Biology

Поверхность Распространение и Иммуноокрашивание дрожжей хромосом

Published: August 9, 2015 doi: 10.3791/53081

Jennifer Grubb¹, M. Scott Brown^1,2, Douglas K. Bishop^1,2

¹Department of Radiation and Cellular Oncology, University of Chicago, ²Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Introduction

Многообещающий дрожжей Saccharomyces Cerevisiae предлагает множество преимуществ для изучения молекулярных механизмов биологических процессов, в том числе исследования белков, которые контролируют функцию хромосом. Хотя есть известные преимущества бутонизации дрожжей для генетических, молекулярных и биохимических исследований, цитологические исследования распределения белков в ядре клетки осложняется его небольшого размера. Типичный дрожжевой ядро имеет диаметр менее одного микрона, который находится всего приблизительно в 5 раз предел разрешения видимого света. Таким образом, объем информации о распределении ядерных белков, которые могут быть получены из обычных иммунным окрашиванием или с помощью флуоресцентного белка метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), ограничено. Полезный подход для характеристики субъядерного распределение белков поверхности хромосома распространения. Этот подход включает в себя удаление клеточной стенки, нарушая клетки и ядерные мембраны, аllowing нерастворимые содержимое ядра, чтобы оседают на поверхности предметного стекла микроскопа. Эти нерастворимые компоненты включают в себя ядерный матрикс и хромосомы. В дополнение к возможности удаления растворимых ядерных содержание, которое повышает способность обнаруживать хроматина связанных белков, хромосома распространения результатов метода в значительной декомпрессии хромосом, так что распространение ядра имеют диаметры около 3 до 5 мкм (для диплоидных ядер мейотических) и от 2 до 3 мкм для диплоидных ядер митотических. Это декомпрессии позволяет обнаруживать ядерной подструктуры, что относительно трудно или невозможно решить в интактных ядер.

Очевидным недостатком с хромосомой распространения вероятность того, что распространение процедура может частично или полностью нарушить структуру интерес. Особую озабоченность в том, что хромосома частности белком, могут быть потеряны в результате расширени процедуры. Этот потенциал осложнение ШоуLD иметь в виду, при интерпретации данных. Одним из примеров белка, который чувствителен к распространению процедуры бета-тубулина. При некоторых условиях, шпиндель, который состоит в основном из тубулина, сохраняется во время расширения ^3. Визуализация шпинделя часто бывает полезно организовать ядра интерес. Тем не менее, визуализации тубулина требует лечения с высокой концентрацией фиксатором; шпиндели теряются в стандартных условиях, описанных ниже. Этот пример иллюстрирует, что при анализе распределения ранее неохарактеризованной белка, важно, чтобы изменять концентрацию фиксатора, чтобы определить, насколько чувствительный белок с таким изменением. Несмотря на озабоченность по поводу воздействия расширяющих условий на структуру хромосом, полезность и способность метода расширения была продемонстрирована во многих контекстах и имеет широкий полезность в характеристике митотической и, особенно мейоза клетки ^4-7.

Общий весО способы расширения спектра широко используются. Первый из этих методов, разработанных Dresser и Жиру ^8, позволяет избежать использования моющего средства и может дать расширенные препараты, которые появляются, чтобы иметь относительно хорошо сохранившийся морфологии хромосом при окрашивании DAPI для красителя ДНК конкретного. Тем не менее, этот метод является довольно трудно усовершенствовать и качество распространенных ядер значительно изменяется, когда одна область слайда по сравнению с другими регионами. Эта проблема может осложнить количественные подходы, которые включают визуализации много невыделенных ядра от одного слайда, чтобы избежать предвзятости данных приобретения. Второй способ распространения хромосом, разработанная Loidl и Клейна ^1, включает в себя балансирование фиксацию параформальдегидом, с лизисом и хроматина декомпрессии продвигаемой растворе моющего средства. При правильном исполнении, этот метод дает очень воспроизводимые результаты с меньшим область-в-области изменения по сравнению с методом Dresser и Жиру. Эта презентация фокусируется на modified версия метода Loidl и Клейна, из-за его надежности и простоте.

Хромосома распространения не является сложным или времени; до 100 слайдов могут быть подготовлены для иммуноокрашивания в один день. Кроме того, распространение препараты могут быть сохранены в морозильнике в течение многих лет до иммунной, и, таким образом лаборатории могут разработать хранилище замороженных спредов хромосом, которые могут быть использованы, когда возникают новые биологические вопросы или новые окрашивания реагентов становятся доступными.

Способ распространения хромосом наиболее часто используется в комбинации с использованием иммунной и флуоресцентной микроскопии Widefield, но это также возможно, чтобы подготовить слайды для супер-разрешения световой микроскопии методами, такими как стимулируется обедненной выбросов (STED) микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые шаги протокола ниже, требуют работы в чистом вытяжного шкафа. Кроме того, способ требует дрожжи тетрад рассечение микроскопа, снабженного расстояние объектива 10X длительным рабочим контролировать сферопластов. Микроскоп должен быть установлен в капот впереди времени. Снимите Микроманипулятор руку и держатель пластин от объема и поместить эти предметы в безопасном месте, вдали от рабочей зоны.

1. Подготовка сферопластов

Растут дрожжи в желаемых условиях. Используйте около 2 х 10 ⁸ клеток для каждого образца, например 4 мл культуры в OD 600 = 1,4 х 10 5 ⁷ клеток / мл. Хотя непосредственная обработка образцов может быть предпочтительным в некоторых случаях, для большинства приложений, сотовые аликвоты можно хранить на льду в течение 8 часов перед обработкой.
Передача клеточной суспензии в 15 мл центрифужную пробирку и спина в клинической центрифуге при установке 5 (2345 оборотов в минуту / 857,5 XG) в течение 3 мин для осаждения клеток. Слейте заботясь среднего, чтобы не потерять клетки из осадка. Аккуратно ресуспендирования клеток в 1 мл буфера ZK, а затем добавить 40 мкл 1 М дитиотреитола (DTT). Выдержите 2 мин с нежным смешивания. Пелле клетки, как и раньше (см шаг 1,2).
Ресуспендируют гранулы в 1 мл буфера ZK. Добавьте 5 мкл свежеприготовленного раствора zymolyase 100T, который был тщательно перемешивают. Инкубируют в течение 20-30 мин при температуре 30 ° С для удаления клеточной стенки и производят сферопластов.
Анализе 10 мкл каплю суспензии клеток на предметном стекле микроскопа, чтобы определить, сферопластов завершена. Клетки смотрел под микроскопом рассечение без покровного стекла. Клетки должны появляться раздутой и круглая, а не слегка продолговатой и должны лизировать после добавления 20 мкл воды. Если клетки не лизируют, возвращают образец до 30 ° С и повторно анализа каждые 10 мин до тех пор, вода вызывает лизис не легко наблюдать. Пелле клетки, как и раньше (см шаг 1,2).
Аккуратно ресуспендирования и мыть осадок клеток Iп 2,5 мл холодной МЧС / буфер сорбит. Пелле клетки, как и раньше (см шаг 1,2). Аккуратно ресуспендирования осадок клеток в 300-400 мкл холодного буфера MES / сорбит. Клетки могут быть хранили на льду на этой стадии в течение нескольких часов.

2. Хромосома Распространение

ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянные поверхности, на которой хромосомы будет распространяться-либо слайды или покровные-должны быть готовы заранее. Каждый слайд или покровное должна быть погружена в воду, а затем этанола, а затем высушить, и полированный с объективом бумаги. Если хромосомы будет распространяться на покровных, покровное должны быть прикреплены к слайду с скотча или резиновым клеем. Если не указано иное, остальная часть будет описывать протокол распространяется на любом слайде или покровным

Использование P20 пипетки, пипетки 20 мкл клеточной суспензии на поверхность чистой слайда.
Использование P200 пипетки, добавьте 40 мкл 3% PFA / раствора сахарозы и осторожно смешать SOLUTIOн от "закрученной" слайд с рукой, пока теневые линии не исчезнут. Поместите слайд под микроскопом и подтвердить, что клетки находятся в фокусе. Решение PFA должно быть свежеприготовленным в вытяжном шкафу в день использования.
Примечание: Если интересующий белок не был рассмотрен ранее метода, желательно, чтобы подготовить дополнительные слайды с использованием растворов, содержащих 2 и 4% PFA, чтобы определить, удержание белка чувствителен к условий фиксации. 4% PFA / раствор сахарозы используется в тех случаях, когда желательно, чтобы визуализировать связанные тубулина микротрубочек. Недостатком более высокой концентрации закрепляющего, что хромосомы будет "underspread," 2% PFA и имеет тенденцию давать "underspread" хромосомы.
Использование P200 пипетки, добавьте 80 мкл 1% Lipsol, водоворот, как и раньше, чтобы смешать решения как можно полнее, запустить таймер. Если Lipsol не доступен, 80 мкл 1% NP40, или 80 мкл дН ₂ O может бытьзамещенных (см Представитель Результаты, рисунок 2).
Смотрите клетки тщательно и нежно вихревой слайде каждые 15 сек. Когда примерно 80% клеток были лизированы (исчезли) остановить таймер, немедленно удалить слайд из микроскопа, добавить 80 мкл PFA / раствора сахарозы, и водоворот перемешать. Лизис должно происходить от между 30 и 90 сек после запуска таймера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько слайдов показать лизис примерно в то же время, можно в конечном итоге опустить микроскопический контроль за оставшейся части слайдов и просто тщательно Время период между добавлением lipsol и того конечного аликвоты фиксатором. Тем не менее, этот короткий разрез единственным надежным при подготовке нескольких слайдов из того же образца. Лучше всего, чтобы контролировать лизис каждого образца под микроскопом при различных слайдов получают из образцов, взятых в разные моменты времени или из разных культур.
Поместите слайд на чистую ровную поверхность и распространять жидкость по всей unfrosted Surfacе слайд, используя сторону чистой одноразовой пипетки пастбищ, состоявшейся ниже мениска "лужу", но над поверхностью самого слайда, то есть. не "грабли" поверхность слайда с пипеткой. Не использовать пипетки на разных слайдах, чтобы избежать загрязнения образцов.
Оставить слайды высохнуть в течение ночи в вытяжном шкафу. Нерастворимые компоненты ядерных осядет на поверхности слайдов и привязать к нему. Для больших экспериментов, планировании использования космического пространства в стадии сушки важно.
После высыхания, оптимальные результаты получаются прогрессирует до стадии иммуноокрашивания в тот же день. Тем не менее, сушат раствора сахарозы встраивает распространение хромосомы в "мед", что позволяет замораживание образцов: горки могут быть переданы на пластиковой слайд коробки и хранили при -20 ° С в течение многих лет.

3. Иммуноокрашивание

Dip слайдов в 0,2% Photo-Flo в течение 30 сек. удалить мед. Lean скользит покрая, с кромки отдыхает на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки фото-Фло.
Dip слайдов в 1x TBS в течение 5 мин, чтобы вымыть. Удалить лишнюю жидкость, опираясь слайдов на краю, но не позволяйте им высохнуть.
Положите слайды матовое стороной вверх, пипетки 300 мкл TBS / БСА на слайде через unfrosted части слайда.
Инкубируют во влажной камере при комнатной температуре в течение 15 мин. (Большой пластиковый контейнер выложены водонасыщенных бумажных полотенец под перфорированной металлической пластины или пластика слайд коробки с насыщенными бумажных полотенец).
Слив слайды отдыха короткий край слайда на бумажное полотенце и опираясь слайд против соответствующей опоры (такие, как стойки пробирке). Не позволяйте поверхности высохнуть.
Сразу применить 80 мкл TBS / BSA буфера, содержащего соответствующий разбавление первичного антитела. Если антитело ограничения, использовать 40 мкл и покровное мм 22 х 22. Для сырой сыворотки кролика, это, как правило, между разведении 1/50 и 1/500.
ПРИМЕЧАНИЕ:Выполните титрование для новых препаратов антител. Наиболее разбавленный препарат, который дает высокий сигнал над фоном выбран. Для контроля уровня фонового окрашивания, ядра должны быть получены из соответствующего штамма мутанта с делецией и / или дублировать слайды должны быть окрашены с предварительно иммунной сыворотки.
Поставьте полированный 22 х 50 мм покровное на слайде, избегая пузырьков. Для этого, удерживая покровное между большим и указательным пальцем вдоль длинного края в положениях вблизи одного короткого края. Проведение покровное на 30 ° углом, чтобы скользить, а короткий край дальний от пальцев опускают до тех пор, пока опирается на слайде только внутри края "лужи" ближе всего к матовым области слайда. Затем медленно опустите покровное в плавным движением до пальцев, имеющих прикосновение слайд скамейке, а затем отпустите. Не пытайтесь регулировать положение покровного стекла, когда он приземлится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если спреды хромосомные были подготовлены наПРИКРЕПЛЕННОЙ покровные (а не непосредственно на поверхность слайдов), этот образец покровное будет оставаться прикрепленными к слайду всей окрашивания и стиральных шагов. Дополнительным покровное будет размещен на верхней части образца покровным чтобы равномерно распределить раствор антител во окрашивания и затем отбрасывают.
Место слайдов в запечатанном влажной камере и инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
Проведение матовое насыпного края слайды на стекле окрашивания стойки и погрузиться в окрашивания банку, содержащую TBS.
Осторожно опустите слайд вверх и вниз, чтобы удалить покровное. Старайтесь не использовать слишком много сил, чтобы сделать это. Вымойте слайды 2x 10 мин, погружая в TBS. Удалить слайды из стойки и слейте лишнюю жидкость, касаясь край бумажным полотенцем. Не позволяйте поверхность сухой.
Работая под приглушенный свет, сразу добавить 80 мкл TBS / БСА, содержащий 1/1000-кратное разбавление флуорохромом сопряженного вторичного антитела (или 40 мкл 22 х 22 мм покровным). Объявлениед покровное, как и раньше, и инкубируют при 4 ° С в течение 2 ч во влажной камере в темноте.
Удалить покровные, как и прежде, процедить слайды, и позволяют поверхности высохнуть в течение от 1 до 2 часов в темноте. Lean горки на бумажных полотенцах, как раньше.
Примечание: Если была выполнена распространяется на смонтированном покровное, отсоединить покровное из слайда перед сушкой. Покровные затем сушат, как описано для слайдов на предыдущем шаге.
Работая под приглушенный свет, добавить около 30 мкл монтажа среду, содержащую DAPI (три 10 капель мкл), а затем осторожно опустите покровное. Если спреды на покровных, место капельки монтажа среды на чистую слайда и опустите покровное, сторона хромосом вниз, на слайде.
Тем не менее в приглушенном свете, подождите 2 мин для покровного урегулировать и печать края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей. Поместите слайды в плоском поле слайда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для STED микроскопии, крепление с продлить Gold. Используйте 30 мкл продлить Золотобез DAPI и позволяют вылечить ночь. Уплотнение с лаком для ногтей является необходимым.
Просмотр слайдов по широкопольными эпифлуоресцентной микроскопии с 40 или 100X цель с помощью фильтра установить подходит для DAPI сосредоточиться. При желании сохранить слайд в темноте при 4 ° С в течение нескольких недель. Не замораживать.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Появление распространенных ядер критически зависит от баланса между фиксации хромосом и де-уплотнения. Даже тогда, когда реагенты образом сбалансированы, изменение степени хромосомной де-уплотнения может происходить в различных регионах же слайде и / или между различными слайдами. Таким образом, качество спредов в данной области слайда следует оценивать, прежде чем изображения интерпретируются.

Последствия "крыле" и "underspreading" можно проиллюстрировать с помощью антител против белков мейотических рекомбинации. На рисунке 1, мейотические ядра двойной иммуноокрашиванию для двух эукариотических прядь обмена белков Rad51 и DMC1 и встречных окрашенных на ДНК с DAPI. Два примера оптимально распространенных ядер приведены на рисунке 1А. 1В показывает пример underspread ядра и примеров 1, c двух населилась ядер. Заметкачто меньше очаги Rad51 и DMC1 наблюдаются в обоих более и underspread ядер по сравнению с должного распространения ядра. В случае underspread ядер, некоторые очаги в фокусе, поскольку образец не является достаточно плоским. Кроме того, эпитоп доступность может способствовать неспособность обнаружить все очаги. Кроме того, чем меньше диаметр распространения может исключить разрешение близко расположенных структур. В случае населилась ядер, белок может быть потеряна из-за недостаточной фиксации и / или избыточной обработки моющим средством.

Вариации стандартного метода может избежать использования Lipsol. Оригинальная версия распространяется методом, описанным Loidl др. делает использование Lipsol, в уместности лабораторной посуды моющего средства ^1. Хотя это не моющее средство в настоящее время используется для распространения хромосом во многих лабораториях, первоначальная формулировка уже не коммерчески доступны и продукт в настоящее время продается под этим именем был вновь сформулированы. Furthermore, оригинальная формула для Lipsol также не доступны (Франц Кляйн, личное общение). В попытке преодолеть эту проблему, мы провели эксперименты, в которых коммерчески доступны и химического состава моющего средства NP40 был использован вместо Lipsol; эта модификация стандартного протокола было установлено, дает удовлетворительные результаты для эксперимента, в котором распространилась мейоза ядра окрашивали для Rad51 и Zip1, компонента центральной части синаптонемного комплекса (рис 2А). Интересно, что замена раствора Lipsol с таким же объемом дН ₂ 0 также дали удовлетворительные результаты (Фигура 2В). Хотя эти результаты показывают, что распространение метод, описанный выше, может быть с успехом использована без Lipsol, вполне возможно, что некоторые описанные выше результаты зависят от использования Lipsol и не будет воспроизводимым, если NP40 или Н ₂ 0 используется в своем месте. Индивидуальное обучение для расширения спектра методов миGHT разумно выбрать, чтобы начать с помощью NP40 и / или H ₂ O в месте Lipsol. В случае, если возникают трудности, исследователь может потребовать аликвоту Lipsol из лаборатории, что, полученной запас реагента, прежде чем она была прекращена; Lipsol был недорогим и минимальное количество можно заказать было достаточно, чтобы генерировать миллионы слайдов.

Метод распространения подходит для использования с супер-разрешением методов световой микроскопии. Синаптонемный комплекс состоит из двух линейных аксиальных / боковых элементов, каждый из которых организует пару сестринских хроматид в набор массивов цикла, с основанием каждого цикла связанного с элементом. Пахитенных хромосомы synapsed парами боковых элементов, проводимых параллельно на расстоянии 100 нм от белков, которые образуют центральную часть синаптонемного комплекса. Эти парные боковые элементы не могут быть решены с помощью обычных Widefield эпифлуоресцентной микроскопии, но может быть решена путем супер-resoluметоды Тион. На рисунке 3, пахитены ядра показано, что окрашивали тем же антителом для Zip1 белка, используемого в эксперименте на фиг.2. Полученный образец также окрашивают в течение RED1 белка, входящего в состав осевых / боковых элементов. Результат показывает, что антитело распознает Zip1 боковой элемент связывающей области Zip1, а не альфа-винтовой удлиненный биспиральных домен, который находится между боковыми элементов связывающих областей. Таким образом, окрашивание картина наблюдается с этим Zip1 антитела показывает параллельные пути парных боковых элементов. Распределение RED1 очагов вдоль боковых элементов относительно редкими по сравнению с Zip1 очагов, но метод двойного окрашивания показывает, что Red1 очаги обычно располагаются вблизи линейных траекторий, определяемых Zip1 очагов. Эти данные согласуются с предыдущей работой, в которой тот же метод распространения использовался для получения образцов для анализа с помощью электронной микроскопии; Трехсторонняя структура синаптонемного компеЛекс сохраняется в течение распространения процедуры. Изображение, показанное на рисунке 3 был создан с помощью микроскопии STED ^9.

Фигура 1
Рисунок 1: Примеры распространенных ядер Мейотические ядер, окрашенных по DMC1 (зеленый), Rad51 (красный), и ДНК (DAPI, голубой).. Bar = 1 мкм. () 2 примеры оптимально распространяются ядер. (B), пример underspread ядра. (С) Два примера населилась ядер. Пример слева находится ядро, в котором только верхняя часть заселены.

Рисунок 2: Мейотические ядра, приготовленные без использования Lipsol Spread мейоза ядра из этапов указано окрашивали на Rad51 (красный),.Zip1 (зеленый), и ДНК (DAPI, голубой). Следует отметить, что уплотнение хромосом, которое происходит в клетках перехода от leptonema к pachynema в значительной степени сохранились.

Рисунок 3: Визуализация синаптонемного комплекса через STED микроскопии пахитены ядро окрашивали Zip1 (зеленый) и RED1 (красный).. Данные были обработаны с помощью плагина ImageJ DeconvolutionLab ¹⁰ для запуска 100 итераций с использованием модели Ричардсона Люси с мерным STED PSF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.