 celler fra 4 enheter). Modifisert fra 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. COL LBL teknikk opprettholdes hepatocytter morfologi, levedyktighet, og polarisering i Microdevices over 14 dager i kultur. Hepatocytter uten topplag i Microdevices kontrakt (negativ kontroll) og løft av overflaten over tid (A-C). LBL avsetning av modifiserte bindevevet bevarer hepatocytter morfologi (D-F) og viability (G-I) i Microdevices over 14 dager. CMFDA er en generisk celle markør som forblir i cytoplasma av ikke-polariserte hepatocytter (J). Over tid kan utviklingen av galle canaliculi ses av utskillelse av fluoroforen i canalicular mellomrom (K) som utvikler seg rundt cellene over tid (L). Bilde skala bar: 100 mikrometer. Innfelt skala bar: 50 mikrometer. Modifisert fra 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure4
Figur 4. COL LBL stabiliserer hepatocytter albumin og urea seksjoner og CYP aktivitet over 14 dager i microfluidic enheter. (A) Albumin sekresjon av hepatocytter i COL LBL startet lavt og økte med tiden until nådde et platå på dag 10. (B) Urea sekresjon av COL LBL hepatocytter avtok med tiden til å nå et platå ved dag 10. (C) Induksjon av CYP1A aktiviteten var lav på dag 2, men betydelig økning på dag 7, en nivået som ble opprettholdt gjennom dagen 14. Mean ± SEM; COL LBL: hepatocytter kultivert etter LBL kollagen deponering; NoTop: hepatocytter dyrket med ingen topp matrikssjikt; n = 6-8 enheter. Modifisert fra 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ultratynne rent kollagen sammenstillinger kan avsettes på ladede celler eller materialoverflater ved hjelp av lag-på-lag avsetning av modifiserte bindevevet. Resultatene av denne studien viser at metylering og Succinylering av nativt kollagen skape polykationiske og polyanioniske kollagenløsninger (figur 1) som kan brukes sammen med lag-på-lag teknikk for å avsette ultratynne kollagen matrisesammenstillinger på celler (figur 2) eller en annen belastet materialoverflater. Slike ultratynne matrix lag kan stabilisere morfologien, levedyktighet, og polariseringen av celler så som leverceller (figur 3), etter utsåing i microfluidic enheter, så vel som deres funksjon (figur 4).

For vellykket avsetning av ultratynne kollagen lag, modifikasjons reaksjoner skaper de denaturert og succinylated kollagener er kritiske. Fordi karboksylgruppen metyleringsreaksjonen er ikke gunstig, denkollagen metylering Reaksjonen må utføres i sur metanol for å drive reaksjonen fremover, basert på Le Chateliers prinsipp. Derfor er det viktig å fjerne alt overskudd av vann fra kollagenet etter pH-utfelling før oppløse det utfelte kollagen i sur metanol for å øke reaksjonseffektivitet. For Succinylering reaksjonen, å opprettholde pH i løsningen over 9 under tilsetning av ravsyreanhydrid i aceton er kritisk. Kontinuerlig overvåking av pH-verdien og langsom tilsetning av ravsyreanhydrid acetonløsning er nyttig for å sikre en effektiv reaksjon. I lag-for-lag avsetning, er det viktig å minimere tiden som cellene gå uten media. Prosedyren for 10 bilag tar ca 20 min, noe som er omtrent like lang som de fleste cellene skal være uten media utenfor inkubatoren. Dersom mer enn 10 bilag må deponeres, hvile cellene i media i en inkubator for 3-4 hr between collagen avsetninger for å sikre helsen til cellene. Ved den andre ytterlighet, vil også få lag ikke være effektiv i å opprettholde cellemorfologi. I vår test fikk 3 lag ikke opprettholde cellemorfologi, mens 10 lag gjorde.

Kan gjøres flere endringer i prosedyrene for å feilsøke problemer. Tiden og temperaturen for metyleringen, kan varieres dersom det oppstår problemer. For eksempel, å redusere reaksjonstemperaturen til 4 ° C og å øke tiden til 7 dager, kan øke effektiviteten. Også, avhengig av graden av polymerisering under pH ekstraksjon, kollagen vil noen ganger helt løse seg opp i sur metanol under metyleringen. Hvis dette skjer, tilsett 10 M NaOH for å bringe pH opp til 9-10 etter at reaksjonen er fullført, for å felle ut kollagen, slik at den kan bli pelletert i neste trinn. Mens søknad lag-på-lag deponering i microfluidic enheter, kan små kanaler eller porter bli clogged med kollagen, indikert ved en økning i enheten fluidmotstand. Spyling enheten med nye medier bør fjerne eventuelle blokkeringer, slik at deponering å fortsette.

Den manuelle avsetning av lag-på-lag kollagen som er beskrevet her er en begrensning med hensyn til skalering og automatisering av microfluidic enheter. Imidlertid er denne teknikk er kompatibel med standard mikrofluid maskinvare, inkludert ventiler og pumper som kan brukes for å automatisere teknikken og fremstille sammensetninger av enheter samtidig. En annen begrensning ved denne teknikken for bruk i platekultur er at den krever en forholdsvis stor mengde av nativt kollagen. For mikrofluid søknad, kan volumene av metylerte og succinylated kollagener brukes til å lage supertynne lag kollagen i mange enheter. Med standard vev platekultur, på den annen side volumene som kreves for å belegge brønnene bli mer prohibitive med økende brønn størrelse.

Denne lag-for-lag teknikk for avsetningen av ultratynne kollagen matriks-lag kan videreutvikles ved hjelp av alternative eller funksjonelle modifiseringer, så vel som ved å opprette flere lag av celler adskilt av tynne matrise sammenstillingene. Selv om det ble brukt de relativt enkle aminosyre-sidekjede modifikasjonsreaksjoner for metylering og Succinylering her, kan alternative eller ytterligere reaksjoner brukes i stedet for å danne funksjonaliserte kollagener. De funksjonsidekjedene bør likevel gi proteiner med netto samlede positive og negative ladninger, men en slik funksjonalisering kan være nyttige for en rekke anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
collagen type I, rat tail Life Technologies A1048301 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail EMD Millipore 08-115 option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail R%D Systems 3440-100-01 option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride Sigma-Aldrich 239690-50G succinylation reagent
anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322415-100ML methylation reagent
sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G pH precipitation reagent
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 320331-500ML pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA Chondrex 6013 option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Sigma-Aldrich MAK008-1KT option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit Quickzyme Biosciences QZBtotcol1 option for detecting collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).

Tags

Bioteknologi Kollagen lag-på-lag deponering MicroFluidics hepatocytter metylering Succinylering lever microtissue
Lag-på-lag Kollagen Nedfall i mikrofluid Enheter for Microtissue Stabilization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale,… More

McCarty, W. J., Prodanov, L., Bale, S. S., Bhushan, A., Jindal, R., Yarmush, M. L., Usta, O. B. Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization. J. Vis. Exp. (103), e53078, doi:10.3791/53078 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter