Ytspridning och immunfärgning av Jäst Kromosomer

Introduction

Den spirande jäst Saccharomyces cerevisiae erbjuder många fördelar för studier av molekylära mekanismer av biologiska processer, inklusive studier av proteiner som styr kromosom funktion. Även om det är väl kända fördelarna med knoppande jäst för genetiska, molekylära och biokemiska studier, är cytologiska studier av fördelningen av proteiner i cellens kärna kompliceras av dess ringa storlek. Den typiska jästkärnan har en diameter på mindre än en mikron, vilket är endast ca 5 gånger så hög upplösning gränsen för synligt ljus. Således, mängden information om fördelningen av nukleära proteiner som kan erhållas från konventionella immunfärgning eller genom att använda fluorescerande protein taggar, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), är begränsad. En användbar metod för att karakterisera subnuclear fördelningen av proteiner är kromosomytan spridning. Detta tillvägagångssätt innebär att ta bort cellväggen, störa cell och nukleära membran, och enllowing de olösliga innehållet i kärnan för att reglera på ytan av ett objektglas. Dessa olösliga komponenter innefattar den nukleära matrisen och kromosomerna. Förutom att möjliggöra avlägsnande av lösliga nukleära innehållet, vilket ökar förmågan att detektera kromatin bundna proteiner, kromosomen spridnings metoden resulterar i betydande dekomprimering av kromosomer så att spridnings kärnorna har diametrar på cirka 3 till 5 ^ m (för diploida meiotiska kärnor) och 2 till 3 pm för diploida mitotiska kärnor. Denna dekomprimering tillåter detektion av kärnkonstruktion som är relativt svårt eller omöjligt att lösa i intakta kärnor.

En uppenbar brist till kromosom spridning är möjligheten att spridningsförfarandet helt eller delvis kan störa strukturen av intresse. Särskilt oroande är att en viss kromosombundet protein kan gå förlorade till följd av spridningsförfarandet. Denna potentiella komplikation should hållas i åtanke när man tolkar data. Ett exempel på ett protein som är känsligt för spridningsförfarandet är beta-tubulin. Under vissa förhållanden, spindeln, som består i huvudsak av tubulin, bevaras under spridning ^3. Visualisering av spindeln är ofta användbart att iscensätta kärnor av intresse. Men visualisera tubulin kräver behandling med en hög koncentration fixerings; spindlar går förlorade under normala förhållanden som beskrivs nedan. Detta exempel illustrerar att, när man analyserar fördelningen av en tidigare okaraktäriserat protein är det viktigt att variera koncentrationen av fixativ för att avgöra hur känsliga proteinet är att sådana variationer. Trots oro effekterna av spridningsförhållanden på kromosom struktur har nytta och effekt av spridningsmetod visats i många sammanhang och har bred användning vid karakterisering av mitotisk och särskilt meiotiska celler ^4-7.

Two spridningsmetoder har använts i stor omfattning. Den första av dessa metoder, som utvecklats av Dresser och Giroux ^8, undviker användningen av tvättmedel och kan ge spridning preparat som verkar ha relativt välbevarad kromosom morfologi när färgas för DNA-specifika färgämnet DAPI. Det är dock relativt svårt att fullända denna metod och kvaliteten på spridda kärnor varierar kraftigt, när en region av en bild är jämfört med andra regioner. Detta problem kan komplicera kvantitativa metoder som involverar avbildning många omarkerade kärnor från en bild för att undvika datainsamling partiskhet. Den andra kromosom spridningsmetod, utvecklad av Loidl och Klein ¹ innebär att balansera fixering av paraformaldehyd, med lys och kromatin dekompression främjas av en rengöringslösning. När korrekt utförd, ger denna metod mycket reproducerbara resultat med mindre region till region variation jämfört med Dresser och Giroux metod. Denna presentation fokuserar på en Modified version av metoden för Loidl och Klein, på grund av dess tillförlitlighet och enkelhet.

Kromosom spridning är inte komplicerat eller tidskrävande; upp till 100 objektglas kan framställas för immunfärgning på en enda dag. Vidare kan de spridda preparaten förvaras i frysen i åren före immunfärgning och sålunda laboratorier kan utveckla ett förvar av frysta kromosom uppslag som kan användas när nya biologiska frågor uppstår eller nya färgningsreagenser blir tillgängliga.

Kromosomen spridningsmetod är vanligast i kombination med immunfärgning och widefield fluorescensmikroskopi, men det är också möjligt att framställa bilder för superresolution ljusmikroskopiska metoder såsom stimulerad utarmning utsläppet (STED) mikroskopi.

Protocol

OBS: Vissa steg i protokollet kräver att arbeta i en ren dragskåp nedan. Dessutom kräver metoden en jäst tetrad dissektion mikroskop utrustat med en 10X lång arbetsavstånd mål att övervaka spheroplasting. Mikroskopet bör inrättas i huven i förväg. Ta mikromanipulator armen och hållare från tillämpningsområdet och placera dessa objekt i en säker plats borta från arbetsområdet.

1. Framställning av sfäroplaster

1. Väx jäst under önskade förhållanden. Använd ca 2 x 10 ⁸ celler för varje prov, t.ex. 4 ml av en kultur på OD600 1.4 = 5 x 10 ⁷ celler / ml. Även omedelbar bearbetning av prover kan vara att föredra i vissa fall, för de flesta tillämpningar, cell alikvoter kan lagras på is i upp till 8 timmar innan den bearbetas.
2. Överför cellsuspension till en 15 ml centrifugrör och centrifugera i en klinisk centrifug vid inställning 5 (2345 rpm / 857,5 xg) i 3 min för att pelletera cellerna. Dekantera medel ta hand att inte förlora celler från pelleten. Försiktigt resuspendera cellerna i 1 ml ZK buffert och sedan lägga 40 ul 1 M ditiotreitol (DTT). Inkubera 2 min med försiktig blandning. Pellets celler som tidigare (se steg 1.2).
3. Resuspendera pellets i 1 ml ZK buffert. Tillsätt 5 pl av en nyframställd lösning av zymolyas 100T som har blandas ordentligt. Inkubera under 20-30 min vid 30 ° C för avlägsnande av cellväggen och producera sfäroplaster.
4. Analysera en 10 pl droppe av cellsuspensionen på ett objektglas för att bestämma om spheroplasting är klar. Celler tittade under dissektion mikroskop utan täck. Cellerna ska visas uppsvälld och runda snarare än något avlång och bör lysera efter tillsats av 20 pl vatten. Om celler inte lysa tillbaka provet till 30 ° C och åter analysen var 10 min tills vattnet inducerad lys lätt observeras. Pellets celler som tidigare (se steg 1.2).
5. Försiktigt resuspendera och tvätta cellpelleten in 2,5 ml kall MES / sorbitol buffert. Pellets celler som tidigare (se steg 1.2). Försiktigt resuspendera cellpelleten i 300-400 ul kalla MES / sorbitol buffert. Celler kan förvaras på is i detta skede under flera timmar.

2. Kromosomspridning

OBS: De glasytor på vilka kromosomer kommer att spridas, antingen diabilder eller Täckglas-bör förberedas i förväg. Varje bild eller täck bör nedsänkt i vatten, sedan EtOH, därefter torka och polerad med linspapper. Om kromosomer kommer att spridas på täck bör täck fästas på en bild med tejp eller gummi cement. Om inget annat anges, kommer resten av protokollet beskriver spridning på antingen en bild eller täck

1. Med användning av en P20 pipett, pipett 20 ul av cellsuspension på ytan av ett rent objektglas.
2. Med användning av en P200 pipett, tillsätt 40 | il av 3% PFA / sackaroslösning och försiktigt blanda Solution av "virvlande" bilden med handen tills Schlieren linjer försvinner. Placera glider under mikroskop och bekräftar att cellerna är i fokus. PFA Lösningen bör vara nyberedda i dragskåp på användningsdagen.
   OBS: Om proteinet av intresse inte har granskats av den metod som tidigare, är det lämpligt att förbereda ytterligare bilder med hjälp av lösningar som innehåller 2 och 4% PFA för att avgöra om bibehållande av proteinet är känsligt för fixeringsförhållanden. En 4% PFA / sackaroslösning används i fall där det är önskvärt att visualisera associerade tubulin mikrotubuli. Nackdelen med den högre fixativ koncentrationen är att kromosomerna kommer att vara "underspread," 2% PFA tenderar också till att ge "underspread" kromosomer.
3. Med hjälp av en P200 pipett, tillsätt 80 ul av 1% Lipsol, snurra som tidigare för att blanda lösningar så fullständigt som möjligt, starta en timer. Om Lipsol inte är tillgänglig, kan 80 pl 1% NP40 eller 80 pl dH ₂ O varaersättas (se Representativa resultat Figur 2).
4. Titta cellerna noggrant och försiktigt snurra bilden var 15 sekund. När ungefär 80% av cellerna har lyserade (försvunnit) stoppa timern omedelbart ta bort bilden från mikroskopet, tillsätt 80 pl PFA / sackaroslösning och snurra för att blanda. Lysis bör ske från mellan 30 och 90 sekunder efter start av timern.
   OBS: Om flera bilder visar lys vid ungefär samma tid, kan man så småningom utelämna mikroskopisk övervakning av resten av bilderna och bara försiktigt tajma perioden mellan tillsats av lipsol och tillsats av den slutliga portion av fixativ. Detta är dock genväg enda tillförlitliga när de förbereder flera bilder från samma prov. Det är bäst att följa upp lys av varje prov mikroskopiskt när olika bilder framställs från prover tagna vid olika tidpunkter eller från olika kulturer.
5. Placera bilden på en ren plan yta och sprida vätskan över hela unfrosted surface av sliden med sidan av en ren, engångs betesmark pipett som hölls under menisken av "pöl", men ovanför ytan av sliden i sig, dvs. inte "rake" ytan av objektglaset med pipett. Återanvänd inte pipett på olika bilder för att undvika kontaminering av prover.
6. Låt objektglasen torka över natten i dragskåp. Olösliga kärnkomponenter kommer att bosätta sig på glidytan och binda till det. För stora experiment, är det viktigt att planera användning av utrymme för torkningssteget.
7. När de väl torkat, är optimala resultat erhålles genom att fortskrida till den immunfärgning steget på samma dag. Men bäddar den torkade sackaroslösningen spridnings kromosomerna i en "honung" som tillåter frysning av prover: slides kan överföras till en plastglidlåda och förvarades vid -20 ° C under flera år.

3. Immunfärgning

1. Doppa objektglasen i 0,2% Foto-Flo för 30 sek. för avlägsnande av honung. Lean glider påen kant, med kanten vilar på en pappershandduk, för att avlägsna återstående foto-Flo.
2. Doppa objektglasen i 1x TBS under 5 min för att tvätta. Ta bort överflödig vätska genom att luta diabilder på en kant, men låt dem inte torka ut.
3. Lägg diabilder frostat uppåt, pipett 300 ul TBS / BSA på bilden över unfrosted delen av bilden.
4. Inkubera i en fuktig kammare vid RT under 15 minuter. (Stor plastbehållare fodrad med vattenmättad pappershanddukar i en perforerad plåt eller plast glidlåda med mättade hushållspapper).
5. Tappa diabilder genom att vila en kort kanten av bilden på en pappershandduk och lutar bilden mot en lämpligt stöd (såsom en provrörsställ). Låt inte ytan torka.
6. Omedelbart tillämpa 80 il TBS / BSA-buffert innehållande den tillämpliga utspädningen av primär antikropp. Om antikroppen är begränsande, använd 40 pl och en 22 x 22 mm täckglas. För råkaninserum, är detta typiskt mellan en 1/50 och 1/500 utspädning.
   NOTERA:Utför titreringar för nya antikroppsberedningar. Den mest utspädda preparat som ger hög signal över bakgrunden väljs. För att kontrollera för nivån av bakgrundsfärgning, bör kärnor framställas från den lämpliga deletionsmutant stam och / eller duplicerade objektglas bör färgas med pre-immunserum.
7. Placera en polerad 22 x 50 mm täckglas på bilden undvika bubblor. Gör detta genom att hålla täck mellan tummen och pekfingret längs långsidan på platser nära en kortsidan. Håll täck vid en 30 ° vinkel i förhållande till glida, kortsidan längst bort från fingrarna sänks tills den vilar på bilden precis innanför kanten av "pöl" närmast frostat område av bilden. Sedan långsamt sänka täck i en mjuk rörelse tills fingrarna håller glid beröring bänken, och släpp sedan. Försök inte justera positionen för täckglaset när det landar.
   OBS: Om kromosom uppslag framställdes påsatta täck (snarare än direkt på ytan av diabilder), kommer detta prov täck förbli fäst bilden hela färgning och tvättstegen. En extra täck kommer att placeras ovanpå provet täck att fördela antikroppslösningen under färgning och sedan kasseras.
8. Placera objektglasen i en förseglad fuktig kammare och inkubera över natten vid 4 ° C.
9. Håll frostat kant överföra bilderna till en glasskiva färgning rack och dränka i en färgnings burk innehållande TBS.
10. Doppa försiktigt glida upp och ner för att ta bort täck. Försök att inte använda för mycket kraft för att göra detta. Tvätta bilderna 2x 10 minuter genom att sänka i TBS. Ta bort diabilder från rack och dränera överflödig vätska genom att trycka på kanten till pappershandduk. Låt inte ytan torka.
11. Arbetar under dämpat ljus, omedelbart lägga 80 ul TBS / BSA innehållande en 1/1000 gånger utspädning av fluorokrom konjugerad sekundär antikropp (eller 40 fil med en 22 x 22 mm täck). Add täckglas som tidigare och inkubera vid 4 ° C under 2 h i den fuktiga kammaren i mörker.
12. Ta bort täck som tidigare, dränera diabilder, och låt ytan lufttorka under 1 till 2 timmar i mörker. Lean glider på hushållspapper som tidigare.
    OBS: Om spridningen utfördes på en monterad täck, lossa täck från bilden före torkning. Täckglas torkas sedan såsom beskrivits för diabilder i föregående steg.
13. Arbetar under dämpad belysning, tillsätt ca 30 il monteringsmedium innehållande DAPI (tre 10 il droppar) och sedan försiktigt sänka en täck. Om spreadarna på täck, placera droppar av monteringsmedium på en ren bild och sänka täck, kromosom nedåt, på bilden.
14. Fortfarande under dämpat ljus, vänta 2 min för täck att bosätta sig och försegla kanterna på täck med genomskinligt nagellack. Placera bilder i en plan glidlåda.
    OBS: För STED mikroskopi, Fäste med Förläng Guld. Använd 30 pl Förläng Goldutan DAPI och låt härda över natten. Tätning med nagellack är onödig.
15. Visa diabilder från widefield epifluorescensmikroskopi med 40 eller 100X mål med hjälp av ett filter set lämplig för DAPI att fokusera. Eventuellt lagra bilden i mörker vid 4 ° C under flera veckor. Får ej frysas.

Representative Results

Utseendet på spridda kärnor beror kritiskt på balansen mellan kromosom fixering och de-kompaktering. Även när reagens är korrekt balanserad, kan variation i graden av kromosom de-kompaktering förekommer i olika områden av samma bild och / eller mellan olika objektglas. Därför bör bedömas kvaliteten på uppslag i en viss region av en bild innan bilderna tolkas.

Effekterna av "overspreading" och "underspreading" kan illustreras med hjälp av antikroppar mot meiotiska rekombinationsproteiner. I fig 1, meiotiska kärnor är dubbel immunostained för de två eukaryota strängutbyte proteiner RAD51 och Dmc1 och motfärgades med avseende på DNA med DAPI. Två exempel på optimalt spridda kärnor visas i figur 1A. Figur 1B visar ett exempel på en underspread kärna och figur 1C exempel på två overspread kärnor. Noteraatt färre härdar av RAD51 och Dmc1 observeras i både över och underspread kärnor jämfört med korrekt sprida kärnor. I fallet med underspread kärnor, vissa foci är ofokuserad eftersom provet inte är tillräckligt platt. Dessutom kan epitop tillgänglighet bidra till underlåtenheten att upptäcka alla härdar. Vidare kan den mindre diametern av spridningen hindrar upplösningen av tätt åtskilda strukturer. I fallet med overspread kärnor, kan proteinet förloras på grund av otillräcklig fixering och / eller överdriven behandling rengöringsmedel.

Varianter av standardmetoden kan undvika användning av Lipsol. Den ursprungliga versionen av spridningsmetod som beskrivs av Loidl et al. utnyttjar Lipsol, en anständighet laboratorieglas rengöringsmedel ^1. Även om detta rengöringsmedel används idag för kromosom spridning i många laboratorier, är den ursprungliga formuleringen inte längre är kommersiellt tillgänglig och produkten för närvarande säljs under det namnet har omformulerats. Furthermore, är den ursprungliga formeln för Lipsol inte heller tillgänglig (Franz Klein, personlig kommunikation). I ett försök att lösa detta problem, genomförde vi experiment där kommersiellt tillgängliga och kemiskt definierade tvättmedel NP40 användes i stället för Lipsol; denna modifiering av standardprotokollet befanns ge tillfredsställande resultat för ett experiment där spred meiotiska kärnor färgades för RAD51 och Zip1, en ​​komponent i det centrala området av det synaptonemal komplexet (Figur 2A). Intressant, som ersätter den Lipsol lösningen med samma volym av dH ₂ 0 också givit tillfredsställande resultat (Figur 2B). Även om dessa resultat tyder på att spridningsmetoden som beskrivits ovan kan användas med framgång utan Lipsol, är det möjligt att vissa tidigare beskrivna resultat beror på användning av Lipsol och kommer inte att vara reproducerbara om NP40 eller H ₂ 0 användes i dess ställe. En individ lära sig spridningsmetod miGHT rimligen väljer att börja med NP40 och / eller _H2O i stället för Lipsol. I händelse av att svårigheter uppstår, kan utredaren begära en alikvot av Lipsol från ett laboratorium som erhålles ett lager av reagenset innan det avbröts; Lipsol var billigt och det lägsta belopp man kunde beställa var tillräcklig för att generera miljontals bilder.

Spridnings metod lämpar sig för användning med super-upplösning ljus mikroskopi metoder. Den synaptonemal Anläggningen består av två linjära axiella / sidoelement som vart och ett organiserar ett par systerkromatider i en uppsättning av sling arrayer, med basen på varje slinga bunden till ett element. Pachytene kromosomer har synapsed par av laterala element som hålls parallellt på ett avstånd av 100 nm med proteiner som bildar den centrala regionen av synaptonemal komplex. Dessa parade sidoelement kan inte lösas genom konventionell widefield epifluorescensmikroskopi, men kan lösas genom super-resolumetoder. I fig 3 visas en pachytene kärna visat att färgas med samma antikropp för Zip1-protein, användes för experimentet i fig 2. Provet färgades också för Red1 protein, en komponent av axiella / sidoelement. Resultatet avslöjar att Zip1 antikroppen känner igen det laterala elementet bindande regionen av Zip1, snarare än det långsträckta alfa spiralformiga coiled-coil domän som ligger mellan sidoelement bindande regioner. Således färgningsmönstret observerade med denna Zip1 antikropp avslöjar parallella banor av de parade sidoelementen. Fördelningen av Red1 härdar längs sidoelement är relativt gles jämfört med Zip1 fokus, men dubbelfärgningsmetoden visar att Red1 fokus ligger vanligen nära de linjära banor som definieras av Zip1 fokus. Dessa resultat överensstämmer med tidigare arbete där samma spridningsmetod användes för att framställa prover för analys genom elektronmikroskopi; trepartsstruktur av synaptonemal complex bevaras under spridningsförfarandet. Bilden som visas i fig 3 alstrades genom STED mikroskopi ^9.

Figur 1: Exempel på spridnings kärnor meiotiska kärnor färgade för Dmc1 (grön), RAD51 (röd), och DNA (DAPI, blå).. Bar = 1 ^ m. (A) 2 exempel på optimalt spridda kärnor. (B) Ett exempel på en underspread kärna. (C) Två exempel på overspread kärnor. Exemplet till vänster är en kärna där endast den övre delen overspread.

Figur 2: meiotiska kärnor framställda utan användning av Lipsol Spread meiotiska kärnor från stegen indikerade färgas för RAD51 (röd),.Zip1 (grön), och DNA (DAPI, blå). Observera att kromosom packning som uppstår som celler övergången från leptonema till pachynema till stor del bevaras.

Figur 3: Visualisering av synaptonemal komplexet via STED mikroskopi En pachytene kärna färgades för Zip1 (grön) och Red1 (röd).. Data bearbetades med hjälp av DeconvolutionLab ImageJ plugin ¹⁰ för att köra 100 iterationer med hjälp av Richardson-Lucy modell med en uppmätt STED PSF.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.