Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve Published: October 18, 2015 doi: 10.3791/53080

Introduction

In vitro tweedimensionale (2D) neurale netwerken gekoppeld aan micro-elektrode arrays (MEA) arethe gouden standaard aangenomen om de wisselwerking tussen neuronale dynamiek en de onderliggende connectiviteit bestuderen experimenteel model. Tijdens de ontwikkeling, de neuronen recreëren complexe netwerken die goed weergegeven definedspatio-temporalpatternsof activiteit 1,2 (dat wil zeggen, uitbarstingen, netwerk uitbarstingen, willekeurige spiking activiteit). MEA registreren de elektrofysiologische activiteit van vele sites (van tientallen tot duizenden micro-electroden), waardoor een grondig onderzoek van de expressie dynamiek op netwerkniveau. Bovendien, het gebruik van gedissocieerde kweken maakt possibile engineered-netwerken te ontwerpen. Het is gemakkelijker te begrijpen op deze wijze de functionele verbanden tussen de opgenomen elektrofysiologische activiteit en de parameters van het netwerk organisatie als celdichtheid 3, modulariteit 4,5, aanwezigheid van heterogene neuronale populations 6, etc. Echter, alle in vitro naar gescheiden gekweekte cellen op basis van 2D-neuronale netwerken. Deze benadering leidt tot vereenvoudigingen ten opzichte van de in vivo (intrinsiek 3-dimensionale, 3D) systeem: (i) in een 2D-model, somata en groei kegels afgevlakt en de axonen-dendrieten uitgroei kan verspreiden in alle richtingen 7. (ii) 2D in vitro netwerken vertonen stereotiep elektrofysiologische dynamiek gedomineerd door barsten activiteit die het grootste deel van de neuronen van het netwerk 8.

Recentelijk zijn verschillende oplossingen ontwikkeld om de constructie van in vitro 3D gedissocieerde neuronale netwerken mogelijk maken. Het gemeenschappelijke idee bestaat in het creëren van een steiger waar de neuronen kunnen groeien in een 3D-mode. Een dergelijke steiger kan worden gerealiseerd met polymeer gels en vaste poreuze matrices 9-13. Door het benutten van de mechanische eigenschappen van de polymeren, is het mogelijk om cellen in te bedden these structuren door het definiëren van een uniform blok 3D culturen van neurosferen 11. Het belangrijkste kenmerk van deze aanpak is de starre mechanische eigenschap van de neurosferen 9,12. Echter, deze materialen beperkt porositeit, en dat doen ze niet garanderen celmigratie in de matrix. Om dit nadeel te ondervangen, een mogelijke oplossing bestaat uit het doorsnijden van de matrix in "eenheid" modules. Helaas, kunnen de grootte en vorm diversiteit van de deeltjes de pakking in reguliere gelaagde structuren belemmeren. In 7, Cullen en medewerkers ontworpen 3D neuronale construct uit neuronen en / of astrocyten binnen een bioactief extracellulair matrix-gebaseerde scaffold. Een dergelijke gemanipuleerde zenuwweefsel toegestaan ​​in vitro onderzoek te bestuderen en te manipuleren neurobiologische reacties binnen 3D micro-omgevingen. Dit model bestaat uit neuronen en glia gedistribueerd door de extracellulaire matrix (ECM) en / of hydrogel scaffolds (500-600 micrometer dik). In dit condition een optimale cellevensvatbaarheid (meer dan 90%) werd gevonden door uitplaten cellen bij een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 3750 - 5000 cellen / mm3. Opgemerkt zij dat een dergelijke dichtheidswaarde veel lager dan in de in vivo toestand, wanneer de celdichtheid van muizenhersenen cortex ongeveer 90.000 cellen / mm 3 14. Om deze beperking te overwinnen Pautot en medewerkers 15 realiseerde een 3D in vitro systeem waarbij de celdichtheid en netwerkconnectiviteit gecontroleerd te lijken in vivo omstandigheden tegelijk een real-time weergave van het netwerk. Praktisch is deze methode gebaseerd op het concept dat gedissocieerde gekweekte neuronen kunnen groeien op silica microkorrels. Deze kralen te groeioppervlak groot genoeg voor neuronale cellichamen te houden en hun arborizations groeien, rijpen, uitbreiden en definiëren synaptische contacten met andere neuronen. Deze methode maakt het spontane samenstel eigenschappen van mono-gedispergeerde kralen FOrm 3D gelaagde zeshoekige arrays met verschillende subsets van neuronen op verschillende lagen met constrained verbinding tussen neuronen van verschillende kralen. De bereikte celdichtheid met deze methode ongeveer 75.000 cellen / mm3.

Onlangs hebben we methode Pautot's aangepast MEA 16: de verkregen resultaten blijkt dat de 3D ​​elektrofysiologische activiteit presenteert een breder repertoire activiteiten dan het door 2D maken zich. 3D volwassen culturen vertonen een verbeterde dynamiek waarin zowel het netwerk burst en willekeurige spike activiteit naast elkaar bestaan. Evenzo Tang-Schomer en 17 medewerkers realiseerde een zijde eiwit-gebaseerde poreuze scaffold die een primaire corticale kweken handhaaft in vitro enkele maanden, en nam de elektrofysiologische activiteit middels een wolfraamelektrode.

In dit werk, de experimentele procedures 3D neuronale netwerken gekoppeld aan MEA bouwen wordt beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het experimentele protocol werd door de Europese Animal Care wetgeving (2010/63 / EU), door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid goedgekeurd in overeenstemming met de DL 116/1992 en door de richtlijnen van de Universiteit van Genua (Prot. N. 13.130, mei 2011). Alle inspanningen werden gedaan om het aantal dieren dat voor het project te verminderen en hun lijden te minimaliseren.

1. Voorbereiding van Materialen en Supports

  1. Construct de mal om de PDMS (Poly-dimethyl-siloxaan) constraint te bouwen door middel van een CNC (Computer Numerical Control) freesmachine. Een dergelijke vorm wordt gerealiseerd in polycarbonaat met de centrale cilinder polytetrafluorethyleen (PTFE). Dit materiaal maakt eenvoudiger extractie van het masker nadat het PDMS is uitgehard.
    NB: Het ontwerp van de mal is uitgevoerd door Computer-Aided Design (CAD) en vervolgens geleverd aan de CNC-freesmachine.
  2. Bereid de PDMS elastomeer. PDMS is een organisch polymeer. Het bestaat uit twee elementenEen hardingsmiddel en een polymeer. Vermengen door een volumeverhouding van 1:10, een deel hardingsmiddel en negen delen polymeer. Leg de twee componenten in een petrischaal, schud en plaats het mengsel in de vacuümkamer gedurende 10 min om luchtbellen te elimineren. 3 g PDMS is voldoende voor een beperking.
  3. De bouw van het PDMS beperking. Plaats de PDMS materiaal in de boetseerder en zet het in de oven gedurende 30 min bij 120 ° C. De PDMS beperking heeft de vorm van een ideale cilinder met een uitwendige en inwendige diameter van 22,0 en 3,0 mm respectievelijk en een hoogte van 650 urn.
  4. De dag voor de beplating, stel het masker op het actieve gebied van de micro-elektrode arrays (MEA) met behulp van een pincet onder een stereomicroscoop en steriliseer de PDMS masker in de oven op 120 ° C.
  5. Steriliseer de glasmicrokralen (nominale diameter van 40 ± 2 urn; gecertificeerd gemiddelde diameter van 42,3 ± 1,1 pm) in 70% ethanol gedurende 2 uur in een konische flesje en draai every 30 min om alle microbolletjes bloot.
  6. Verwijder de ethanol-oplossing uit het flesje en spoel de microbolletjes twee keer met gesteriliseerd water.
  7. Conditioneer het centrale deel van het MEA afgebakend door PDMS masker (diameter gelijk aan 3,0 mm) met 24 gl gemengde oplossing van Poly-D-Lysine en laminine bij 0,05 ug / ml.
  8. Coat de microkorrels met adhesie-eiwitten, laminine en poly-D-lysine op 0,05 ug / ml en laat ze een nacht in de incubator bij 37 ° C, een stabiele en langdurige neurale netwerk te verkrijgen.
  9. Verwijder de adhesiefactoren zowel het glazen oppervlak van de MEA en de microbolletjes van glas. Zuig ongeveer 95% van de bekledingsoplossing met een pipet en breng een kleine volume- 24μl- steriel water op het oppervlak MEA. Zuig weer meer dan 95% van het water en laat het MEA drogen onder laminaire kap 1 uur vóór het uitplaten van de cellen.
    OPMERKING: Bij microkorrels plaats, zuig het coatingoplossing en een eerste wassen met gesteriliseerd water en een tweede met het basismedium en de aanvulling zoals B27, teneinde het glasoppervlak waarin neuronen wordt uitgeplaat conditie. Laat de microbolletjes droog. Laat ze in suspensie in het kweekmedium in de flacon.
  10. Verdeel met behulp van een pipet -200 μl-, de suspensie van microbolletjes behandelde (ongeveer 32.000) op een plaat met meerdere putjes met insert membraan (poriediameter 0,4 urn) wanneer zij zelfassemblage vorming van een uniforme laag.
  11. Vul elk putje van het membraan met 0,5 ml medium en zet het in de incubator (T = 37,0 o C, CO 2 = 5%) tot de neuronen zijn klaar om te worden verzilverd (3.2).

2. Dissectie van embryo's en dissociatie van Tissue

  1. Vrouwelijke ratten huis volwassen (200-250 g) bij een constante temperatuur (22 ± 1 ° C) en luchtvochtigheid (50%) onder normale licht-donker schema (light-on 7 AM-PM 7) in dedier faciliteit. Zorg ervoor dat voedsel en water zijn vrij beschikbaar.
  2. Verdoven een zwangere vrouwelijke ratten na 18 dagen van ontwikkeling (E18) met 3% isofluraan. Vervolgens offeren het dier door cervicale dislocatie.
  3. Hippocampus verwijderd uit elk embryo rat en plaats ze in ijskoude Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 +. Op dag 18 van de ontwikkeling hippocampus en cortex weefsels zeer zacht en hoeven niet in kleine stukjes te snijden. Nadere details vindt u 18,19.
  4. Distantiëren het weefsel in 0,125% trypsine / Hank's oplossing bevattende 0,05% DNAse gedurende 18-20 min bij 37 ° C.
  5. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet en stopt de enzymatische digestie door het toevoegen van medium met 10% foetaal runderserum (FBS) gedurende 5 min.
  6. Verwijder het medium met FBS en eenmaal wassen met het medium met supplement, 1% L-glutamine, gentamicine 10 ug / ml. Verwijder opnieuw het medium met een Pasteur pipette en vult deze opnieuw met een kleine hoeveelheid (500 ui) van het groeimedium met supplement, 1% L-glutamine, gentamicine 10 ug / ml.
  7. Distantiëren van het weefsel pellet mechanisch met een smalle Pasteur pipet tot er een melkachtige suspensie van cellen is duidelijk. Het is niet nodig de celsuspensie centrifuge.
  8. Verdun het kleine volume celsuspensie met het groeimedium tot een eindvolume van 2,0 ml. Tel de verkregen cellulaire concentratie met een hemocytometer kamer. Verdun deze concentratie 1: 5 om het gewenste celconcentratie van 600-700 cellen / ul te verkrijgen.

3. Cell Plating

  1. Plate cellen bij een dichtheid van ongeveer 2000 cellen / mm 2 op het actieve gebied van de MEA, gedefinieerd door de PDMS beperking voor een 2D neuronaal netwerk.
    OPMERKING: Elke hippocampus bevat ongeveer 5 x 10 5 cellen (1 x 10 6 voor een enkele embryo). Ontleden 6 embryo's tot een totaal bedrag van 6 x 10 krijgen6 cellen in 2 ml en een geschatte concentratie van 3000 cellen / ul. Verdun deze concentratie 1: 5 om het gewenste celconcentratie te verkrijgen en de plaat ongeveer 600-700 cellen / ul. Als het MEA afgebakend door PDMS constraint ongeveer 7,065 mm 2, en het totale aantal cellen uitgeplaat 600 cellen / ul x 24 gl = 14.400 cellen de uiteindelijke dichtheid van 2038 cellen / mm2.
  2. Plaats de MEA inrichtingen in de incubator met bevochtigde CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C.
  3. Verdeel 160 pi van de suspensie met een celconcentratie van 600-700 cellen / pl (ongeveer 100,000 cellen) op het oppervlak van de microbolletjes monolaag gepositioneerd binnen de multiwell platen om de eerste stap bij de constructie van driedimensionale cultuur voltooien. Zet de multiwell platen in de incubator met bevochtigde CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C.

4. 3D Neuronal Netwerk Bouw

  1. 6-8 uur na het plateren, breng de suspensie (microkorrels met neuronen) vanaf het multiwell platen voorzichtig binnen het gebied begrensd door de PDMS beperking met behulp van een pipet instellen voor een volume van ongeveer 30-40 pl. Na elke overdracht, wacht ongeveer een halve minuut, om de microbolletjes om zichzelf assembleren in een hexagonale compacte structuur mogelijk te maken.
  2. Zodra alle lagen worden afgezet en spontaan geassembleerd, vullen met een grote daling van ongeveer 300 ul medium boven het gebied begrensd door de PDMS constraint.
  3. Zet de 3D ​​structuur gekoppeld met de MEA in incubator (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) gedurende 48 uur voordat een eindvolume (ongeveer 1 ml) groeimedium kweek met supplement.
    OPMERKING: Beschouw het totale aantal kralen op de multiwell platen met membraan insert (30000) en het aantal kralen op een enkele laag op de MEA inrichting (6000). Het resulterende 3D-structuur bestaat uit 5 lagen microbeads en cellen. Aangezien de 3D neurale netwerk niet geometrisch perfect kan het resulterende 3D-structuur bestaat uit 5-8 lagen.
  4. De dag na plating, zorgvuldig het uiteindelijke volume van het medium (ongeveer 900 pl) in de MEA ring toe te voegen. Handhaaf de 3D ​​kweken in een bevochtigde CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C gedurende 4-5 weken. Vervang de helft van het medium eenmaal per week.

5. confocale microscopie Acquisition

  1. Bevestig de biologische monsters tot het stadium van de microscoop in een houder. Stel de laser (Argon, 496-555 nm), de scansnelheid (400 Hz), waarbij aan het beeld, de versterking en offset (-0,3%) van de PMT te verwerven voor elk beeld om de juiste bandbreedte emissie-filter en om vast te leggen verzadiging voorkomen en de signaal-ruisverhouding te verhogen. De resultaten afdeling rapporteert de waarden die worden gebruikt om de beelden van figuur 4 te verwerven.
  2. Voor de verwerving van de z -stack volgorde, sparst selecteren, de waarde van de Z-positie van de bovenste en de onderste laag van het monster, en selecteer vervolgens de stap grootte om de overname te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

. In deze experimentele procedure wordt een belangrijke rol gespeeld door de microkorrels dat de mechanische scaffold de groei van de 3D ​​neurale netwerk te definiëren figuren 1A en B tonen de opstelling van de microkorrels (nominale diameter van 40 ± 2 urn; gecertificeerd gemiddelde diameter 42,3 ± 1,1 micrometer) in het vliegtuig. De bijzonderheid van dergelijke structuren is dat microkorrels spontaan zelfassemblage die een compact hexagonale geometrie (Figuur 1B en C). De zo gegenereerde schavot staat garant voor een consistente groei oppervlak voor neurieten en een groot genoeg interstitiële ruimte voor de metabolische uitwisseling van de cellichamen. Dit microbeads dimensie blijkt een redelijk compromis voor interstitiële tussenruimte en laatste neuronale dichtheid. Aangezien de PDMS structuur reconstrueert een "ideaal" cilinder, en aangezien de compacte hexagonale structuur effect factor (HPF) gelijk is aan 0,74, het maximum aantal bolletjes (diameter 4081; m) die in het PDMS constraint ongeveer 100.000, hetgeen overeenkomt met ongeveer 6000 microbolletjes per elke laag. Zoals uiteengezet in het protocol van deze microkorrels zijn voorgeconditioneerd met adhesiefactoren (dwz, laminine en poly-D-lysine). Deze procedure garandeert dat neuronen zich aan de microbolletjes. Figuur 1 D toont een voorbeeld waarbij drie neuronen gekoppeld met een microbead met een diameter van 40 urn.

Figuur 1
Figuur 1. Beelden van de microbolletjes toegepast om de matrix voor het neurale netwerk. (A, B) Twee voorbeelden van monolagen van microbolletjes op het oppervlak van een plaat met meerdere putjes met membraan insert. (C) Microkralen afgewikkeld onder zwaartekracht en spontaan samengesteld tot 2D zeshoekige arrays. Nadat de eerste laag volledig is verpakt, andere kralen worden toegevoegd, te bouwening een tweede besteld laag met dezelfde zeshoekige symmetrie. Verdere toevoeging van microbolletjes resulteerde in de constructie van een 3D verpakte samenstel. De vrije ruimte tussen de microbolletjes wordt gevuld door neuronale processen en cellichamen. (D) Drie neuronen worden verankerd op het oppervlak van een enkele microbead eerder airconditioning met adhesie factoren (Laminin en Poly-D-lysine). Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.

De koppeling van de microkorrels en neuronen met het actieve gebied van de MEA komt door een elastomere constraint (figuur 2C), gerealiseerd met de matrijs getoond in figuren 2A en B. Figuur 2A toont de indeling en de gekozen afmetingen. Het actieve gebied van de MEA wordt begrensd door het koppelen van de PDMS structuur van figuur 2C de MEA substraat (figuur 2D). Zo zijn neuronen gedwongen zich aan de actieve elektrode gebied van de MEA. Vervolgens wordt het glas microbead stacks met hechtende neuronen worden ondergebracht op de eerste laag. Figuur 2D toont een dwarsdoorsnede van de uiteindelijke configuratie, waarbij de rol van de PDMS structuur duidelijk kan worden gewaardeerd. De ruimte begrensd door de PDMS structuur bevat het mengsel van microbolletjes en neuronen (wit poeder in het onderste paneel van Figuur 2D). De PDMS structuur heeft de vorm van een cilinder gebouwd met de vorm getoond in figuur 2B met de volgende afmetingen: buiten- en binnendiameter van respectievelijk 22,0 en 3,0 mm en een hoogte van 650 urn. De mal werd gebouwd met behulp van polycarbonaat en PTFE waardoor een ideale glad en bestendig materiaal om de extractie van de elastomeer masker.Het PDMS beperkingen vertonen een kortere levensduur te vergemakkelijken, aangezien de kleverige eigenschappen van de PDMS daling na elk gebruik. Typisch Elke PDMS structuur succes driemaal gebruikt.

Figuur 2
Figuur 2. bouwmaterialen 3D neurale netwerk. (A) Ontwerp en (B) beeld van de mal gebruikt voor de fysieke beperking te creëren. De grijze 3 mm cilinderdiameter overeenkomt met de opening van de constraint weergegeven in (C). (C) PDMS beperking geplaatst op het actieve gebied van een micro-Electrode Array (MEA). Het gebruik van dergelijke fysieke barrière mogelijk maakt om de microbolletjes in een doelgebied bevat (ongeveer 7 mm 2) en beperkt de ontwikkeling van het 3D-netwerk. (D) Doorsnede van de MEA systeem en constraint. Microbolletjes (afgebeeld door de microscoop in de rechterbovenhoek) worden gevuld in de ruimte begrensd door de PDMS constraint (onderste paneel).080fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na de opsluiting van het actieve gebied van de MEA door de PDMS masker, het protocol verder als afgebeeld in de panelen van figuur 3, waarin de belangrijkste stappen voor de assemblage van neuronen en microkorrels realiseren.

De eerste voorbereidende stap bestaat uit plating gedissocieerd neuronen op de MEA oppervlak dat is eerder vooraf bekleed met adhesiemoleculen laminine en Poly-D-Lysine (Figuur 3A). Het is essentieel dat de 2D neurale netwerk houdt direct naar actieve gebied van de MEA: alleen onder deze omstandigheden, de registratie van de elektrofysiologische signalen (dat wil zeggen pieken en uitbarstingen) haalbaar. Het eerste deel van het protocol is de gebruikelijke procedure voor 2D neuronen plaat. De aanleg van het 3D-systeem is weergegeven in figuren 3B, C en D (figuur 3B); Daarna wordt een 160 pl suspensie met een celconcentratie van 600-700 cellen / pl (ongeveer 100,000 cellen) gedistribueerd naar de microbolletjes monolaag (figuur 3C). Aangezien cellen helft van de hielzone kan delen en het totale oppervlak is 75 mm 2. De celdichtheid van de microkorrels monolaag ongeveer 1500 cellen / mm2. De gebruikte multiwell platen met membraan insert vormen een poreus membraan met een oppervlak van 33,6 mm 2. Door rekening virtuele cilindrische vorm met een base oppervlakte gelijk aan het poreuze membraanoppervlak en een hoogte van 40 urn (pareldiameter), wordt een uniforme laag bestaande uit 30.000 microbolletjes gekoppeld met de multiwell platen met membraan insert. De zo realiseerde opschorting van microbolletjes en neuronen blijft voor ongeveer 6-8 uur in de multiwell platen met membraan insert. Eensbovengenoemde stappen zijn voltooid, kan de constructie van het 3D-netwerk starten. Op dit moment wordt het mengsel van neuronen en microkorrels uit de multiwell platen met membraan insert en op het neuronale netwerk 2D eerder uitgeplaat op het gebied gedefinieerd door de PDMS constraint (Figuur 3D). Tijdens deze procedure wordt een verlies van ongeveer 20-30% van de neuronen optreedt als gevolg van (i) mechanische manipulaties en (ii) de overdracht buiten het membraan. Door rekening basisareaal van de constraint (7,06 mm 2) en een hoogte van 178,56 urn (5 lagen kralen) en delen van het aantal cellen door het volume van de ideale cilinder gevormd door de 5 lagen van kralen, het resulterende 3D neuronale netwerk celdichtheid is ongeveer 80.000 cellen / mm 3.

Figuur 3
Figuur 3. Schets van de fundamentele stappen om 2D- en 3D-neuronale netwerken te creëren. (A) Plating of neuronen op het actieve gebied van de MEA. De opschorting van neuronen wordt uitgeplaat op de MEA oppervlak, die eerder airconditioning met adhesie factoren en begrensd door de PDMS beperking. Deze stap maakt het mogelijk om te realiseren: i) een klassieke 2D neuronale netwerk gekoppeld aan MEA; ii) de eerste laag van een 3D-netwerk van waaruit de elektrofysiologische activiteit wordt opgenomen. (B) Microkralen en (C) neuronen worden geleverd aan het oppervlak van de multiwell platen met membraan wordt na 6-8 h. (D) De suspensie van neuronen en microkorrels wordt verplaatst van de multiwell platen met membraan insert het 2D netwerk. De herhaling van deze stap meerdere keren toelaat een dichte meerlagige 3D structuur. (E) Wanneer de 3D ​​structuur is afgesloten, een druppel medium wordt toegevoegd en de resulterende structuur wordt opgeslagen in de incubator gedurende 48 uur. (F ) Na 48 uur wordt het 3D-kweek volledig nagevuld met het eindvolume van het medium.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nadat de eerste laag is geplaatst, wordt dezelfde bewerking herhaald voor een volle 3D ensemble verkrijgen. Het resulterende 3D-structuur reorganiseert zelf definiëren van een colloïdaal kristal dat zelf-assemblage in een compacte constructie bestaande uit ongeveer 5-8 lagen microkorrels en neuronen (figuur 4). Zodra alle lagen worden gevormd, het 3D-netwerk worden bijgevuld met een druppel van 300 ul medium (figuur 3E). In dit stadium kan 3D-netwerken gekoppeld MEA in de incubator bewaard gedurende 48 uur. Daarna wordt 1 ml medium toegevoegd om de ring van het MEA (figuur 3F) vullen.

Zodra alle lagen zijn samengesteld, neurieten groeien in de microbead steiger tot een definitieve cel dichtheid van ongeveer 80.000 cellen / mm 3. Het is de moeite waard noticing dat de verkregen waarde is niet ver van 92.000 cellen / mm 3, de gemiddelde neuronale dichtheid in de hersenen van muizen cortex 14.

Figuur 4 toont drie voorbeelden van 3D-netwerken gekoppeld aan MEA vastgelegd door middel van confocale microscopie rechtop. In figuur 4A, de DIC (differentieel interferentie contrast) beeld toont een enkele laag korrels gekoppeld aan het MEA oppervlak; de microscoop ging gepaard met 20,0 NA 0,50 water doelstelling en de beelden werden verkregen met Overdraagbare PMT opgenomen om de microscoop en een Laser Argon (488 nm). De foto's tonen duidelijk de ruimtelijke inrichting van de elektroden (zwarte stippen) en de regelmatige ruimtelijke organisatie van de microbolletjes.

In figuur 4B een immunofluorescentie kleuring voor kaart-2 (rood signaal) toont de verdeling van dendritische arborizations en somata van neuronen ongeveer microbolletjes direct gekoppeld aan het elektrodevlak MEA (de aanwezigheid van de zwarte contacten kunnen worden waargenomen). Figuur 4B is een maximale projectie van een z- stapel sequentie (108 pm) met de stapgrootte gelijk aan 1,53 pm. Beelden werden verworven met 40,0 NA 0,80 water doel; de excitatie Argon Laser (488 nm), de emissie bandbreedte 496nm-655 nm.

Tenslotte Figuur 4C toont de maximale projectie van een z -stack reeks (187,79 gm) van een 3D-hippocampus cultuur (stapgrootte 2.27 pm). De z -stack sequentie werd verkregen met 25,0 NA 0,95 water doelstelling. Voor groene kanaal, werden een Argon laser 488 nm en een emissie-filter bandbreedte van 499nm-551nm gebruikt. Voor rode kanaal, waren een 543 nm laser en een emissie-filter bandbreedte van 555nm-645nm gebruikt. De kanalen werden verworven reeksmodus. Een zeer fijnmazig netwerk ontstaat waarbij neuronen gelabeld voor Neun uitgedrukt in volwassen post-mitotische neuronen (rood signaal) en Gaba (groene signaal, yellaag in merge). Gaba antilichaam bleek een positiviteit op remmende neuronen zowel in de somata en neurieten.

Figuur 4
Figuur 4. Drie voorbeelden van 3D netten gevangen door confocale microscopie. (A) DIC (differentieel interferentie contrast) beeld dat een enkele laag korrels gekoppeld aan het MEA oppervlak; de ruimtelijke indeling van de elektroden (zwarte stippen) waarneembaar. (B) Immunofluorescentie kleuring voor kaart-2 (rood signaal) toont de verdeling van dendritische arborizations en somata van neuronen ongeveer microbolletjes direct gekoppeld aan de elektrode vlak van de MEA. ( C) Maximale projectie van een z -stack reeks (187,79 gm) van een 3D-cultuur weergeven van een sterk onderling verbonden netwerk waar neuronen worden gelabeld voor Neun uitgedrukt in volwassen post-mitotische neuronen (rood signaal) en Gaba (groene signaal, geel in merge ). Gaba antilichaam revealed een positiviteit voor remmende neuronen, zowel in de somata en neurieten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om te begrijpen of de aanwezigheid van een 3D-structuur moduleert de netwerkdynamiek, werd de aldus opgewekte elektrofysiologische activiteit vergeleken met conventionele 2D neuronale netwerken gegroeid MEA, waarbij het referentiemodel vertegenwoordigen.

Figuur 5
Figuur 5. Vergelijking van de netwerkdynamiek vertoond door 3D (linker kolom) en 2D (rechterkant) hippocampale kweken bij elke tijdschaal (A: 1200 sec, B: 300 seconden; C: 60 sec D: 10 sec)., 3D assemblages tonen een verscheidenheid van de handtekeningen van de activiteit (dat wil zeggen, op korte en lange netwerk uitbarstingen, willekeurige stekeligeactiviteit, gesynchroniseerde uitbarstingen), terwijl 2D degenen een meer uitgesproken stereotiepe activiteit met alleen hoge gesynchroniseerde barst weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5 toont twee raster percelen van twee representatieve experimenten uitgevoerd op een 3D (links panelen) en 2D (rechts panelen) hippocampus cultuur tijdens de vierde week in vitro. Deze plots tonen de elektrische activiteit van het netwerk die op alle actieve elektrodes (bijv. Elektroden met een verbranding van meer dan 0,1 spikes / s).

De dynamiek van netwerken 2D tonen een quasi-synchrone activiteit hoofdzakelijk samengesteld netwerk bursts. De ondertekening van deze dynamiek is de aanwezigheid van gesynchroniseerde gebeurtenissen die het grootste deel van de opname-kanalen afgewisseld door de periode waarin bijna geen activiteit is geregistreerd te betrekken (zie het rechter paneel vanFiguur 5D). Dit gedrag kan worden gewaardeerd op verschillende tijdschalen, zoals de verschillende niveaus van vergroting onderstrepen.

Bij een 3D-netwerk, de handtekening van de netwerkdynamica uit een breder repertoire van activiteiten met: (i) minder globaal synchroniciteit, (ii) meer willekeurige spiking activiteit (iii) perioden waarin subnetwerken (dwz een subgroep van micro-electroden) presenteren een synchrone activiteit met het optreden van netwerk bursts. Bovendien is de duur van de bursts netwerk is variabel en er is de aanwezigheid van het netwerk van bursts met een duur gelijk aan die waargenomen in de 2D-netwerken, maar er zijn ook langere bursts netwerk. Een volledige en kwantitatieve karakterisering van de opkomende 3D ​​dynamiek verkregen door dergelijke werkwijzen kan worden gevonden in 16. Zoals verwacht, de 3D-neuronale netwerk vertoont ook een significante 'willekeurige stekelige' en niet-synchrone uiteenspatten eenctivity. De aannemelijkheid van de door deze 3D-structuren dynamiek zijn gerezen met enige controle-experimenten (bijv aanwezigheid van een 2D netwerk gekoppeld aan een MEA met een stapel bare microbolletjes en 3D-netwerken gemonteerd op de microbolletjes met een blote MEA), zoals gerapporteerd bij 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk, een nieuw experimenteel in vitro platform opgebouwd uit 3D-engineered neuronale culturen gekoppeld aan MMO's voor netwerk-elektrofysiologie is gepresenteerd. Het gebruik van microbolletjes als scaffold de neuritische uitgroei langs de z-as toe is afgestemd worden geïntegreerd met de vlakke MEA. Op deze wijze verkregen micro-systeem resulteert in een valide en betrouwbare in vitro 3D model voor de opkomende elektrofysiologische dynamiek 16 bestuderen.

MEA opname set-up

MEA inrichtingen bestaan ​​uit een kweekkamer met een geïntegreerde reeks substraat ingesloten micro-elektroden kunnen meten extracellulaire signalen van elektro-actieve weefsels. De typische opgenomen signalen uit spikes (dwz één supra-drempel spanningsvariatie die de elektrische activiteit van één of meer neuronen) en uitbarstingen (dwz reeks zeer verpakte spikes vaak Occurring gelijktijdig op meerdere kanalen). De opnames van neuronale netwerken activiteit MEA-gebaseerde systemen te produceren enorme hoeveelheid gegevens (bijvoorbeeld een 4 uur experiment met een 60 kanalen MEA produceert een record van ongeveer 15 GB). Dit impliceert de noodzaak van efficiënte hulpmiddelen voor het verwerken en analyseren van gegevens, met name bij studies die lang opnames nodig hebben. In het algemeen wordt de registratie van de elektrofysiologische signalen verkregen door een directe extracellulaire transductie met de neuronale kweken en het verwerven van een spanningssignaal. Na versterking en filtering fase worden bemonsterd 10-50 kHz en opgeslagen. De ruwe signalen worden vervolgens piek gedetecteerd door een speciaal ontwikkelde software tool. De opname systeem bestond uit (1) MEA versterker, (2) personal computer uitgerust met A / D-acquisitie board, (3) opname software, (d), verwarming en de temperatuur controller, (4) CO2 atmosfeer-behoud en verdamping-voorkomen systemen.

Debouw van de 3D neuronale netwerk doorloopt twee belangrijke stappen: de eerste is de verdeling van de juiste hoeveelheid korrels op de multiwell platen met membraan insert oppervlak, de tweede is de overdracht van de suspensie van microbolletjes met aanhangend neuronen van de multiwell platen met membraan insert: (i) het 2D neurale netwerk uitgeplaat op het actieve gebied van de MEA (eerste laag); (ii) de reeds afgewikkeld lagen. Deze operatie wordt zo vaak herhaald als het aantal vereiste lagen. Tijdens de eerste week van cultuur, een snelle groei van neuritische extensions vindt plaats rond de microbolletjes behorende bij de verschillende lagen. De nauwe band tussen de neuronen en microbolletjes stabiliseert de biologische monsters en laat om het te verplaatsen van de incubator te veranderen / vervang het medium en op te nemen met de MEA versterker de elektrische activiteit zonder zorgen over te beschadigen.

Aangezien de elektrofysiologische activiteit van het gehele netwerk is opgenomen alleen van de onderste laag (dat wil zeggen, de ene direct gekoppeld aan de MEA), het actieve gebied moeten worden gedekt door een conventionele 2D-netwerk. De andere lagen stapsgewijs toegevoegd via een 2D- en lange afstand verbindingen worden verspreid onder de lagen. Praktisch worden de overige lagen 6-8 uur later dan de 2D één toegevoegd door afzetten van het mengsel van neuronen en microkorrels. De keuze van deze vensterfuncties de vorming toe van een enkele synaptische verbindingen in de 2D-laag, en garandeert de mogelijkheid om verbindingen met de bovenste lagen te stellen.

Twee factoren maken het gebruik van platen met meerdere putjes met membraan nodig om de 3D-netwerken te realiseren voegen: (i) omdat neuronen en microkorrels presenteren verschillende sedimentatie snelheden, het gebruik van platen met meerdere putjes met membraan insert waarborgt een gelijkmatige verdeling van neuronen op de bovenkant van de microkorrels : Gemiddeld kan elke microbead worden omringd door hetzelfde aantal neuronen. (ii) By benutten van de elastische eigenschappen van de multiwell platen met membraan insert, de terugslag van de oplossing van microbolletjes gekoppeld met neuronen is gemakkelijker dan het gebruik van vaste oppervlakken zoals polycarbonaat met meerdere putjes.

Ons onderzoek volgt door Pautot voorgestelde aanpak en medewerkers 15: in deze studie het gebruik van silicapareltjes ontvangen een groeioppervlak groot genoeg voor neuronale cellichamen te houden en hun processen te groeien, rijpen en produceren pre- en postsynaptische specialisaties . Een alternatief voor het gebruik van korrels steiger afkomstig van hydrogels matrices of biologisch actieve en biologisch afbreekbare korrels samengesteld uit natuurlijke biopolymeer zoals chitosan. Chitine en zijn gedeacetyleerd derivaat, chitosan, zijn niet giftig, antibacteriële, biocompatibele en biologisch afbreekbare biopolymeren. De tijdconstante van dergelijke biologische afbraak verenigbaar is met het netwerk uitgroei 20,21.

Dit onderzoek kan een verwijzing wor vormenk voor de toekomstige ontwikkeling van geavanceerde 3D-neuronale modelsystemen het systematisch bestuderen van de wisselwerking tussen netwerk dynamica en structuur. In een korte tijd, hopen we in staat zijn om de 3D-netwerk construct dragen aan een nieuwe generatie van apparaten 22. De fabricage techniek omvat de produktie van elektroden in de vorm van micro-pijlers op een variabele hoogte tussen 50 en 350 urn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs danken Giorgio Carlini voor de technische ondersteuning bij de ontwikkeling van de opsluiting structuur en Dott. Ornella LoBrutto voor de grondige herziening van het manuscript. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering van 7e kaderprogramma van de Europese Unie ontvangen (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers regeling) onder subsidieovereenkomst 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminin Sigma-Aldrich L2020 0.05 µg/ml
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 0.05 µg/ml
Trypsin Gibco 25050-014 0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase Sigma-Aldrich D5025 0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal Gibco Invitrogen 21103049 culture medium
B27 Gibco Invitrogen 17504044 2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-2442 10%
Glutamax-I  Gibco 35050038 0.5 mM
gentamicin Sigma-Aldrich G.1272 5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS) Corning Sigma 481939 curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems (MCS) 60MEA200/30-Ti-pr MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead Distrilab-Duke Scientific 9040  1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell Costar Sigma CLS 3413 multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++  Gibco Invitrogen 14175-052
Hanks Buffer Solution  Sigma  H8264
Teflon Sigma 430935-5G polytetrafluoroethylene
Rat Sprague Dawley Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright Leica TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
40.0x0.80 WATER objective Leica Leica HCX APO L U-V-I 
25.0x0.95 WATER objective Leica HCX IRAPO L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
  2. Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures. Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).
  3. Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices. Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).
  4. Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays. J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).
  5. Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front. Neuroeng. 4, (2011).
  6. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J. Neural. Eng. 9, (2012).
  7. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).
  8. Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation. J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).
  9. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).
  10. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).
  11. Ma, W., et al. CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels. Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).
  12. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue En. 13, 473-482 (2007).
  13. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).
  14. Schuz, A., Palm, G. Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse. J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).
  15. Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks. Nat. Method. 5, 735-740 (2008).
  16. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci. Rep. 4, (2014).
  17. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).
  18. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cell. , 2nd edition, MIT Press. (1998).
  19. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (39), (2010).
  20. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications. Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).
  21. Crompton, K. E., et al. Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering. Biomaterial. 28, 441-449 (2007).
  22. 3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).

Tags

Neurowetenschappen 3D-netwerken ontworpen netwerken neuronale culturen Micro-elektrode arrays (MEA) netwerk dynamiek elektrofysiologische signalen
Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia,More

Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model. J. Vis. Exp. (104), e53080, doi:10.3791/53080 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter