Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

Introduction

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l'étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu'il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d'un micron, ce qui est seulement d'environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d'informations à propos de la distribution des protéines nucléaires qui peuvent être obtenus à partir de immunocoloration classique ou en utilisant les mots-clés de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP), est limitée. Une approche utile pour caractériser la répartition des protéines est subnucléaire surface de chromosome se propager. Cette approche consiste à enlever la paroi cellulaire, perturbant les membranes cellulaires et nucléaires, et unllowing le contenu insolubles du noyau de se déposer sur la surface d'une lame de microscope. Ces composants insolubles comprennent la matrice nucléaire et les chromosomes. En plus de permettre l'enlèvement des matières nucléaires solubles, ce qui améliore la capacité de détecter les protéines liées de la chromatine, le chromosome d'étalement méthode conduit à une décompression importante des chromosomes tels que les noyaux de propagation ont des diamètres de l'ordre de 3 à 5 um (pour les noyaux méiotiques diploïdes) et 2 à 3 um pour les noyaux mitotiques diploïdes. Cette décompression permet la détection de sous-structure nucléaire qui est relativement difficile, voire impossible à résoudre dans les noyaux intacts.

Un inconvénient évident de chromosome d'étalement est la possibilité que la procédure d'étalement peut partiellement ou complètement perturber la structure d'intérêt. Il est particulièrement préoccupant que un chromosome lié protéine particulière pourrait être perdu à la suite de la procédure se propager. Cette shou de complication potentielleld être gardé à l'esprit lors de l'interprétation des données. Un exemple d'une protéine qui est sensible à la procédure d'étalement est la bêta-tubuline. Dans certaines conditions, la broche, qui est constitué principalement de la tubuline, est conservée lors de l'épandage ^3. Visualisation de la broche est souvent utile de mettre en scène des noyaux d'intérêt. Cependant, la visualisation de la tubuline nécessite un traitement avec un fixateur haute concentration; les broches sont perdus dans les conditions standards décrites ci-dessous. Cet exemple illustre le fait que, lors de l'analyse de la répartition d'une protéine non caractérisée précédemment, il est important de faire varier la concentration de fixateur afin de déterminer la sensibilité de la protéine est d'une telle variation. En dépit de l'inquiétude quant à l'impact des conditions d'épandage sur la structure des chromosomes, l'utilité et la puissance de la méthode de propagation ont été mis en évidence dans de nombreux contextes et a une large utilité dans la caractérisation des mitotique et, en particulier les cellules méiotiques ^4-7.

Two méthodes d'épandage ont été largement utilisés. La première de ces méthodes, développées par Dresser et Giroux ^8, évite l'utilisation de détergent et peut produire des préparations propagation qui semblent avoir relativement bien conservé la morphologie des chromosomes lors teinté pour le colorant DAPI spécifique d'ADN. Cependant, ce procédé est relativement difficile de mettre au point et à la qualité des noyaux de propagation varie considérablement, quand une zone d'une diapositive est comparée à d'autres régions. Ce problème peut compliquer approches quantitatives qui impliquent l'imagerie de nombreux noyaux non sélectionnés d'une diapositive à éviter que des données biais d'acquisition. La deuxième méthode d'étalement chromosome, développé par Klein et Loidl ^1, implique la fixation d'équilibrage par le paraformaldéhyde, avec lyse et la décompression de la chromatine promu par une solution de détergent. Lorsqu'il est correctement effectuée, cette méthode donne des résultats très reproductibles avec moins de variation de région à région par rapport à la méthode Dresser et Giroux. Cette présentation se concentre sur un modifiela version d de la méthode de Loidl et Klein, en raison de sa fiabilité et sa simplicité.

Chromosome propagation est pas compliqué ou de temps; jusqu'à 100 diapositives peuvent être préparés par immunocoloration en une seule journée. En outre, les préparations de propagation peuvent être stockés dans le congélateur pendant des années avant immunocoloration, et donc les laboratoires peuvent développer un référentiel des étalements de chromosomes congelés qui peut être utilisé lorsque de nouvelles questions se posent ou biologiques nouveaux réactifs de coloration deviennent disponibles.

Le procédé d'étalement de chromosomes est le plus couramment utilisé en combinaison avec une immunocoloration et la microscopie à fluorescence à grand champ, mais il est également possible de préparer des lames pour les méthodes microscopiques super-résolution légers tels que l'épuisement de l'émission stimulée (STED) microscopie.

Protocol

NOTE: Certaines étapes du protocole ci-dessous ont besoin de travailler dans une hotte propre. En outre, la méthode nécessite une dissection microscope levure tétrade équipé d'un objectif à distance 10X long travail chargé de suivre sphéroplastes. Le microscope devrait être mis en place dans la hotte à l'avance. Retirez le bras de micromanipulateur et support de plaque de la portée et de placer ces éléments dans un endroit sûr, loin de la zone de travail.

1. Préparation des sphéroplastes

1. Cultiver la levure dans des conditions souhaitées. Utilisez environ 2 x 10 ⁸ cellules pour chaque échantillon, par exemple 4 ml d'une culture à DO600 = 1,4 x 10 5 ⁷ cellules / ml. Bien que le traitement immédiat d'échantillons peut être préférable dans certains cas, pour la plupart des applications, des aliquotes de cellules peuvent être stockés sur de la glace pendant jusqu'à 8 heures avant d'être traité.
2. Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse et de spin dans une centrifugeuse clinique à mettre en 5 (2345 tr / 857,5 x g) pendant 3 min pour sédimenter les cellules. Décanter la prise moyenne soin de ne pas perdre des cellules du culot. Resuspendre doucement les cellules dans un tampon de ZK 1 ml, puis ajouter 40 pi 1 M dithiothréitol (DTT). Incuber 2 min en mélangeant doucement. Cellules à granules comme avant (voir l'étape 1.2).
3. granulés de remettre en suspension dans un tampon de ZK 1 ml. Ajouter 5 ul d'une solution fraîchement préparée de zymolyase 100T qui a été bien mélangé. Incuber pendant 20-30 min à 30 ° C pour éliminer la paroi cellulaire et produire des sphéroplastes.
4. Doser une goutte de 10 pi de suspension de cellules sur une lame de microscope pour déterminer si sphéroplastes est terminée. Cellules vues sous le microscope de dissection sans une lamelle. Les cellules doivent apparaître pléthorique et rond plutôt que légèrement oblongue et devraient lyser après l'addition de 20 pi d'eau. Si les cellules ne parviennent pas à lyser, retourner l'échantillon à 30 ° C et re-test toutes les 10 min jusqu'à ce que l'eau induite par la lyse est facilement observé. Cellules à granules comme avant (voir l'étape 1.2).
5. Resuspendre doucement et laver culot cellulaire in 2,5 ml MES / tampon de sorbitol froid. Cellules à granules comme avant (voir l'étape 1.2). Resuspendre doucement culot cellulaire dans 300-400 MES / tampon de sorbitol ul froid. Les cellules peuvent être conservés dans la glace à ce stade pendant plusieurs heures.

2. Chromosome épandage

REMARQUE: Les surfaces de verre sur laquelle les chromosomes seront répartis soit-diapositives ou lamelles couvre-devrait être préparée à l'avance. Chaque diapositive ou lamelle devraient être immergés dans l'eau, puis EtOH, puis on le laisse sécher, et poli avec du papier de verre. Si chromosomes seront répartis sur des lamelles, la lamelle doit être apposée sur une diapositive avec du scotch ou du ciment en caoutchouc. Sauf mention contraire, le reste du protocole décrira propagation soit sur une diapositive ou lamelle

1. Aide d'une pipette P20, pipette 20 ul de suspension cellulaire sur la surface d'une lame propre.
2. Aide d'une pipette P200, ajouter 40 pi de la PFA / solution de saccharose à 3% et mélanger délicatement la solution par "tourbillonnant" la lame avec la main jusqu'à ce que les lignes disparaissent Schlieren. Placez glisser sous microscope et confirment que les cellules sont en discussion. La solution PFA devrait être fraîchement préparé dans la hotte sur le jour d'utilisation.
   REMARQUE: si la protéine d'intérêt n'a pas été examiné par la méthode précédemment, il est souhaitable de préparer des diapositives supplémentaires à l'aide de solutions contenant 2 et 4% de PFA afin de déterminer si la rétention de la protéine est sensible aux conditions de fixation. Une solution à 4% PFA / saccharose est utilisé dans les cas où il est souhaitable de visualiser les microtubules de tubuline associés. L'inconvénient de la concentration ultérieure fixateur est que les chromosomes seront "underspread," 2% de PFA a également tendance à donner chromosomes "underspread".
3. Aide d'une pipette P200, ajouter 80 pi de 1% Lipsol, tourbillonner comme avant de mélanger des solutions aussi complètement que possible, commencer une minuterie. Si Lipsol ne sont pas disponibles, 80 ul de 1% de NP40 ou 80 ul dH ₂ O peuvent êtresubstitué (voir résultats représentatifs, Figure 2).
4. Regardez les cellules soigneusement et agiter doucement la lame toutes les 15 secondes. Lorsque environ 80% des cellules ont lysées (disparu) arrêter la minuterie, retirer immédiatement la lame du microscope, ajouter 80 pi de PFA / solution de saccharose, et agiter pour mélanger. Lysis devrait se produire à partir de entre 30 et 90 secondes après le démarrage de la minuterie.
   NOTE: Si plusieurs diapositives montrent lyse à peu près le même temps, on peut éventuellement omettre surveillance microscopique pour le reste des diapositives et simplement du temps soigneusement la période entre l'addition de lipsol et l'ajout de l'aliquote finale de fixateur. Cependant, ce raccourci est fiable que lors de la préparation de plusieurs diapositives à partir du même échantillon. Il est préférable de contrôler la lyse de chaque échantillon au microscope lorsque différentes lames sont préparés à partir d'échantillons prélevés à des moments différents ou de différentes cultures.
5. Placez la lame sur une surface plane et propre et répandre le liquide sur toute la surfac non glacése de la diapositive à l'aide du côté d'un propre, des pâturages pipette jetable est tenue au-dessous de la surface du bain de la "flaque", mais au-dessus de la surface de la glissière elle-même, à savoir. ne pas "ratisser" la surface de la lame avec la pipette. Ne pas réutiliser pipette sur différentes diapositives pour éviter la contamination des échantillons.
6. Laisser les lames sécher pendant la nuit dans la hotte. Composants nucléaires insolubles se déposent sur la surface de glissement et de se lier à lui. Pour les grandes expériences, la planification de l'utilisation de l'espace pour l'étape de séchage est important.
7. Une fois séchées, des résultats optimaux sont obtenus en progressant à l'étape de immunocoloration le même jour. Cependant, la solution de saccharose séché incorpore les chromosomes d'étalement dans un "miel" qui permet la congélation des échantillons: diapositives peuvent être transférées à une boîte de glissement en matière plastique et stockées à -20 ° C pendant des années.

3. Immunocoloration

1. Tremper les lames à 0,2% Photo-Flo pour 30 sec. pour enlever le miel. Diapositives sur Leanun bord, avec le bord reposant sur une serviette en papier, pour supprimer résiduelle Photo-Flo.
2. Tremper les lames en 1x TBS pendant 5 minutes pour se laver. Retirer l'excès de liquide en se penchant diapositives sur un bord, mais ne les laissez pas sécher.
3. Lay diapositives givrées vers le haut, pipette 300 ul TBS / BSA sur la lame à travers la partie non glacés de la diapositive.
4. Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant 15 min. (Récipient en plastique grande avec des serviettes en papier de l'eau saturée sous une boîte de glissement de plaque de métal ou de plastique perforé avec des serviettes en papier saturées).
5. Égoutter diapositives en se reposant un bord court de la lame sur une serviette en papier et appuyé la lame contre un support approprié (comme un porte-tube à essai). Ne pas laisser sécher la surface.
6. Appliquer immédiatement 80 pi de tampon TBS / BSA contenant la dilution appropriée de l'anticorps primaire. Si l'anticorps est de limiter, utiliser 40 pi et une lamelle mm 22 x 22. Pour sérum de lapin brut, cela est généralement entre une dilution 1/50 et 1/500.
   NOTE:Effectuer des titrages pour les nouvelles préparations d'anticorps. La préparation la plus diluée que des rendements élevés signal au-dessus de fond est choisie. Pour contrôler le niveau de la coloration de fond, les noyaux doivent être préparés à partir de la souche mutante de suppression approprié et / ou reproduire des diapositives doivent être colorés avec du sérum pré-immun.
7. Placez un poli 22 x 50 mm lamelle sur la lame en évitant les bulles. Pour ce faire, en tenant la lamelle entre le pouce et l'index sur le bord long à des positions proches d'un bord court. Tenir la lamelle à un angle de 30 ° par rapport à glisser, le court le plus éloigné du bord des doigts est abaissée jusqu'à ce qu'il repose sur la diapositive juste à l'intérieur du bord de la "flaque" plus proche de la région dépoli de la lame. Ensuite, abaissez lentement la lamelle dans un mouvement lisse jusqu'à ce que les doigts qui tiennent la lame touche le banc, puis relâchez. Ne pas tenter de régler la position de la lamelle une fois qu'il atterrit.
   NOTE: Si des étalements de chromosomes ont été préparés surapposés lamelles (plutôt que directement sur la surface des lames), cette lamelle échantillon restera fixée à la glissière au cours des étapes de lavage et de coloration. Une lamelle supplémentaire sera placé sur le dessus de l'échantillon lamelle afin de répartir uniformément la solution d'anticorps pendant la coloration, puis jetés.
8. Placer les lames dans une chambre humide scellé et incuber une nuit à 4 ° C.
9. Tenir le transfert de bord dépoli les diapositives à un support de coloration de lame de verre et plonger dans un bocal contenant de coloration SCT.
10. Plonger doucement la lame de haut en bas pour enlever la lamelle. Essayez de ne pas utiliser trop de force pour ce faire. Laver les lames 2x 10 min en immergeant dans du TBS. Sortir les lames de rack et drainer l'excès de liquide en touchant bord à serviette en papier. Ne pas laisser sécher la surface.
11. Travaillant sous une lumière tamisée, ajouter immédiatement 80 pi TBS / BSA contenant un 1 / 1.000 dilution d'anticorps secondaire conjugué fluorochrome (ou 40 pi avec un 22 x 22 mm lamelle). Annonced lamelle comme avant et incuber à 4 ° C pendant 2 heures dans la chambre humide dans l'obscurité.
12. Retirer lamelles comme avant, les égoutter diapositives, et permettre à la surface sécher à l'air de 1 à 2 h dans l'obscurité. Lean diapositives sur des serviettes en papier comme avant.
    NOTE: Si la diffusion a été effectuée sur une lamelle montée, détachez la lamelle de la lame avant de sécher. Lamelles sont ensuite séchées de la manière décrite pour les diapositives dans l'étape précédente.
13. Travaillant sous lumière tamisée, ajouter environ 30 pi de milieu contenant DAPI (trois 10 Les gouttelettes pi) de montage, puis abaissez délicatement une lamelle. Si les écarts sont sur des lamelles, placer les gouttelettes de milieu de montage sur une lame propre et abaisser la lamelle, côté chromosome bas, sur la diapositive.
14. Toujours sous lumière tamisée, attendre 2 min pour lamelle de régler et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placez les diapositives dans une boîte de tiroir plat.
    NOTE: Pour la microscopie STED, monter avec ProLong Or. Utilisez 30 pi de ProLong Orsans DAPI et laisser sécher durant la nuit. Étanchéité avec le vernis à ongles est inutile.
15. Voir les diapositives par microscopie à épifluorescence grand champ avec un 40 ou un objectif 100X en utilisant un filtre approprié pour définir DAPI se concentrer. Éventuellement stocker la lame dans l'obscurité à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Ne pas congeler.

Representative Results

L'apparition de germes de propagation dépend de façon critique de l'équilibre entre la fixation du chromosome et de compactage. Même lorsque les réactifs sont correctement équilibrées, la variation dans le degré de compactage de chromosome peut se produire dans différentes régions de la même lame et / ou entre les différentes lames. Ainsi, la qualité des spreads dans une région donnée d'une diapositive devrait être évaluée avant que les images sont interprétées.

Les effets de ", étalée" et "underspreading" peuvent être illustrés en utilisant des anticorps contre les protéines de recombinaison méiotique. Dans la figure 1, les noyaux méiotiques sont à double immunocolorées pour les deux protéines eucaryotes de change brin Rad51 et DMC1 et contre-colorées avec du DAPI pour l'ADN. Deux exemples de noyaux de manière optimale répartis sont présentés dans la figure 1A. Figure 1B montre un exemple d'un noyau underspread et des exemples figure 1C de deux noyaux disséminée. Noteque moins de foyers de Rad51 et DMC1 sont observées dans les deux plus et underspread noyaux par rapport à propager correctement noyaux. Dans le cas des noyaux underspread, certains foyers sont floues parce que l'échantillon est pas suffisamment plat. De plus, l'accessibilité epitope peut contribuer à l'incapacité de détecter tous les foyers. En outre, le plus petit diamètre de la propagation peut empêcher la résolution de structures rapprochées. Dans le cas des noyaux qui peupla, protéine peut être perdu à cause de la fixation insuffisante et / ou le traitement de détergent excessive.

Variations de la méthode standard peuvent éviter l'utilisation de Lipsol. La version originale de la méthode décrite par étalement Loidl et al. fait usage de Lipsol, un laboratoire de bienséance verrerie détergent ^1. Bien que ce détergent est actuellement utilisé pour le chromosome d'étalement dans de nombreux laboratoires, la formulation d'origine est plus disponible dans le commerce et le produit actuellement commercialisé sous ce nom a été reformulé. Far ailleurs, la formule originale pour Lipsol est également pas disponible (Franz Klein, communication personnelle). Dans un effort pour remédier à ce problème, nous avons réalisé des expériences dans lesquelles le détergent NP40 disponible dans le commerce et de constitution chimique définie a été utilisé à la place de Lipsol; cette modification du protocole standard a été trouvé pour obtenir des résultats satisfaisants pour une expérience dans laquelle se propagent les noyaux méiotiques ont été colorées pour Rad51 et Zip1, un composant de la région centrale de la synaptonémal complexe (figure 2A). Fait intéressant, le remplacement de la solution Lipsol avec le même volume de dH ₂ 0 également donné des résultats satisfaisants (figure 2B). Bien que ces résultats indiquent que la méthode d'étalement décrit ci-dessus peut être utilisé avec succès sans Lipsol, il est possible que certains résultats décrits précédemment dépendent de l'utilisation de Lipsol et ne seront reproductibles que si NP40 ou H ₂ 0 est utilisé à sa place. Un individu apprendre la méthode d'épandage might choisir raisonnablement commencer par utiliser NP40 et / ou H ₂ O à la place de Lipsol. Dans le cas où des difficultés sont rencontrées, l'enquêteur peut demander à une aliquote de Lipsol d'un laboratoire qui a obtenu un stock de réactif avant qu'il a été arrêté; Lipsol était bon marché et le montant minimum on pouvait commander était suffisante pour générer des millions de diapositives.

Procédé d'étalement est adapté à une utilisation avec des procédés de microscopie de lumière super-résolution. Le complexe synaptonémal se compose de deux éléments latéraux linéaires axiales / chacun qui organise une paire de chromatides sœurs dans un ensemble de tableaux de boucle, avec la base de chaque boucle lié à un élément. Pachytène chromosomes ont synapsed paires d'éléments latéraux tenues en parallèle à une distance de 100 nm par les protéines qui forment la zone centrale du complexe synaptonémal. Ces éléments latéraux appariés ne peuvent être résolus par microscopie à champ large à épifluorescence classique, mais peuvent être résolus par super-resolutionméthodes de tion. Sur la figure 3, un noyau pachytene est représenté qui est souillé avec le même anticorps pour la protéine Zip1, utilisé pour l'expérience de la figure 2. L'échantillon a été également colorées pour les protéines Red1, un composant d'éléments latéraux axiaux /. Le résultat révèle que l'anticorps reconnaît Zip1 la région de liaison de l'élément latéral de Zip1, plutôt que l'alpha-hélicoïdal allongé enroulé bobine domaine qui se trouve entre les régions de liaison à l'élément latéral. Ainsi, le motif de coloration observé avec cet anticorps Zip1 révèle les voies parallèles des éléments latéraux appariés. La distribution des foyers Red1 le long des éléments latéraux est relativement peu par rapport à Zip1 foyers, mais la méthode de coloration à double Red1 montre que les foyers se situent en général à proximité des trajectoires linéaires définies par Zip1 foyers. Ces résultats sont en accord avec des travaux antérieurs, dans lequel le même procédé d'étalement a été utilisé pour préparer des échantillons pour l'analyse par microscopie électronique; la structure tripartite de l'échantillon synaptonémallex est préservé lors de la procédure d'étalement. L'image représentée sur la figure 3 a été généré par microscopie STED ^9.

Figure 1: Exemples de noyaux de propagation noyaux méiotiques colorées pour DMC1 (vert), Rad51 (rouge), et de l'ADN (DAPI, bleu).. Bar = 1 um. (A) 2 exemples de noyaux de manière optimale répartis. (B) Un exemple d'un noyau underspread. (C) Deux exemples de noyaux disséminée. L'exemple sur la gauche est un noyau dans lequel seule la partie supérieure est couvrit.

Figure 2: noyaux méiotiques préparés sans utilisation de Lipsol Diffuser noyaux méiotiques des étapes indiquées colorées pour Rad51 (rouge),.Zip1 (vert), et de l'ADN (DAPI, bleu). Notez que le compactage des chromosomes qui se produit en tant que cellules de transition de Leptonema pachytène est largement préservée.

Figure 3: Visualisation du complexe synaptonémal par microscopie STED Un noyau pachytene colorées pour Zip1 (vert) et Red1 (rouge).. Les données ont été traitées en utilisant le plugin DeconvolutionLab ImageJ ¹⁰ à courir 100 itérations en utilisant le modèle Richardson-Lucy avec un PSF STED mesurée.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.