Biology

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

Published: August 9, 2015 doi: 10.3791/53081

Jennifer Grubb¹, M. Scott Brown^1,2, Douglas K. Bishop^1,2

¹Department of Radiation and Cellular Oncology, University of Chicago, ²Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Introduction

שמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae מציעים יתרונות רבים ללימודים של מנגנונים מולקולריים של תהליכים ביולוגיים, כוללים המחקר של חלבונים השולטים פונקצית כרומוזום. למרות שיש יתרונות ידועים של שמרי ניצנים למחקרים גנטיים, מולקולריים, וביוכימיים, מחקרי ציטולוגית של ההפצה של חלבונים בגרעין התא מסובך על ידי גודלו הקטן. יש שמרי הגרעין הטיפוסי בקוטר של פחות ממיקרון אחד, וזה רק על 5 פעמים גבול הרזולוציה של אור הנראה. לפיכך, כמות המידע על ההפצה של חלבונים גרעיניים שניתן להשיג מimmunostaining הקונבנציונלי או באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוגבלת. גישה שימושית לאפיון הפצת subnuclear של חלבונים היא משטח כרומוזום הפצה. גישה זו כרוכה בהסרת קיר התא, שיבוש תא וקרום גרעין, וllowing תוכן בלתי מסיס של הגרעין להתיישב על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. רכיבים מסיסים אלה כוללים את המטריצה הגרעינית וכרומוזומים. בנוסף מאפשר הסרת תוכן גרעיני מסיס, אשר משפרת את היכולת לזהות חלבונים מחויבים הכרומטין, כרומוזום הפצת תוצאות שיטה בלחץ משמעותי של כרומוזומים כך שיש לי גרעיני התפשטות קטרים של 3 עד הסביבות 5 מיקרומטר (לגרעיני meiotic דיפלואידי) ו 2 עד 3 מיקרומטר לגרעיני mitotic דיפלואידי. לחץ זה מאפשר זיהוי של מסד גרעיני שקשה יחסית או בלתי אפשרי לפתרון בגרעינים שלמים.

חסרון ברור לכרומוזום הפצה הוא האפשרות שהליך הפצה עשוי באופן חלקי או לחלוטין לשבש את המבנה של עניין. מדאיג במיוחד הוא שחלבון כרומוזום מחויב מסוים עלול ללכת לאיבוד כתוצאה מההליך מתפשט. שו סיבוך פוטנציאלי זהLD לזכור כאשר לפרש נתונים. דוגמא אחת של חלבון שהוא רגיש להליך הפצה היא בטא טובולין. בתנאים מסוימים, הציר, המורכב בעיקר מטובולין, נשמר במהלך הפצת ^3. ויזואליזציה של הציר היא לעתים קרובות שימושית לשלב גרעינים של עניין. עם זאת, הדמיה טובולין דורשת טיפול עם מקבע ריכוז גבוה; צירים הולכים לאיבוד בתנאים הסטנדרטי המתוארים להלן. דוגמא זו ממחישה כי, בעת ניתוח ההפצה של חלבון uncharacterized בעבר, חשוב לגוון את הריכוז של מקבע כדי לקבוע כיצד רגיש החלבון הוא וריאציה כזו. למרות הדאגה לגבי ההשפעה של תנאי הפצה במבנה הכרומוזומים, השירות וכוחה של שיטת הפצה הודגם בהקשרים רבים ויש לו שירות רחב באפיון של mitotic ו, במיוחד תאי meiotic ^4-7.

Two שיטות הפצה נעשתה שימוש נרחב. הראשון של שיטות אלה, שפותחו על ידי השידה וג'ירו ^8, ימנע את השימוש בחומרי הניקוי ויכול להניב הכנות התפשטות שנראה שיש לי מורפולוגיה כרומוזום יחסית השתמרה היטב כאשר מוכתם עבור DAPI צבע DNA הספציפי. עם זאת, שיטה זו היא קשה יחסית למושלם והאיכות של גרעיני ההתפשטות משתנה באופן דרמטי, כאשר אזור אחד של שקופית בהשוואה לאזורים אחרים. בעיה זו יכולה לסבך גישות כמותיות שכרוכות הדמיה רבות גרעינים שלא נבחרו משקופית אחת, כדי למנוע הטיה רכישת נתונים. כרומוזום השני הפצת שיטה, שפותח על ידי Loidl ^ו1 קליין, כרוך איזון קיבעון על ידי paraformaldehyde, עם תמוגה ולחץ הכרומטין מקודם על ידי תמיסת ניקוי. כאשר מבוצעים כהלכה, שיטה זו נותנת תוצאות מאוד לשחזור עם פחות וריאציה אזור לאזור בהשוואה לשיטת השידה וג'ירו. מצגת זו מתמקדת בmodifieגרסת ד של השיטה של Loidl וקליין, בגלל האמינות והפשטות שלה.

כרומוזום הפצה היא לא מסובכת או זמן רב; ניתן להכין עד 100 שקופיות עבור immunostaining ביום אחד. יתר על כן, הכנות ההתפשטות ניתן לאחסן במקפיא במשך שנים לפני immunostaining, ובכך מעבדות יכולות לפתח מאגר של ממרחי כרומוזום קפוא, שניתן להשתמש בי שאלות ביולוגיות חדשות להתעורר או חומרים כימיים צביעה חדשות הופכים לזמינים.

שיטת כרומוזום הפצה היא נפוצה ביותר בשילוב עם immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, אבל אפשר גם להכין שקופיות לשיטות אור ברזולוציה סופר מיקרוסקופיות כגון דלדול פליטה המאולץ מיקרוסקופיה (STED).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: חלק מהצעדים להלן דורשים הפרוטוקול עובדים במנדף נקי. בנוסף, השיטה דורשת מיקרוסקופ לנתיחה שמרי הטטרדה מצויד מטרת מרחק 10X עבודה ארוכה כדי לפקח spheroplasting. מיקרוסקופ יש להגדיר בשכונה לפני הזמן. הסר את זרוע micromanipulator ובעל צלחת מההיקף ולמקם את הפריטים האלה במקום בטוח הרחק מאזור העבודה.

1. הכנת Spheroplasts

לגדול בתנאי שמרים רצויים. השתמש על 2 x 10 ⁸ תאים עבור כל דגימה, למשל 4 מיליליטר של תרבות בOD600 1.4 = 5 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר. למרות עיבוד מיידי של דגימות עשוי להיות עדיף במקרים מסוימים, עבור מרבית היישומים, ניתן לאחסן aliquots הסלולרי בקרח לעד 8 שעות לפני העיבוד.
העבר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות וספין בצנטריפוגה קלינית בהגדרת 5 (2,345 סל"ד / 857.5 XG) במשך 3 דקות עד גלולה התאים. למזוג טיפול לקיחה הבינוני לא לאבד את התאים מגלולים. בעדינות resuspend התאים במאגר ZK מיליליטר 1 ולאחר מכן להוסיף 40 dithiothreitol μl M 1 (DTT). דגירה 2 דקות עם ערבוב עדין. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2).
כדורים גלולים במאגר ZK 1 מיליליטר. הוסף 5 μl של פתרון מוכן טרי של 100T zymolyase שכבר מעורב באופן יסודי. דגירה במשך 20-30 דקות על 30 מעלות צלזיוס להסיר את דופן התא ולייצר spheroplasts.
Assay אגל 10 μl של השעיה תא בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבוע אם spheroplasting הוא מלא. תאים שנצפו תחת מיקרוסקופ לנתיחה ללא coverslip. תאים אמורים להופיע נפוחים ועגולים ולא מעט מוארכים וצריכים lyse הבא תוספת של 20 μl של מים. אם תאים לא מצליחים lyse, להחזיר את המדגם ל -30 מעלות צלזיוס ומחדש assay כל 10 דקות עד תמוגה מים מושרה הוא ציין בקלות. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2).
בעדינות resuspend ולשטוף אני תא גלולהn 2.5 מיליליטר MES / חיץ סורביטול קר. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). בעדינות resuspend תא גלולה ב300-400 MES / חיץ סורביטול קר μl. יכולים להיות כל הזמן בתאים על קרח בשלב זה לכמה שעות.

2. כרומוזום הפצת

הערה: משטחי הזכוכית שעליו כרומוזומים ייפרסו-או שקופיות או coverslips-צריך להיות מוכנים מבעוד מועד. כל שקופית או coverslip צריכה להיות שקוע במים, ואז EtOH, אז להתייבש, ומלוטש עם נייר עדשה. אם הכרומוזומים יתפרסו על coverslips, coverslip צריך להיות מודבקים לשקופית עם סקוטש או מלט גומי. אלא אם נאמר אחרת, שאר הפרוטוקול יתארו מתפשטים משני שקופיות או coverslip

באמצעות pipettor P20, pipet 20 μl של השעיה תא על פני השטח של שקופית נקייה.
שימוש pipettor P200, להוסיף 40 μl של 3% פתרון PFA / סוכרוז ולערבב בעדינות solution על ידי "מתערבל" השקופיות עם היד עד קווי Schlieren ייעלמו. מניחים שקופיות תחת מיקרוסקופ ולאשר כי תאים הם בפוקוס. את פתרון PFA צריך להיות מוכן טרי-במנדף ביום שימוש.
הערה: אם החלבון של עניין לא נבדק על ידי השיטה בעבר, מומלץ להכין שקופיות נוספות באמצעות פתרונות המכילים 2 ו -4% PFA כדי לקבוע אם השמירה של החלבון רגישה לתנאי קיבעון. פתרון / סוכרוז 4% PFA משמש במקרים שבם רצוי לדמיין microtubules טובולין קשור. החסרון של הריכוז גבוה יותר הוא שמקבע את הכרומוזומים יהיו "underspread," 2% PFA גם נוטה להניב כרומוזומים "underspread".
שימוש pipettor P200, להוסיף 80 μl של 1% Lipsol, מערבולת כמו קודם לערבב פתרונות שלמים ככל האפשר, להתחיל טיימר. במידת Lipsol לא זמין, 80 μl 1% NP40 או 80 μl DH ₂ O יכולים להיותהוחלף (ראה נציגי תוצאות, איור 2).
צפה בתאים בזהירות ובעדינות מערבולת השקופית כל 15 שניות. כאשר כ -80% מהתאים lysed (נעלם) לעצור את שעון העצר, להסיר באופן מיידי את השקופית ממיקרוסקופ, להוסיף 80 μl של פתרון PFA / סוכרוז, ומערבולת לערבב. תמוגה צריכה להתרחש מבין 30 ל 90 שניות לאחר תחילת שעון העצר.
הערה: אם כמה שקופיות להראות תמוגה בערך באותו הזמן, אחד יכול סופו של דבר להשמיט ניטור מיקרוסקופי לשארית השקופיות ופשוט זמן תקופה שבין תוספת של lipsol ותוספת של aliquot הסופי של מקבע בזהירות. עם זאת, קיצור זה רק אמין בעת הכנת שקופיות מרובות מאותה הדגימה. עדיף לפקח תמוגה של כל דגימה מיקרוסקופית כאשר שקופיות שונות מוכנות מדגימות שנלקחו בזמנים שונים או מתרבויות שונות.
מניחים את השקף על משטח נקי ושטוח ולהפיץ את הנוזל על פני surfac unfrosted כלדואר של השקופית באמצעות הצד של pipet נקי, חד פעמי מרעה שנערך מתחת להמניסקוס של "השלולית" אבל מעל פני השטח של השקופית עצמה, כלומר. לא "לגרוף" את פני השטח של השקופיות עם pipet. אל תעשה שימוש חוזר pipet בשקופיות שונות, כדי למנוע זיהום של דגימות.
השאר את השקופיות לייבוש למשך הלילה במנדף. רכיבים גרעיניים מסיסים יישבו על פני השטח השקופיות ולהיקשר אליו. לניסויים גדולים, מתכנן את השימוש בחלל לצעד הייבוש חשוב.
ברגע שהתייבש, תוצאות אופטימליות מתקבלות על ידי התקדמות לשלב immunostaining באותו היום. עם זאת, פתרון סוכרוז המיובש מטביע כרומוזומים התפשטות ב" דבש "המאפשר הקפאה של דוגמאות: ניתן להעביר שקופיות לתיבת שקופיות פלסטיק ומאוחסנות ב -20 ° C במשך שנים.

3. Immunostaining

טובלים שקופיות בתמונה 0.2%-פלו למשך 30 שניות. כדי להסיר דבש. שקופיות להישען עלקצה, עם הקצה מונח על מגבת נייר, כדי להסיר תמונה-פלו שייר.
טובלים שקופיות ב1x TBS במשך 5 דקות לשטוף. הסר נוזל עודף על ידי נשען שקופיות על קצה, אבל לא נותן להם להתייבש.
הנח שקופיות חלבית צד עד, pipet 300 μl TBS / BSA לשקופית מעבר לחלק unfrosted של השקופית.
דגירה בתא לח על RT במשך 15 דקות. (מיכל פלסטיק גדול מרופד במגבות נייר מים רוויים בתיבת שקופיות לוחית מתכת או פלסטיק מחוררת עם מגבות נייר רוויות).
מסננים שקופיות על ידי מנוחה קצה קצר של השקופית על מגבת נייר ונשען השקופית נגד תמיכה מתאימה (כגון מדף מבחנה). אל תאפשר משטח לייבוש.
מייד להחיל 80 μl של חיץ TBS / BSA המכיל את הדילול המתאים של נוגדן ראשוני. אם נוגדן הגבלה, להשתמש 40 μl וcoverslip 22 מ"מ x 22. לסרום ארנבת גולמי, זה בדרך כלל בין דילול 1/50 ו1/500.
הערה:בצע titrations להכנות נוגדן חדשים. ההכנה לדלל ביותר שתשואות גבוהות אות מעל הרקע נבחרה. כדי לשלוט על הרמה של מכתים רקע, צריכים להיות מוכנים מזן המוטציה המחיקה המתאים ו / או שקופיות כפולות גרעינים צריכים להיות מוכתם בדם לפני חיסון.
מניחים coverslip 22 x 50 מ"מ מלוטש בשקופית הימנעות בועות. לעשות זאת על ידי החזקת coverslip בין האגודל והאצבע לאורך הקצה הארוך בעמדות ליד קצה אחד קצר. מחזיק coverslip בביחס זווית של 30 מעלות כדי להחליק, הרחוק ביותר מקצה קצר האצבעות הוא הוריד עד שהיא נחה בשקופית רק בתוך קצה "השלולית" הקרוב ביותר לאזור החלבית של השקופית. אז לאט לאט להוריד את coverslip בתנועה חלקה עד האצבעות מחזיקות את מגע שקופיות הספסל, ולאחר מכן שחרר. אל תנסה להתאים את המיקום של coverslip רגע שנוחת.
הערה: אם מרווחי כרומוזום הוכנו עלcoverslips המודבק (ולא ישירות על פני השטח של שקופיות), coverslip מדגם זה יישאר מודבקים לשקופית בכל שלבי הצביעה וכביסה. Coverslip נוסף יוצב על גבי coverslip המדגם להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה במהלך מכתים ולאחר מכן הושלך.
מגלשות מקום בתא לח אטום ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
מחזיק העברת הקצה החלבית השקופיות למדף צביעת שקופיות זכוכית ולצלול בצנצנת מכתים המכילה TBS.
בעדינות לטבול את השקופית למעלה ולמטה כדי להסיר את coverslip. נסה לא להשתמש בכוח רב מדי כדי לעשות את זה. שטוף את שקופיות 2x 10 דקות על ידי השריית בTBS. הסר שקופיות ממדף וניקוז נוזל עודף על ידי הנגיעה קצה למגבת נייר. אל תתנו יבש פני השטח.
עבודה תחת אור עמום, מייד להוסיף 80 μl TBS / BSA המכיל דילול פי 1/1000 של נוגדן fluorochrome מצומדות המשני (או 40 μl עם coverslip 22 x 22 מ"מ). מודעהcoverslip ד כמו קודם ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בתא הלח בחושך.
הסר coverslips כמו קודם, לנקז שקופיות, ולאפשר משטח לייבוש באוויר ל1-2 שעות בחושך. שקופיות להישען על מגבות נייר כמו קודם.
הערה: אם הפצה בוצע על coverslip רכוב, לנתק את coverslip מהשקופית לפני הייבוש. אז coverslips מיובש כפי שתואר עבור שקופיות בשלב הקודם.
עבודה תחת אור מאופק, להוסיף כ -30 μl של הרכבה בינונית מכיל DAPI (שלוש 10 טיפות μl) ולאחר מכן להוריד את coverslip בזהירות. אם המרווחים הם על coverslips, למקם את הטיפות של מדיום הרכבה בשקופית נקייה ולהפחית את coverslip, צד כרומוזום למטה, לשקופית.
עדיין באור עמום, לחכות 2 דקות לcoverslip להתיישב ולאטום קצוות של coverslip עם לק ברור. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות שטוחות.
הערה: למיקרוסקופיה STED, הר עם להאריך זהב. השתמש 30 μl של להאריך זהבללא DAPI ולאפשר לרפא לילה. איטום עם לק הוא מיותר.
צפה בשקופיות על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield עם 40 או אובייקטיבי 100X באמצעות מסנן להגדיר מתאים לDAPI להתמקד. לחלופין לאחסן את השקופית בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לא להקפיא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המראה של גרעיני התפשטות ביקורתי תלוי באיזון בין קיבעון כרומוזום ודה-דחיסה. גם כאשר ריאגנטים מאוזנת כראוי, וריאציה במידת כרומוזום דה-דחיסה יכולה להתרחש באזורים שונים של אותה השקופית ו / או בין שקופיות שונות. לפיכך, את האיכות של מרווחים באזור נתון של שקופית יש לבחון לפני תמונות מתפרשות.

ההשפעות של "פורש" ו- "underspreading" ניתן להדגים באמצעות נוגדנים נגד חלבוני רקומבינציה meiotic. באיור 1, גרעיני meiotic כפולים immunostained לשני חלבוני חילופי גדיל אוקריוטים Rad51 וDmc1 ודלפק מוכתמים עבור DNA עם DAPI. שתי דוגמאות של גרעינים להפיץ בצורה אופטימלית מוצגות באיור 1 א. איור 1 מציגה דוגמא של גרעין underspread ודוגמאות איור 1C של שני גרעינים פשטו בי. הערהשפחות מוקדי Rad51 וDmc1 הם נצפו בשני שוב וunderspread גרעינים לעומת להפיץ כראוי גרעינים. במקרה של גרעיני underspread, כמה מוקדים נמצאים מחוץ למוקד כי המדגם הוא לא מספיק שטוח. בנוסף, נגישות epitope עשויה לתרום לכישלון כדי לזהות את כל המוקדים. יתר על כן, בקוטר הקטן יותר של ההתפשטות יכול למנוע רזולוציה של מבנים צפופים. במקרה של גרעינים פשטו בי, חלבון עלול ללכת לאיבוד בגלל קיבעון מספיק ו / או טיפול חומר ניקוי מוגזם.

וריאציות של השיטה סטנדרטית יכולות להימנע מהשימוש בLipsol. הגרסה המקורית של שיטת הפצה שתוארה על ידי אל Loidl et. עושה שימוש בLipsol, חומר ניקוי זכוכית מעבדה תקינות ^1. למרות שחומר הניקוי הזה משמש כיום לכרומוזום מתפשט במעבדות רבות, הניסוח המקורי הוא כבר לא זמין באופן מסחרי והמוצר נמכר כיום תחת שם זה כבר ניסח מחדש. Furthermore, הנוסחה המקורית לLipsol היא גם לא זמינה (פרנץ קליין, תקשורת אישית). במאמץ להתגבר על בעיה זו, בצענו ניסויים שבי NP40 חומרי הניקוי זמין מסחרי והגדרה כימית היה בשימוש במקום של Lipsol; שינוי זה של הפרוטוקול הסטנדרטי נמצא לתת תוצאות משביעות רצון לניסוי שבו התפשט גרעיני meiotic היו מוכתמים עבור Rad51 וZip1, רכיב של האזור (איור 2 א) המורכבים synaptonemal המרכזי. מעניין לציין, החלפת פתרון Lipsol עם אותו הנפח של DH ₂ 0 גם הניב תוצאות משביעות רצון (איור 2). למרות שהממצאים אלה מצביעים על כך ששיטת הפצה שתוארה לעיל יכולה להיות מועסקות בהצלחה ללא Lipsol, ייתכן שהחלק מהתוצאות שתוארו קודם לכן תלויות בשימוש בLipsol ולא תהיינה לשחזור אם NP40 או H ₂ 0 משמש במקום שלה. פרט לומד את שיטת מיל מתפשטלהילחם לבחור סביר להתחיל באמצעות NP40 ו / או H ₂ O במקום של Lipsol. במקרה שהם נתקלו בקשיים, החוקר רשאי לבקש aliquot של Lipsol ממעבדה שהתקבלה מאגר של המגיב לפני שהופסק; Lipsol היה זול והסכום המינימאלי שאפשר להזמין היה מספיק כדי ליצור מיליונים שקופיות.

שיטת הפצה מתאימה לשימוש בשיטות מיקרוסקופיה האור ברזולוציה סופר. מורכב synaptonemal מורכב משני אלמנטים צירי / ליניארי לרוחב כל אחד מהם מארגנים זוג chromatids אחות לקבוצה של מערכי לולאה, עם הבסיס של כל לולאה קשורה לאלמנט. כרומוזומים Pachytene לי synapsed זוגות של אלמנטי רוחב שנערכו במקביל במרחק של 100 ננומטר על ידי חלבונים היוצרים את האזור של מתחם synaptonemal המרכזי. לא ניתן לפתור אלמנטי רוחב לזווג אלה על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield הקונבנציונלי, אך ניתן לפתור על ידי סופר-resoluשיטות tion. באיור 3, גרעין pachytene הוא הראה כי הוא מוכתם באותו הנוגדן לחלבון Zip1, המשמש לניסוי באיור 2. המדגם גם מוכתם לחלבון אדום 1 color, רכיב של אלמנטים לרוחב צירי /. התוצאה מגלה כי נוגדן Zip1 מכיר האזור מחייב אלמנט הרוחבי של Zip1, ולא סליל אלפא המוארך סליל מפותל תחום שבין אזורי אלמנט המחייב לרוחב. לפיכך, דפוס מכתים נצפה עם נוגדן Zip1 זה חושף את הנתיבים המקבילים של אלמנטי הרוחב לזווג. חלוקת מוקדי אדום 1 color לאורך אלמנטי רוחב היא דלילה יחסית בהשוואה למוקדי Zip1, אבל השיטה הכפולה מכתימה מראה כי אדום 1 color מוקדים בדרך כלל לשכב ליד הנתיבים ליניארי שהוגדרו על ידי מוקדי Zip1. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים שבו באותה שיטת הפצה שימשה להכנת דגימות לבדיקה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים; המבנה המשולש של comp synaptonemallex נשמר במהלך ההליך מתפשט. התמונה שמוצגת באיור 3 נוצרה על ידי STED מיקרוסקופיה ^9.

איור 1: דוגמאות לגרעיני התפשטות גרעיני meiotic המוכתמות לDmc1 (ירוק), Rad51 (אדום), וה- DNA (DAPI, כחול).. בר = 1 מיקרומטר. () 2 דוגמאות של גרעינים להפיץ בצורה אופטימלית. (ב) דוגמא של גרעין underspread. (ג) שתי דוגמאות של גרעינים פשטו בי. הדוגמא בצד השמאל היא גרעין שבו רק החלק העליון הוא פשט בי.

איור 2: גרעיני meiotic הוכנו ללא שימוש בLipsol מורחים גרעיני meiotic מהשלבים הצביעו מוכתמים לRad51 (אדום),.Zip1 (ירוק), ו- DNA (DAPI, כחול). שים לב שדחיסת כרומוזום המתרחש בתאי מעבר מleptonema לpachynema היא במידה רבה נשמרה.

איור 3: ויזואליזציה של מתחם synaptonemal באמצעות מיקרוסקופיה STED גרעין pachytene המוכתם לZip1 (ירוק) ואדום 1 color (אדום).. הנתונים עובדו באמצעות תוסף DeconvolutionLab ImageJ ¹⁰ לרוץ 100 חזרות תוך שימוש במודל ריצ'רדסון-לוסי עם כוחות הביטחון הפלסטיניים STED מדוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.