Introduction
الخميرة في مهدها خميرة الخباز توفر العديد من المزايا للدراسات الآليات الجزيئية من العمليات البيولوجية، بما في ذلك دراسة البروتينات التي تتحكم في وظيفة كروموسوم. على الرغم من أن هناك مزايا معروفة من مهدها الخميرة للدراسات الجينية والجزيئية والكيمياء الحيوية، ودراسات الخلوي لتوزيع البروتينات في نواة الخلية معقد بسبب صغر حجمها. نواة الخميرة النموذجية التي يبلغ قطرها ميكرون أقل من واحد، هو فقط حوالي 5 أضعاف الحد قرار من الضوء المرئي. وهكذا، فإن كمية المعلومات حول توزيع البروتينات النووية التي يمكن الحصول عليها من المناعية التقليدية أو باستخدام علامات بروتين فلوري، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، محدودة. نهج مفيد لتميز توزيع النووية الدقيقة من البروتينات السطحية كروموسوم الانتشار. هذا النهج ينطوي على إزالة جدار الخلية، وتعطيل الخلايا والأغشية النووية، والنماذج التالية محتويات غير قابلة للذوبان من نواة ليستقر على سطح شريحة المجهر. وتشمل هذه المكونات غير القابلة للذوبان المصفوفة النووية والكروموسومات. بالإضافة إلى السماح إزالة محتويات النووية القابلة للذوبان، التي تعزز من القدرة على الكشف عن لونين البروتينات ملزمة، الكروموسوم نشر نتائج الأسلوب في الضغط كبيرا من الكروموسومات مثل أن انتشار نواة لها أقطار حوالي 3-5 ميكرون (لنوى الانتصافي مضاعفا) و 2-3 ميكرون لنوى الإنقسامية مضاعفا. هذا الضغط يسمح الكشف عن التحتية النووية التي من الصعب نسبيا أو المستحيل حلها في نواة سليمة.
والقصور الواضح للكروموسوم نشر هو إمكانية أن الإجراء قد نشر جزئيا أو كليا يعطل بنية الفائدة. ومما يثير القلق بشكل خاص هو أن كروموسوم ملزمة بروتين معين قد تضيع نتيجة لهذا الإجراء الانتشار. هذا شو المضاعفات المحتملةأن تبقى دينار في الاعتبار عند تفسير البيانات. مثال واحد من البروتين التي تعتبر حساسة لإجراء نشر هو بيتا تويولين. تحت بعض الظروف، المغزل، التي تتألف أساسا من تويولين، يتم الاحتفاظ خلال نشر 3. التصور من المغزل في كثير من الأحيان من المفيد تنظيم نوى الفائدة. ومع ذلك، تصور تويولين يتطلب العلاج مع تثبيتي تركيز عال. يتم فقدان مغزل وفقا للشروط القياسية الموضحة أدناه. يوضح هذا المثال، عند تحليل توزيع بروتين لم يسبق توصيفها، من المهم أن تختلف تركيز تثبيتي لتحديد مدى حساسية البروتين هو هذا الاختلاف. على الرغم من القلق بشأن تأثير الظروف نشر على بنية الصبغي، فقد ثبت فائدة وقوة الأسلوب تنتشر في العديد من السياقات ولها فائدة واسعة في توصيف الإنقسامية، وخصوصا الخلايا الانتصافي 4-7.
TWس استخدمت أساليب نشر على نطاق واسع. أول هذه الطرق، التي وضعتها تسريحة وجيرو 8، ويتجنب استخدام المنظفات ويمكن أن تسفر عن منتشرة الاستعدادات التي يبدو أن لها نسبيا المحفوظة جيدا التشكل كروموسوم عندما الملون لDNA محددة صبغ دابي. ومع ذلك، وهذه الطريقة من الصعب نسبيا لاتقان وجودة انتشار نوى يختلف بشكل كبير، وعندما تتم مقارنة منطقة واحدة من الانزلاق إلى مناطق أخرى. هذه المشكلة يمكن أن يعقد النهج الكمي التي تنطوي على تصوير العديد من الأنوية غير محددة من شريحة واحدة لتجنب الحصول على البيانات التحيز. الكروموسوم الثاني نشر الطريقة، التي وضعتها LOIDL وكلاين 1، ينطوي على موازنة التثبيت بواسطة امتصاص العرق، مع تحلل وإزالة الضغط لونين التي يروج لها حل المنظفات. عندما أدائها على الوجه الصحيح، وهذا الأسلوب يعطي نتائج استنساخه جدا مع أقل التباين من منطقة إلى منطقة مقارنة لطريقة تسريحة وجيرو. ويركز هذا العرض على modifieنسخة يوميا من طريقة LOIDL وكلاين، بسبب موثوقيتها والبساطة.
كروموسوم نشر ليست معقدة أو تستغرق وقتا طويلا. ما يصل الى 100 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية في يوم واحد. وعلاوة على ذلك، قد يتم تخزين انتشار الاستعدادات في الثلاجة لسنوات قبل المناعية، وبالتالي مختبرات يمكن أن تتطور مستودعا للهوامش كروموسوم المجمدة التي يمكن استخدامها عندما تنشأ أسئلة البيولوجية الجديدة أو أصبح الكواشف تلطيخ الجديدة المتاحة.
يتم استخدام طريقة كروموسوم نشر الأكثر شيوعا في تركيبة مع المناعية وwidefield مضان المجهر، ولكن من الممكن أيضا لإعداد الشرائح لسوبر قرار ضوء أساليب المجهرية مثل استنزاف الانبعاث المستحث (STED) المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بعض الخطوات للبروتوكول تتطلب أدناه العمل في غطاء الدخان نظيفة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب طريقة المجهر تشريح الخميرة الرباعيات مجهزة هدفا بعد 10X العمل الطويلة لمراقبة spheroplasting. يجب تعيين المجهر يصل في غطاء محرك السيارة في وقت مبكر. إزالة الذراع micromanipulator وحامل لوحة من نطاق ووضع هذه العناصر في مكان آمن بعيدا عن منطقة العمل.
1. إعداد Spheroplasts
- تنمو الخميرة في ظل ظروف المطلوب. استخدام حوالي 2 × 10 8 خلايا لكل عينة، على سبيل المثال 4 مل من ثقافة في OD600 1.4 = 5 × 10 7 خلية / مل. على الرغم من معالجته فورا من عينات قد يكون من الأفضل في بعض الحالات، بالنسبة لمعظم التطبيقات، قسامات خلية يمكن تخزينها على الجليد لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل أن يتم معالجتها.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في أجهزة الطرد المركزي السريري في تحديد 5 (2345 دورة في الدقيقة / 857.5 x ج) لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. صب المتوسطة مع الحرص على عدم فقدان الخلايا من بيليه. بلطف resuspend الخلايا في 1 مل العازلة ZK ثم إضافة 40 ميكرولتر 1 M dithiothreitol (DTT). احتضان 2 دقيقة مع خلط لطيف. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2).
- الكريات resuspend في 1 مل العازلة ZK. إضافة 5 ميكرولتر من حل الطازجة من 100T zymolyase التي تم خلطها بشكل تام. احتضان لمدة 20-30 دقيقة في 30 ° C لإزالة جدار الخلية وإنتاج spheroplasts.
- مقايسة قطرات 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة المجهر لتحديد ما إذا كان spheroplasting كاملة. خلايا ينظر تحت المجهر تشريح دون ساترة. يجب أن تظهر خلايا منتفخة ومستديرة بدلا من مستطيل قليلا، وينبغي أن ليز التالية إضافة 20 ميكرولتر من الماء. إذا فشلت الخلايا لليز، والعودة العينة إلى 30 درجة مئوية، وإعادة فحص-كل 10 دقيقة حتى لوحظ المياه الناجم عن تحلل بسهولة. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2).
- و resuspend برفق ويغسل خلية بيليه طن 2.5 مل MES البارد / العازلة السوربيتول. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). و resuspend بلطف بيليه خلية في 300-400 MES الباردة ميكرولتر / العازلة السوربيتول. يمكن أن تبقى الخلايا على الجليد في هذه المرحلة لعدة ساعات.
2. كروموسوم نشر
ملاحظة: الواجهات الزجاجية التي تقوم عليها سيتم الشرائح أو بإحدى هاتين العقوبتين تنتشر الكروموزومات coverslips-يجب أن يكون مستعدا في وقت مبكر. يجب أن يغطس كل شريحة أو ساترة في الماء، ثم ETOH، ثم يترك ليجف، ومصقول مع ورقة العدسة. إذا كان سيتم نشر الكروموسومات coverslips على أنه ينبغي اضافته ساترة لشريحة بشريط لاصق أو الاسمنت والمطاط. ما لم يذكر غير ذلك، فإن بقية بروتوكول يصف نشر على أي شريحة أو ساترة
- باستخدام pipettor P20، الماصة 20 ميكرولتر من تعليق خلية على سطح شريحة نظيفة.
- باستخدام pipettor P200، إضافة 40 ميكرولتر من 3٪ PFA / محلول السكروز وتخلط بلطف solutioن من قبل "يحوم" الشريحة مع اليد حتى تختفي خطوط انعراجي. ضع الشريحة تحت المجهر والتأكد من أن الخلايا هي في التركيز. يجب أن يكون الحل PFA أعدت-الطازج في غطاء الدخان في يوم من الاستخدام.
ملاحظة: إذا لم يتم فحص البروتين من الاهتمام من خلال الأسلوب السابق، فإنه من المستحسن لإعداد الشرائح إضافية باستخدام الحلول التي تحتوي على 2 و 4٪ PFA لتحديد ما إذا كان الإبقاء على البروتين حساس للشروط التثبيت. يتم استخدام 4٪ PFA حل / السكروز في الحالات التي يكون من المرغوب فيه تصور ميكروتثبول تويولين المرتبطة بها. العيب من تركيز تثبيتي العالي هو أن الكروموسومات ستكون "underspread،" يميل 2٪ PFA أيضا أن تسفر الكروموسومات "underspread". - باستخدام pipettor P200، إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ Lipsol، دوامة كما كان من قبل لخلط حلول تماما بقدر الإمكان، وبدء الموقت. إذا Lipsol غير متوفرة، 80 ميكرولتر 1٪ NP40 أو 80 ميكرولتر درهم 2 O قد يكوناستبدال (انظر ممثل النتائج، الشكل 2).
- مشاهدة الخلايا بعناية وبلطف دوامة الشريحة كل 15 ثانية. عندما هي lysed حوالي 80٪ من الخلايا (اختفى) إيقاف الموقت، إزالة الشريحة مباشرة من المجهر، إضافة 80 ميكرولتر من PFA / محلول السكروز، ودوامة لخلط. تحلل ينبغي أن يحدث من ما بين 30 و 90 ثانية بعد بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت.
ملاحظة: إذا أظهرت عدة شرائح تحلل في نفس الوقت تقريبا، يمكن للمرء أن يغفل في نهاية المطاف المراقبة المجهرية للفترة المتبقية من الشرائح وببساطة توقيت بعناية الفترة ما بين إضافة lipsol وإضافة قسامة النهائية من تثبيتي. ومع ذلك، هذا الخفض القصير هو موثوق بها فقط عند إعداد عدة شرائح من نفس العينة. فمن الأفضل لمراقبة تحلل من كل عينة مجهريا عند إعداد الشرائح المختلفة من عينات أخذت في أوقات مختلفة أو من ثقافات مختلفة. - وضع الشريحة على سطح مستو نظيفة وتنتشر السائل عبر surfac unfrosted كامل(ه) من الشريحة باستخدام جانب نظيفة، يمكن التخلص منها الماصة المراعي التي عقدت تحت الغضروف المفصلي من "بركة" ولكن فوق سطح الشريحة نفسها، أي. لا "أشعل النار" على سطح الشريحة مع الماصة. لا إعادة استخدام الماصة على الشرائح المختلفة لتجنب تلوث العينات.
- ترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها في غطاء الدخان. والمكونات النووية غير قابلة للذوبان يستقر على سطح الشريحة وربط ذلك. للتجارب كبيرة، والتخطيط لاستخدام الفضاء للخطوة التجفيف هو المهم.
- جفت مرة واحدة، ويتم الحصول على أفضل النتائج من خلال التقدم إلى المرحلة المناعية في نفس اليوم. ومع ذلك، فإن الحل السكروز المجففة يضمن انتشار الصبغيات في "العسل" الذي يسمح بتجميد عينات: يمكن نقل الشرائح إلى مربع الشريحة البلاستيكية وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة سنة.
3. المناعية
- تراجع الشرائح في 0.2٪ صور فلو لمدة 30 ثانية. لإزالة العسل. الشرائح الهزيل علىميزة، مع حافة يستريح على منشفة ورقية، لإزالة بقايا صور فلو.
- تراجع الشرائح في TBS 1X لمدة 5 دقائق لغسل. إزالة السائل الزائد بالانحناء الشرائح على الحافة، ولكن لا تسمح لهم تجف.
- وضع الشرائح متجمد حتى الجانب، الماصة 300 ميكرولتر TBS / BSA على الشريحة عبر الجزء unfrosted من الشريحة.
- احتضان في غرفة رطبة في RT لمدة 15 دقيقة. (حاوية بلاستيكية كبيرة تصطف مع المياه المشبعة مناشف ورقية تحت لوحة معدنية أو بلاستيكية مربع الشريحة مثقب مع المناشف الورقية المشبعة).
- استنزاف الشرائح التي يستريح على حافة قصيرة من الشريحة على منشفة ورقية ويميل الشريحة ضد الدعم المناسب (مثل أنبوب اختبار رف). لا تسمح السطح ليجف.
- تطبيق على الفور 80 ميكرولتر من TBS / BSA العازلة التي تحتوي على التخفيف المناسب من الأجسام المضادة الأولية. إذا الأجسام المضادة يحد من استخدام 40 ميكرولتر و22 × 22 مم ساترة. لمصل الأرنب الخام، وهذا هو عادة بين 1/50 و 1/500 التخفيف.
ملاحظة:أداء المعايرة للتحضير الأجسام المضادة الجديدة. يتم اختيار إعداد معظم المخفف التي تعطي إشارة عالية فوق الخلفية. للسيطرة على مستوى تلوين الخلفية، ينبغي إعداد نواة من سلالة متحولة الحذف المناسب و / أو الشرائح المكررة وينبغي ملطخة المصل قبل المناعي. - وضع المصقول 22 × 50 مم ساترة على الشريحة تجنب الفقاعات. القيام بذلك عن طريق الضغط على ساترة بين الإبهام والسبابة على طول الحافة الطويلة في مواقع بالقرب من حافة واحدة قصيرة. عقد ساترة على زاوية 30 درجة بالنسبة إلى الشريحة، يتم إنزال أقصى حافة قصيرة من الأصابع حتى يستقر على الشريحة فقط داخل حافة "بركة" الأقرب إلى المنطقة متجمد من الشريحة. ثم خفض ببطء ساترة في حركة سلسة حتى الأصابع عقد لمسة الشريحة على مقاعد البدلاء، ثم يفرج عنه. لا تحاول ضبط الموقف من ساترة بمجرد أن يهبط.
ملاحظة: إذا تم إعداد ينتشر كروموسوم علىcoverslips ملحقة (وليس مباشرة على سطح شرائح)، وهذه عينة ساترة تظل الملصقة على الشريحة في جميع أنحاء تلطيخ والغسيل الخطوات. سيتم وضع ساترة إضافية على رأس ساترة عينة لتوزيعها بالتساوي على حل الأجسام المضادة خلال تلطيخ ومن ثم التخلص منها. - مكان الشرائح في غرفة رطبة مختومة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- عقد نقل حافة بلوري الشرائح إلى شريحة زجاجية تلطيخ الرف ويغرق في جرة تلطيخ التي تحتوي على TBS.
- تراجع بلطف الشريحة صعودا وهبوطا لإزالة ساترة. ليس محاولة لاستخدام الكثير من القوة للقيام بذلك. تغسل الشرائح 2X 10 دقيقة بواسطة غمر في TBS. إزالة الشرائح من الرف واستنزاف السوائل الزائدة عن طريق لمس حافة منشفة ورقية. لا تدع سطح جاف.
- العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة على الفور 80 ميكرولتر TBS / BSA تحتوي على 1/1000 تخفيف أضعاف تألقي الضد الثانوية مترافق (أو 40 ميكرولتر مع 22 × 22 مم ساترة). إعلاند ساترة كما كان من قبل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في غرفة رطبة في الظلام.
- إزالة coverslips كما كان من قبل، واستنزاف الشرائح، والسماح للسطح في الهواء الجاف ل1-2 ساعة في الظلام. الشرائح الهزيل على مناشف ورقية كما كان من قبل.
ملاحظة: إذا تم تنفيذ نشر على ساترة محمولة، فصل ساترة من الشريحة قبل التجفيف. ثم يتم تجفيفها Coverslips كما هو موضح الشرائح في الخطوة السابقة. - العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة حوالي 30 ميكرولتر من تصاعد المتوسط تحتوي على دابي (ثلاث قطرات 10 ميكرولتر) ومن ثم خفض بعناية ساترة. إذا كان ينتشر هي coverslips على، ضع قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة نظيفة وخفض ساترة، الجانب كروموسوم إلى أسفل، على الشريحة.
- لا تزال تحت ضوء مهزوما، الانتظار 2 دقيقة لساترة لتسوية وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. وضع الشرائح في مربع الشريحة شقة.
ملاحظة: للحصول على المجهر STED، جبل مع إطالة الذهب. استخدام 30 ميكرولتر من إطالة الذهبدون دابي والسماح لعلاج بين عشية وضحاها. ختم بطلاء الأظافر غير ضرورية. - عرض الشرائح التي widefield المجهر epifluorescence مع 40 أو الهدف 100X باستخدام فلتر مجموعة مناسبة للدابي على التركيز. اختياريا تخزين الشريحة في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة عدة أسابيع. لا تجمد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ظهور انتشار نوى يعتمد بشكل حاسم على التوازن بين تثبيت كروموسوم وإزالة الضغط. حتى عندما يتم متوازنة الكواشف بشكل صحيح، يمكن أن يحدث الاختلاف في درجة كروموسوم دي الضغط في مناطق مختلفة من نفس الشريحة و / أو بين الشرائح المختلفة. وبالتالي، ينبغي تقييم نوعية ينتشر في منطقة معينة من الانزلاق قبل أن يتم تفسير الصور.
آثار "overspreading" و "underspreading" يمكن توضيح باستخدام أجسام مضادة ضد بروتينات إعادة التركيب الانتصافي. في الشكل 1، نوى الانتصافي هي immunostained لاثنين من البروتينات حقيقية النواة الصرف حبلا Rad51 وDmc1 ومكافحة الملون لDNA مع دابي مزدوجة. وترد مثالين من انتشار الأمثل نوى في الشكل 1A. ويبين الشكل 1B مثال على نواة underspread وأمثلة الشكل 1C من نواتين تتغطى. ملاحظةأن بؤر أقل من Rad51 وDmc1 ويلاحظ في كل أنحاء وunderspread نوى مقارنة لنشر صحيح نوى. في حالة نوى underspread، بعض البؤر هي من التركيز لأن العينة ليست مسطحة بما فيه الكفاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسهم حاتمة الوصول إلى عدم الكشف عن كافة البؤر. وعلاوة على ذلك، فإن قطره أصغر من انتشار يمكن أن يحول دون قرار من الهياكل متباعدة عن كثب. في حالة نوى تشعبت، البروتين يمكن أن تضيع بسبب عدم كفاية التثبيت و / أو العلاج المنظفات المفرطة.
يمكن أن الاختلافات في الطريقة القياسية تجنب استخدام Lipsol. النسخة الأصلية من طريقة نشر صفها LOIDL وآخرون. يجعل من استخدام Lipsol، مختبر الأواني الزجاجية اللياقة المنظفات 1. على الرغم من أن يتم استخدام هذه المنظفات حاليا لكروموسوم ينتشر في العديد من المختبرات، الصيغة الأصلية لم تعد متوفرة تجاريا وتم المنتجات التي تباع حاليا تحت هذا الاسم إعادة صياغتها. Furthermore، الصيغة الأصلية لLipsol هي أيضا غير متوفرة (فرانز كلاين، اتصال شخصي). في محاولة للتغلب على هذه المشكلة، أجرينا التجارب التي استخدمت المتاحة تجاريا ومحددة كيميائيا NP40 المنظفات في مكان Lipsol. تم العثور على هذا التعديل للبروتوكول قياسي لتعطي نتائج مرضية للتجربة التي انتشرت كانت ملطخة نوى الانتصافي لRad51 وZip1، وهو مكون من المنطقة الوسطى من المشبكي الخيطي معقدة (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام، ليحل محل الحل Lipsol مع نفس الحجم من درهم 2 0 أسفرت أيضا نتائج مرضية (الشكل 2B). على الرغم من أن هذه النتائج تشير إلى أن طريقة انتشار المذكورة أعلاه يمكن أن تستخدم بنجاح دون Lipsol، فمن الممكن أن بعض النتائج المذكورة سابقا تعتمد على استخدام Lipsol ولن تكون قابلة للتكرار إذا تم استخدام NP40 أو H 2 0 في مكانها. فرد تعلم نشر ميل طريقةGHT اختيار معقول للبدء باستخدام NP40 و / أو H 2 O في مكان Lipsol. في حال أن الصعوبات التي واجهتها، يجوز للمحقق أن يطلبوا قسامة من Lipsol من المختبر أن حصل على مخزون من الكاشف قبل وقفها. كان Lipsol غير مكلفة والحد الأدنى للمبلغ واحد يمكن أن تأمر كان كافيا لتوليد الملايين من الشرائح.
طريقة نشر هو مناسب للاستخدام مع فائقة الدقة أساليب المجهر الضوئي. ويتكون المجمع المشبكي الخيطي اثنين محوري / العناصر الجانبية الخطية كل منها ينظم زوج من الصبغيات الشقيقة إلى مجموعة من المصفوفات حلقة، مع قاعدة كل حلقة متجهة إلى عنصر. الكروموسومات طور التثخن وsynapsed أزواج من العناصر الجانبية التي عقدت بالتوازي على مسافة 100 ميل بحري من البروتينات التي تشكل المنطقة الوسطى من مجمع المشبكي الخيطي. لا يمكن حل هذه العناصر الجانبية المقترنة بالرمز التقليدي widefield المجهر epifluorescence، ولكن يمكن حلها فائقة resoluطرق نشوئها. في الشكل 3، يظهر نواة طور التثخن التي اتسخت مع نفس الأجسام المضادة لبروتين Zip1، وتستخدم للتجربة في الشكل 2. كانت ملطخة العينة أيضا للبروتين Red1، وهو مكون من محوري / العناصر الجانبية. نتيجة تكشف أن الأجسام المضادة Zip1 يعترف المنطقة ملزم عنصر الوحشي Zip1، بدلا من حلزونية ألفا ممدود لف لفائف المجال الذي يكمن بين عنصر ملزم المناطق الجانبية. وبالتالي، فإن نمط تلطيخ لوحظ مع هذه الأجسام المضادة Zip1 يكشف عن مسارات متوازية من العناصر الجانبية المقترنة. توزيع Red1 بؤر العناصر على طول الجانبية متناثر نسبيا مقارنة Zip1 البؤر، ولكن يبين طريقة تلوين المزدوج الذي Red1 بؤر الكذب عادة بالقرب من مسارات خطية يحددها Zip1 البؤر. هذه النتائج تتفق مع الأعمال السابقة التي كانت تستخدم نفس الأسلوب نشر لإعداد عينات لتحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني. الهيكل الثلاثي للشركات المشبكي الخيطييتم الاحتفاظ ليكس أثناء إجراء الانتشار. تم إنشاء الصورة هو مبين في الشكل (3) من قبل STED المجهر 9.
الشكل 1: أمثلة من انتشار نوى نوى الانتصافي الملون لDmc1 (الأخضر)، Rad51 (الحمراء)، والحمض النووي (دابي والأزرق). شريط = 1 ميكرون. (A) 2 أمثلة لنشر الأمثل النوى. (B) مثال نواة underspread. (C) مثالان من نوى تتغطى. على سبيل المثال على اليسار هو نواة التي يتم تتغطى فقط الجزء العلوي.
الشكل 2: نوى الانتصافي أعدت دون استخدام Lipsol انتشار نوى الانتصافي من المراحل المشار إليها الملون لRad51 (الحمراء).Zip1 (الأخضر)، والحمض النووي (دابي والأزرق). لاحظ أن الضغط الصبغي الذي يحدث مع الخلايا الانتقال من طور الخيوط النحيلة لpachynema يتم الاحتفاظ بشكل كبير.
الشكل (3): تصور مجمع المشبكي الخيطي عبر STED المجهر نواة طور التثخن الملون لZip1 (الخضراء) وRed1 (الحمراء). تم معالجة البيانات باستخدام البرنامج المساعد DeconvolutionLab يماغيج 10 لتشغيل 100 تكرارات باستخدام نموذج ريتشاردسون-لوسي مع STED PSF قياسه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75x25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
