Bredspredning og immunfarvning af gærkromosomer

Introduction

Den knopskydende gær Saccharomyces cerevisiae giver mange fordele til undersøgelser af molekylære mekanismer i biologiske processer, herunder analyse af de proteiner, der styrer kromosom funktion. Selv om der er velkendte fordele ved knopskydende gær af genetiske, molekylære og biokemiske undersøgelser, er cytologiske undersøgelser af fordelingen af ​​proteiner i cellens kerne kompliceret af dens lille størrelse. Den typiske gær kerne har en diameter på mindre end en mikron, som kun er omkring 5 gange opløsningsgrænsen af ​​synligt lys. Således er mængden af ​​information om fordelingen af ​​nukleare proteiner, der kan opnås fra konventionelle immunfarvning eller ved anvendelse af fluorescerende protein-tags, såsom grønt fluorescerende protein (GFP), er begrænset. En nyttig metode til at karakterisere den subnuclear fordeling af proteiner er kromosom overflade spreder. Denne fremgangsmåde indebærer at fjerne cellevæggen, forstyrre celle og nukleare membraner, og enllowing de uopløselige indhold kernen til afvikling på overfladen af ​​et objektglas. Disse uopløselige bestanddele indbefatter det nukleare matrix og kromosomerne. Udover at tillade fjernelse af opløselige nukleare indhold, som forbedrer evnen til at detektere kromatin bundne proteiner, kromosomet sprede metode resulterer i væsentlig dekompression af kromosomer, således at de spredte kerner har diametre på omkring 3 til 5 um (for diploide meiotiske kerner) og 2 til 3 um til diploide mitotiske kerner. Denne dekompression tillader detektering af nuklear understruktur, som er forholdsvis vanskeligt eller umuligt at løse i intakte kerner.

En indlysende mangel på kromosom spredning er muligheden at spreading procedure delvist eller fuldstændigt kan forstyrre strukturen af ​​interesse. Af særlig bekymring er, at et bestemt kromosom bundet protein kan gå tabt som følge af spredningen procedure. Denne potentielle komplikation should skal holdes for øje ved fortolkning af data. Et eksempel på et protein, der er følsom over for spredning procedure er beta-tubulin. Under visse betingelser spindlen, som består hovedsagelig af tubulin, bevares under spredning ^3. Visualisering af spindlen er ofte nyttigt at fase kerner af interesse. Men visualisere tubulin kræver behandling med en høj koncentration fiksativ; spindler er tabt under de standardbetingelser, der er beskrevet nedenfor. Dette eksempel illustrerer, at, når man analyserer fordelingen af ​​en tidligere ukarakteriseret protein, er det vigtigt at variere koncentrationen af ​​fiksativ til at bestemme, hvor følsom proteinet er at sådan variation. På trods af bekymring for virkningen af de spreder betingelser på kromosom struktur, har nytte og magt sprede metoden blevet påvist i mange sammenhænge og har bred anvendelighed i karakterisering af mitotiske og, især meiotiske celler ^4-7.

Two spredning fremgangsmåder er blevet anvendt i udstrakt grad. Den første af disse metoder, udviklet af Dresser og Giroux ^8, undgår brugen af rengøringsmiddel og kan rentespændet præparater, der synes at have relativt velbevaret kromosom morfologi når farves for DNA-specifikke farvestof DAPI. Imidlertid er relativt vanskelige at perfektionere denne fremgangsmåde og kvaliteten af ​​de spredte kerner varierer dramatisk, når en region i en objektglasset i forhold til andre regioner. Dette problem kan komplicere kvantitative metoder, der involverer billeddannelse mange fravalgte kerner fra et dias for at undgå data erhvervelse bias. Den anden kromosom sprede metode, udviklet af Loidl og Klein ^1, indebærer afvejning fiksering af paraformaldehyd, med lyse og kromatin dekompression fremmes af en rengøringsmiddel. Når udføres korrekt, denne metode giver meget reproducerbare resultater med mindre region-til-region variation sammenlignet med Dresser og Giroux metoden. Denne præsentation fokuserer på en modifiéd version af metoden ifølge Loidl og Klein, på grund af dens pålidelighed og enkelhed.

Kromosom spreder er ikke kompliceret eller tidskrævende; op til 100 slides kan være forberedt til immunfarvning på en enkelt dag. Endvidere kan de spredte præparater opbevares i fryseren i årene før immunfarvning, og dermed labs kan udvikle et lager af frosne kromosomspredninger, der kan bruges, når nye biologiske spørgsmål opstår eller nye farvningsreagenser bliver tilgængelige.

Kromosomet spredning metode er mest almindeligt anvendt i kombination med immunfarvning og Vidvinklet fluorescensmikroskopi, men det er også muligt at fremstille dias til super-beslutning lys mikroskopiske metoder såsom stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi.

Protocol

BEMÆRK: Visse trin i protokollen nedenfor kræver arbejder i en ren stinkskab. Desuden kræver metoden en gær tetrade dissektion mikroskop udstyret med en 10X lang arbejdsafstand objektiv til at overvåge spheroplasting. Mikroskopet bør oprettes i hætten før tid. Fjern mikromanipulator arm og plade holder fra anvendelsesområdet og placere disse elementer på et sikkert sted væk fra arbejdsområdet.

1. Fremstilling af Sfæroplaster

1. Vokse gær under ønskede betingelser. Bruge omkring 2 x 10 ⁸ celler for hver prøve, fx 4 ml af en kultur på OD600 1,4 = 5 x 10 ⁷ celler / ml. Selv om øjeblikkelig behandling af prøver kan være at foretrække i visse tilfælde, til de fleste anvendelser, celle alikvoter kan opbevares på is i op til 8 timer, før de behandles.
2. Overførsel cellesuspension til et 15 ml centrifugerør og spin i en klinisk centrifuge ved indstilling 5 (2345 opm / 857,5 xg) i 3 minutter for at pelletere cellerne. Dekanteres mediet pas på ikke at miste celler fra pellet. Forsigtigt resuspender cellerne i 1 ml ZK buffer og derefter tilsættes 40 ul 1 M dithiothreitol (DTT). Inkuber 2 minutter med forsigtig blanding. Pellet celler som før (se trin 1.2).
3. Resuspender pellets i 1 ml ZK buffer. Tilsæt 5 pi af en frisk fremstillet opløsning af zymolyase 100T, der er blevet grundigt blandet. Der inkuberes i 20-30 minutter ved 30 ° C til fjernelse cellevæggen og producere sfæroplaster.
4. Analysere en 10 pi dråbe af cellesuspensionen på et mikroskopobjektglas for at bestemme om spheroplasting er fuldført. Celler set under dissektion mikroskop uden dækglas. Celler skal vises oppustet og rund i stedet for lidt aflange og bør lysere efter tilsætning af 20 pi vand. Hvis celler ikke at lysere anbringes prøven igen til 30 ° C og re-assay hver 10 min, indtil vandet inducerede lysis let observeres. Pellet celler som før (se trin 1.2).
5. Forsigtigt resuspender og vaske cellepellet in 2,5 ml kold MES / sorbitol buffer. Pellet celler som før (se trin 1.2). Forsigtigt resuspender cellepelleten i 300-400 pi koldt MES / sorbitol buffer. Celler kan holdes på is i denne fase i flere timer.

2. Kromosom Spredning

BEMÆRK: Overfladerne glas, hvorpå kromosomer vil blive spredt-enten dias eller dækglas-bør forberedes i god tid. Hvert dias eller dækglas bør nedsænkes i vand, derefter EtOH, derefter lov til at tørre, og poleres med linsepapir. Hvis kromosomer vil blive fordelt på dækglas, skal dækglasset anbringes på et dias med Scotch tape eller gummi cement. Medmindre andet er nævnt, vil resten af ​​protokollen beskrive spredning på enten et dias eller dækglas

1. Ved hjælp af en P20 pipette, pipette 20 pi cellesuspension på overfladen af ​​et rent objektglas.
2. Ved hjælp af en P200 Tilsæt 40 ​​ul af 3% PFA / saccharoseopløsningen og forsigtigt blande opklaringn med "hvirvlende" slæden med hånden, indtil Schlieren linjer forsvinder. Placer dias under mikroskop og bekræfter, at cellerne er i fokus. PFA opløsning skal være frisk fremstillede i stinkskab på dagen for anvendelse.
   BEMÆRK: Hvis proteinet af interesse ikke er blevet undersøgt ved hjælp af fremgangsmåden tidligere, er det hensigtsmæssigt at forberede yderligere objektglas under anvendelse af opløsninger, der indeholder 2 og 4% PFA at bestemme, om fastholdelse af proteinet er følsomt over for fiksering betingelser. En 4% PFA / sucrose opløsning anvendes i tilfælde, hvor det er ønskeligt at visualisere tilknyttede tubulin mikrotubuli. Ulempen ved den højere fiksativ koncentration er, at kromosomerne vil være "underspread," 2% PFA også en tendens til dannelse af "underspread" kromosomer.
3. Ved hjælp af en P200 Tilsæt 80 ul 1% Lipsol, hvirvle som før for at blande løsninger så fuldstændigt som muligt, starte en timer. Hvis Lipsol ikke er tilgængelig, kan 80 pi 1% NP40 eller 80 pi _dH2O væresubstitueret (se Repræsentative resultater, figur 2).
4. Se cellerne omhyggeligt og forsigtigt hvirvel slide hver 15 sek. Når omkring 80% af cellerne er lyseret (forsvundet) stoppe timeren, skal du straks fjerne dias fra mikroskopet, tilsættes 80 ul PFA / saccharoseopløsning, og hvirvel for at blande. Lysis bør forekomme fra mellem 30 og 90 sek efter start af timeren.
   BEMÆRK: Hvis flere sider viser lysis på omtrent samme tid, kan man til sidst udelade mikroskopisk kontrol for resten af ​​gliderne og simpelthen omhyggeligt timeout perioden mellem tilsætning af lipsol og tilsætning af den endelige prøve af fiksativ. Men denne genvej er kun pålidelig, når forbereder flere dias fra den samme prøve. Det er bedst at overvåge lyse af hver prøve mikroskopisk når forskellige slides er forberedt fra prøver udtaget på forskellige tidspunkter eller fra forskellige kulturer.
5. Placer dias på en ren flad overflade og sprede væsken over hele unfrosted overflade af slæden under anvendelse siden af en ren, engangs Græs pipette holdes under menisken af "pyt", men over overfladen af objektglasset selv, dvs.. ikke "rake" overfladen af ​​objektglasset med pipette. Genbrug ikke pipette på forskellige dias for at undgå forurening af prøverne.
6. Lad dias tørre natten over i stinkskab. Uopløselige nukleare komponenter vil rette på slide overfladen og binder sig til det. For store eksperimenter, er det vigtigt at planlægge brugen af ​​plads til tørringstrinnet.
7. Når tørret, opnås optimale resultater ved går videre til immunfarvning fase på samme dag. Men den tørrede saccharoseopløsning indlejrer de spredte kromosomer i en "honning", der tillader frysning af prøver: slides kan overføres til en plastik dias kasse og opbevaret ved -20 ° C i årevis.

3. Immunfarvning

1. Dip glider i 0,2% Foto-Flo for 30 sek. at fjerne honning. Lean glider påen kant, med kanten hviler på et stykke køkkenrulle, for at fjerne resterende Foto-Flo.
2. Dip objektglassene i 1x TBS i 5 min for at vaske. Fjern overskydende væske ved at læne dias på en kant, men lad dem ikke tørre ud.
3. Lægge slides frosted opad, pipette 300 pi TBS / BSA på dias på tværs af unfrosted del af dias.
4. Inkuber i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 15 minutter. (Stor plastikbeholder foret med vand mættet papirhåndklæder under en perforeret metalplade eller plast slide kasse med mættede papirhåndklæder).
5. Hæld vandet dias ved at hvile en kort kant af dias på et stykke køkkenrulle og hælder objektglasset mod en passende støtte (såsom et reagensglas rack). Lad ikke overfladen tørre.
6. Straks anvende 80 pi TBS / BSA-buffer indeholdende en passende fortynding af primært antistof. Hvis antistof er begrænsende, bruge 40 pi og en 22 x 22 mm dækglas. For rå kaninserum, dette er typisk mellem en 1/50 og 1/500 fortynding.
   NOTE:Udføre titreringer for nye antistofpræparater. Den mest fortyndede præparat, der giver højt signal over baggrund vælges. For at kontrollere for niveauet af baggrundsfarvning bør kerner fremstilles ud fra det passende deletionsmutant-stammen og / eller duplikerede objektglas skal farves med præ-immunt serum.
7. Placer en poleret 22 x 50 mm dækglas på objektglasset undgå bobler. Gør dette ved at holde dækglasset mellem tommel- og pegefinger langs den lange kant på positioner nær én korte kant. Holde dækglasset i en 30 ° vinkel i forhold til at glide, den korte kant længst væk fra fingrene sænkes indtil den hviler på diaset lige inden for kanten af ​​"pyt" nærmest matteret region af dias. Derefter langsomt sænke dækglasset i en jævn bevægelse, indtil fingrene holder slide røre bænken, og slip derefter. Forsøg ikke at justere placeringen af ​​dækglasset når det lander.
   BEMÆRK: Hvis kromosom spreads blev udarbejdet påfastgjorte dækglas (snarere end direkte på overfladen af ​​dias), vil denne prøve dækglas forblive fastgjort til dias hele farvning og vasketrin. En yderligere dækglas vil blive placeret på toppen af ​​prøven dækglasset at fordele antistofopløsning under farvning og derefter kasseres.
8. Anbring objektglassene i et fugtigt kammer forseglet og inkuberes natten over ved 4 ° C.
9. Holder matteret kant overføre dias til et objektglas farvning rack og nedsænkes i en farvning krukke indeholder TBS.
10. Forsigtigt dyppe glide op og ned for at fjerne dækglasset. Prøv ikke at bruge for mange kræfter til at gøre dette. Vask dias 2x 10 min ved nedsænkning i TBS. Fjern slides fra rack og dræne overskydende væske ved at røre kant til køkkenrulle. Lad ikke overfladen tør.
11. Arbejde under dæmpet lys, straks tilføje 80 pi TBS / BSA indeholder en 1 / 1.000 ganges fortynding af fluorokrom konjugeret sekundært antistof (eller 40 pi med en 22 x 22 mm dækglas). Add dækglas som før og inkuberes ved 4 ° C i 2 timer i det fugtige kammer i mørke.
12. Fjerne dækglas som før, dræne objektglas og tillade overflade lufttørre i 1 til 2 timer i mørke. Lean glider på papirservietter som før.
    BEMÆRK: Hvis sprede blev udført på en monteret dækglas, afmontere dækglas fra slide inden tørring. Dækglas tørres derefter som beskrevet for objektglas i det foregående trin.
13. Arbejde under dæmpet lys, tilføje omkring 30 ul montering medium indeholdende DAPI (tre 10 dråber pi), og derefter forsigtigt sænke en dækglas. Hvis spreads er på dækglas, placere dråber af montering medium på et rent objektglas og sænke dækglasset, kromosom nedad, på dias.
14. Stadig under dæmpet lys, vente 2 min for dækglas at bosætte sig og forsegle kanterne af dækglasset med klar neglelak. Placer slides i en flad slide kassen.
    BEMÆRK: STED mikroskopi, monteres med forlænger Gold. Brug 30 ul forlænger Golduden DAPI og lad hærde natten over. Forsegling med neglelak er unødvendig.
15. Se dias fra Vidvinklet epifluorescens mikroskopi med en 40 eller 100X mål ved hjælp af et filter sæt passende for DAPI at fokusere. Eventuelt opbevares objektglasset i mørke ved 4 ° C i adskillige uger. Må ikke fryses.

Representative Results

Fremkomsten af ​​spredte kerner kritisk afhænger af balancen mellem kromosom fiksering og de-komprimering. Selv når reagenserne korrekt afbalanceret, kan variation i graden af ​​kromosom de-kompaktering forekomme i forskellige regioner af samme glas og / eller mellem forskellige lysbilleder. Således bør kvaliteten af ​​spreads i en given region i et dias vurderes, før billederne er fortolket.

Virkningerne af "overspreading" og "underspreading" kan illustreres ved anvendelse af antistoffer mod meiotiske rekombinationsproteiner. I figur 1 meiotiske kerner er dobbelt immunfarvet for de to eukaryote strengudskiftning proteiner RAD51 og Dmc1 og counter farvet for DNA med DAPI. To eksempler på optimalt fordelt kerner er vist i figur 1A. Figur 1B viser et eksempel på en underspread kerne og figur 1C eksempler på to spredte kerner. Noteat færre foci af Rad51 og Dmc1 overholdes i både end og underspread kerner i forhold til at sprede kerner ordentligt. I tilfælde af underspread kerner, nogle foci er ude af fokus, fordi prøven ikke er tilstrækkeligt flad. Derudover kan epitop tilgængelighed bidrage til manglende detektering alle foci. Endvidere kan den mindre diameter af spredningen hinder beslutning af tætliggende strukturer. I tilfælde af spredte kerner, kan protein tabt på grund af utilstrækkelig fiksering og / eller overdreven detergentbehandling.

Variationer af standard metode kan undgå brugen af ​​Lipsol. Den oprindelige version af spredning metode beskrevet af Loidl et al. gør brug af Lipsol, en ordentlighed laboratorieglasvarer vaskemiddel ^1. Selv om dette vaskemiddel i øjeblikket bruges til kromosom breder sig i mange laboratorier, den oprindelige formulering er ikke længere kommercielt tilgængelige, og produktet øjeblikket sælges under dette navn er blevet omformuleret. Furthermore, den oprindelige formel for Lipsol er heller ikke tilgængelig (Franz Klein, personlig kommunikation). I et forsøg på at løse dette problem, vi udført forsøg, hvor de kommercielt tilgængelige og kemisk defineret vaskemiddel NP40 blev anvendt i stedet for Lipsol; denne modifikation af standard protokol blev fundet at give tilfredsstillende resultater for et eksperiment, hvor spredt meiotiske kerner blev farvet for Rad51 og Zip1, en ​​komponent af den centrale region af synaptonemal kompleks (figur 2A). Interessant erstatte Lipsol opløsningen med det samme volumen af dH ₂ 0 også givet tilfredsstillende resultater (figur 2B). Selv om disse resultater viser, at spredning fremgangsmåde beskrevet ovenfor kan anvendes med succes uden Lipsol, er det muligt, at nogle tidligere beskrevne resultater afhænger af anvendelse af Lipsol og vil ikke kunne reproduceres hvis NP40 eller H ₂ 0 anvendes i stedet. En person lære de spreder metoden miGHT rimelighed vælge at begynde med at bruge NP40 og / eller H ₂ O i stedet for Lipsol. I tilfælde af at vanskeligheder opleves, kan undersøgeren anmode en portion af Lipsol fra et laboratorium, der opnås et lager af reagenset før den blev afbrudt; Lipsol var billig og minimumsbeløbet man kunne bestille var tilstrækkelig til at generere millioner af dias.

Spredning metode er egnet til brug med super opløsning lysmikroskopi metoder. Den synaptonemal Komplekset består af to lineære aksiale / laterale elementer hver især arrangerer et par søsterchromatider til et sæt af loop arrays, idet midten af ​​hver sløjfe bundet til et element. Pachytene kromosomer har synapsed par af sideelementer afholdt parallelt i en afstand på 100 nm ved proteiner, der danner den centrale region af synaptonemal kompleks. Disse parrede laterale elementer kan ikke løses ved konventionel Vidvinklet epifluorescens mikroskopi, men kan løses ved super-resolution metoder. I figur 3 er vist en pachytene kerne, der er farvet med det samme antistof til Zip1 protein, der anvendes til forsøget i figur 2. Prøven blev også farvet for RED1 protein, en komponent af aksiale / laterale elementer. Resultatet viser, at Zip1 antistoffet genkender den laterale element bindingsregionen i Zip1, snarere end den aflange alpha spiralformede coiled-coil-domæne, som ligger mellem laterale element bindende regioner. Således farvningsmønster observeret med dette Zip1 antistof afslører parallelle veje i de parrede laterale elementer. Fordelingen af ​​RED1 foci langs laterale elementer er relativt sparsomme i forhold til Zip1 foci, men den dobbelte farvning metode viser, at RED1 foci generelt ligge i nærheden af ​​de lineære stier defineret af Zip1 foci. Disse resultater stemmer overens med tidligere arbejde, hvor samme spredning metode blev anvendt til at fremstille prøver til analyse ved elektronmikroskopi; den tredelte struktur synaptonemal complex bevares under spredning procedure. Billedet vist i figur 3 blev genereret ved STED mikroskopi ^9.

Figur 1: Eksempler på spredning kerner meiotiske kerner farvet for Dmc1 (grøn), Rad51 (rød), og DNA (DAPI, blue).. Bar = 1 um. (A) 2 eksempler på optimalt fordelt kerner. (B) Et eksempel på en underspread kerne. (C) To eksempler på spredte kerner. Eksemplet til venstre er en kerne, hvor kun den øvre del er spredte.

Figur 2: meiotiske kerner fremstillet uden brug af Lipsol Spread meiotiske kerner fra trin angivne farvet for Rad51 (rød),.Zip1 (grøn) og DNA (DAPI, blue). Bemærk, at kromosom komprimering, der opstår som celler overgang fra leptonema til pachynema vid udstrækning bevares.

Figur 3: Visualisering af synaptonemal komplekset via STED mikroskopi A pachytene kerne farvet for Zip1 (grøn) og RED1 (rød).. Dataene blev behandlet i den DeconvolutionLab ImageJ plugin ¹⁰ til at køre 100 iterationer ved hjælp af Richardson-Lucy model med en målt STED PSF.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.