Introduction
출아 효모 사카로 마이 세스 세레 비지 염색체 기능을 조절하는 단백질에 대한 연구를 포함한 생물학적 과정의 분자 메커니즘의 연구에 많은 이점을 제공한다. 유전 적 분자 및 생화학 적 연구를위한 효모 신진의 공지의 장점이 있지만, 세포의 핵 단백질의 분포의 세포 학적 연구는 작은 크기에 의해 복잡하게된다. 전형적인 효모 핵은 가시광의 단지 약 5 배의 해상도 한계 미만 1 미크론의 직경을 갖는다. 따라서, 종래의 면역 염색에서 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그를 사용함으로써 얻어 질 수 핵 단백질의 분포에 대한 정보의 양이 제한된다. 단백질 subnuclear 분포를 특성화하는 유용한 방법은 확산 염색체 표면이다. 이 접근법은, 세포벽을 제거하고 세포 핵막 및 중단을 포함llowing 핵의 불용 내용 현미경 슬라이드의 표면에 정착한다. 이 불용성 성분은 핵 매트릭스와 염색체를 포함한다. 염색질 결합 단백질을 감지하는 능력을 향상 가용성 핵 콘텐츠의 삭제를 가능하게하는 것 외에도, 이러한 확산 핵 주위이 3 μm 내지 5의 직경을 가지고 (이배체 감수 핵 대) 염색체의 실질적인 신장에있어서의 결과를 확산 염색체 2 배체 유사 분열 핵에 대한 μm의 3. 이 압축 해제는 그대로 핵에 해결할 상대적으로 어렵거나 불가능 핵 하부의 검출 할 수있다.
확산 염색체 명백한 단점은 확산 과정은 관심의 구조를 부분적으로 또는 완전히 중단 할 가능성이다. 특히 관심의 특정 염색체 결합 단백질 확산 과정의 결과로서 손실 될 수 있다는 것이다. 이 잠재적 인 합병증 수오데이터를 해석 할 때, LD는 명심. 확산 과정에 민감한 단백질의 하나의 예는 베타 - 튜 불린이다. 일부 조건 하에서, 주로 튜 불린 구성되는 스핀들, 3, 확산 중에 보존된다. 스핀들의 시각화는 종종 관심의 핵를 준비하는 데 유용합니다. 그러나, 튜 불린을 떠올리 고농도 정착액 치료를 필요로; 스핀들은 후술하는 표준 조건 하에서 손실된다. 이 예는 이전에 규명하지 않은 단백질의 분포를 분석 할 때, 그 단백질이 이러한 변화에 얼마나 민감한 결정 정착액의 농도를 변화시키는 것이 중요하다는 것을 나타낸다. 염색체 구조에 확산 조건의 영향에 대한 우려에도 불구하고, 확산 방법의 유용성 및 전원은 많은 콘텍스트에서 설명과 유사 분열의 특성화 및, 특히 4-7 감수 세포에 다양한 유틸리티가되었다.
TWO 확산 방법이 널리 사용되어왔다. 드레서 및 지로 (8)에 의해 개발 된이 방법의 첫 번째, 세제의 사용을 회피하고, DNA 특이 적 염색을 위해 DAPI 염색 때 비교적 잘 보존 염색체 형태를 갖도록 표시 확산 제제를 수득 할 수있다. 그러나,이 방법은 완전 비교적 어렵고 하나의 슬라이드 영역이 다른 영역에 비교 될 때 확산 핵의 품질은 크게 달라진다. 이 문제는 데이터 수집 바이어스를 피하기 위해 하나의 슬라이드에서 다수의 선택되지 않은 핵 촬상 포함 정량적 방법을 복잡하게 할 수있다. Loidl과 클라인 (1)에 의해 개발 된 방법을 확산 번째 염색체는, 용해 및 세제에 의해 추진 염색질 압축 해제와 함께, 파라 포름 알데히드로 고정 균형을 포함한다. 제대로 수행되면,이 방법은 드레서와 지로 방법에 비해 적은 지역 간 지역 변화에 매우 재현 가능한 결과를 제공합니다. 이 프레젠테이션은 변형 된에 초점을 맞추고때문에 그것의 신뢰성과 단순성의 Loidl과 클라인의 방법의 D 버전.
염색체 확산은 복잡하거나 시간 소모적 아니다; 최대 100 슬라이드는 하루에 대한 면역 염색을 제조 할 수있다. 또한, 확산 제로는 종래 면역 년 동안 냉장고에 저장 될 수 있고, 이에 따라 랩 새로운 생물학적 질문이 발생하거나 새로운 염색 시약이 제공 될 때 사용할 수있는 냉동 염색체 스프레드 저장소를 개발할 수있다.
염색체 확산 방법이 가장 일반적으로 면역 염색과 위드 형광 현미경과 조합하여 사용되지만, 그와 같은 유도 방출 고갈 (STED) 현미경 등의 수퍼 - 해상도 광 현미경 방법을위한 슬라이드를 제조하는 것도 가능하다.
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Protocol
참고 : 프로토콜의 일부 단계 아래 깨끗한 흄 후드에서 작업이 필요합니다. 또한, 상기 방법은 spheroplasting을 모니터링 10X 작동 거리가 긴 대물 렌즈를 구비 한 효모 테트라 해부 현미경을 필요로한다. 현미경은 미리 후드에 설치해야합니다. 범위에서 미세 조작기의 팔과 판 홀더를 제거하고 멀리 작업 영역에서 안전한 장소에 이러한 항목을 배치합니다.
Spheroplasts 1. 준비
- 원하는 조건 하에서 효모 성장. OD600 = 1.4 5 × 107 세포 / ㎖에서 각각의 샘플에 대해 2 × 108 세포, 즉 배양 4㎖를 사용. 샘플의 즉각적인 처리가 어떤 경우에는 바람직 할 수 있지만, 대부분의 애플리케이션에 대해, 세포 분취 액 처리되기 전 최대 8 시간 동안 얼음 상에 저장 될 수있다.
- 세포 펠렛 3 분 5 (2345 RPM / 857.5 XG)를 설정에서 임상 원심 분리기에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. 펠렛에서 세포를 잃지 않도록 매체 복용 치료를 가만히 따르다. 부드럽게 1 ML의 ZK 버퍼에있는 세포를 재현 탁하고 40 μL 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. 부드러운 혼합 2 분을 품어. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조).
- 1 ML의 ZK 버퍼에 재현 탁 펠렛. 완전히 혼합 된 zymolyase 100T의 새로 제조 액 5 μl를 추가합니다. 세포벽을 제거한 spheroplasts을 제조 30 ℃에서 20-30 분 동안 인큐베이션.
- spheroplasting가 완료되었는지를 결정하기 위해 현미경 슬라이드에 세포 현탁액 10 μL 액적 분석. 커버 슬립없이 해부 현미경으로 본 세포. 세포가 부풀어 둥근보다는 약간 타원형 표시해야하며, 물 20 ㎕를 첨가 한 다음 용균한다. 세포 용균하지 않으면 물에 의한 분해가 쉽게 관찰 될 때까지 매 10 분, 30 ℃로 샘플을 반환하고 다시 분석. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조).
- 부드럽게 재현 탁 세포 펠렛 내가 씻어N 2.5 ml의 차가운 MES / 소르비톨 버퍼입니다. 세포 펠렛은 이전처럼 (단계 1.2 참조). 부드럽게 300-400 μL 감기 MES / 소르비톨 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. 세포를 수 시간 동안이 단계에서 얼음에 보관 될 수있다.
확산 2. 염색체
참고 : 염색체 - 확산 중 슬라이드 나 될 때 유리 표면 된 커버는-한다 미리 준비하십시오. 각 슬라이드 또는 커버 슬립이 물에 잠긴해야하고 EtOH로는, 다음 건조시키고, 렌즈 페이퍼로 연마. 염색체가 된 커버에 확산 될 경우, 커버 슬립은 스카치 테이프 나 고무 시멘트와 슬라이드에 부착해야한다. 특별히 언급하지 않는 한, 프로토콜의 나머지 부분은 하나의 슬라이드 나 커버 슬립 확산 설명한다
- 깨끗한 슬라이드의 표면에 P20의 피펫, 피펫 세포 현탁액 20 μL를 사용.
- P200에 피펫을 사용하여, 3 % PFA / 수크로오스 용액 40 μL를 추가하고 부드럽게 혼합 solutio슐 리렌 라인이 사라질 때까지 손으로 슬라이드를 "소용돌이"에 의해 N. 현미경 슬라이드를 놓고 세포에 초점이 있음을 확인합니다. PFA 솔루션은 사용 당일 흄 후드에서 갓 준비를해야합니다.
주 : 관심의 단백질이 이전의 방법에 의해 조사되지 않은 경우, 그 단백질의 보존이 정착 조건에 민감인지 확인 (2) 및 4 % PFA를 포함하는 용액을 사용하여 추가 슬라이드를 준비하는 것이 바람직하다. 4 % PFA / 수크로오스 용액은 미세 소관 연관 튜 불린을 시각화 바람직한 경우에 사용된다. 높은 정착 농도의 단점은 염색체가 될 것입니다 "underspread,"2 % PFA는 "underspread"염색체를 생성하는 경향이있다. - P200의 피펫을 사용하여, 완전히 가능한 한 솔루션을 혼합하기 전에 소용돌이, 타이머를 시작, 1 % Lipsol의 80 μl를 추가합니다. Lipsol를 사용할 수없는 경우, 80 μL 1 % NP40 80 μL의 DH 2 O가 될 수있다(그림 2를 대표 결과를 참조) 교체.
- 슬라이드마다 15 초 소용돌이 조심스럽게 부드럽게 세포를보십시오. 세포의 약 80 %가 용해되면, 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거, 타이머를 중지 PFA / 자당 용액 80 μl를 추가하고, 소용돌이 혼합 (사라). 용해는 타이머를 시작한 후 30 사이에 90 초에서 발생한다.
주 : 여러 슬라이드 거의 동시에 용해를 보여 주면, 하나 결국 슬라이드의 나머지 현미경 모니터링을 생략하고 단순히 신중 lipsol 및 고착성의 최종 분취 량의 첨가의 첨가 기간을 사이에 시간이있다. 동일한 샘플에서 여러 슬라이드를 준비 할 때 그러나,이 지름길은 신뢰할 수있다. 다른 슬라이드가 서로 다른 시간에 촬영 한 샘플이나 다른 문화에서 준비 때 현미경으로 각 샘플의 용해를 모니터링하는 것이 가장 좋습니다. - 깨끗하고 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 전체 unfrosted SURFAC에 걸쳐 액체를 확산「웅덩이」의 메 니스 커스 아래에 있지만, 즉 슬라이드 자체의 표면 위에 유지 깨끗한 목장 일회용 피펫의 측면을 사용하여 슬라이드의 전자. 피펫과 슬라이드의 표면을 "긁어"하지 않습니다. 샘플의 오염을 방지하기 위해 다른 슬라이드에 피펫을 재사용하지 마십시오.
- 흄 후드에서 하룻밤 건조 슬라이드를 남겨주세요. 불용 성분은 핵 슬라이드 표면에 정착하고 결합한다. 많은 실험에서, 건조 단계를위한 공간의 사용을 계획하는 것이 중요하다.
- 건조 후에, 최적의 결과는 같은 날 면역 단계로 진행하여 획득된다. 그러나, 건조 수크로오스 용액을 동결 샘플을 허용 "꿀"의 확산 염색체를 내장 : 슬라이드는 슬라이드 플라스틱 상자로 옮기고 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
3. 면역 염색
- 30 초 동안 0.2 % 사진 - 플로의 딥 슬라이드. 꿀을 제거합니다. 에 린 슬라이드모서리, 가장자리는 종이 타월에 쉬고, 잔류 포토 플로를 제거합니다.
- 5 분 1X TBS에서 딥 슬라이드 씻어. 가장자리에 슬라이드를 기대어으로 물기를 제거하지만, 그들을 건조하게하지 않습니다.
- 면을 위로, 피펫 300 μL TBS / BSA 슬라이드의 unfrosted 부분에서 슬라이드에 프로스트 슬라이드를 놓습니다.
- 15 분 동안 실온에서 습기 챔버에 품어. (포화 종이 타월로 천공 된 금속판 또는 플라스틱 슬라이드 상자에서 물 포화 종이 타올 늘어서 대형 플라스틱 용기).
- 종이 타월에 슬라이드의 짧은 가장자리 휴식 (예 : 테스트 튜브 랙 등) 적절한 지원에 대한 슬라이드를 기대어으로 슬라이드를 배출합니다. 표면이 건조하지 않도록하십시오.
- 즉시 차 항체의 적절한 희석을 포함하는 TBS / BSA 버퍼의 80 μl를 적용합니다. 항체가 제한되어있는 경우, 40 μL와 22 X 22mm의 coverslip에 사용합니다. 조 토끼 혈청의 경우, 이는 전형적으로 1/50 1/500 희석 사이이다.
노트:새로운 항체 제제에 적정을 수행합니다. 배경 위의 높은 신호를 산출 가장 묽은 준비가 선택됩니다. 사전 면역 혈청으로 염색해야한다 배경 염색의 레벨에 맞는 제어하기 위해, 핵은 해당 삭제 돌연변이 균주 및 / 또는 중복 슬라이드에서 준비를해야합니다. - 거품을 피하는 슬라이드에 광택 22 X 50mm의 coverslip에 배치합니다. 하나의 짧은 가장자리 근처에 위치에 긴 가장자리를 따라 엄지 손가락과 검지 손가락 사이의 커버 슬립을 개최하여이 작업을 수행합니다. 30 °의 각도로 커버 슬립을 잡고 그냥 "웅덩이"슬라이드의 프로스트 지역에 가장 가까운 가장자리 안쪽 슬라이드에 닿을 때까지 손가락의 짧은 가장자리 먼이 저하되고, 슬라이드. 그런 다음 천천히 슬라이드 터치 벤치를 잡고 손가락까지 부드러운 동작으로 커버 슬립을 절감하고 놓습니다. 이 땅을 한 번 커버 슬립의 위치를 조정하지 마십시오.
참고 : 염색체 스프레드가 준비 되었다면부착 된 커버 (보다는 직접에 슬라이드의 표면),이 샘플 커버 슬립은 염색 및 세척 단계에 걸쳐 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다. 추가 커버 슬립은 염색 후 폐기시 균일 항체 용액을 분배하는 샘플 커버 슬립 위에 배치 될 것이다. - 밀봉 된 습기 챔버에 넣어 슬라이드 및 4 ℃에서 밤새 품어.
- 유리 슬라이드 염색 랙에 프로스트 에지 전송에게 슬라이드를 잡고 TBS를 포함하는 염색 항아리에 잠수함.
- 부드럽게 커버 슬립을 제거하기 위해 위 아래로 슬라이드를 찍어. 이 작업을 수행하기 위해 너무 많은 힘을 사용하지 않도록하십시오. TBS에서 침수에 의해 10 분 2 배 슬라이드를 씻으십시오. 랙에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 가장자리를 터치하여 초과 액체를 배출. 표면 건조하게하지 마십시오.
- 부드러운 조명 아래에서 작업을 즉시 80 μL TBS / BSA는 형광 색소 결합 된 이차 항체 (또는 22 X 22mm의 coverslip에 40 μL)의 1 / 1,000 배 희석액을 포함하는 추가합니다. 광고그리고 이전과 개발 커버 슬립은 어둠 속에서 습한 챔버에서 2 시간 동안 4 ° C에서 품어.
- 이전으로 된 커버를 제거 슬라이드를 배출하고, 어둠 속에서 1 ~ 2 시간 동안 자연 건조에 표면을 할 수 있습니다. 이전과 종이 타월에 엎드려서 슬라이드.
참고 : 확산하는 것은 장착 커버 슬립에 수행 된 경우, 건조하기 전에 슬라이드에서 커버 슬립을 분리합니다. 이전 단계에서 설명한 바와 같이 슬라이드의 커버 슬립을 건조한다. - 부드러운 조명 아래에서 작업, DAPI (세 10 μL 방울)를 포함하는 매체를 장착 약 30 μl를 추가 한 다음 조심스럽게 커버 슬립을 낮 춥니 다. 스프레드가 된 커버에있는 경우, 깨끗한 슬라이드에 장착 매체의 방울을 배치하고 슬라이드에, 아래로 커버 슬립, 염색체 측을 내립니다.
- 여전히 부드러운 조명 아래, 정착 분명 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 coverslip에 대한 2 분을 기다립니다. 평면 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다.
참고 : STED 현미경, 연장 금으로 마운트합니다. 연장 금의 30 μl를 사용하여및 DAPI없이 하룻밤 치료 할 수 있습니다. 매니큐어로 밀봉하는 것은 불필요하다. - 40 100X 목적은 DAPI가 초점을위한 적절한 설정 필터를 사용하여와 위드 표면 형광 현미경으로보기 슬라이드. 선택적으로 몇 주 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다. 냉동하지 마십시오.
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Representative Results
확산 핵의 모양은 매우 염색체 고정 및 드 압축 사이의 균형에 따라 달라집니다. 시약이 적절하게 균형 때에도 염색체 디 응집도의 변동 및 / 또는 다른 슬라이드 간 동일한 슬라이드의 상이한 영역에서 발생할 수있다. 화상 해석되기 전에 따라서, 슬라이드의 소정 영역에 확산의 품질을 평가한다.
'전면 도포'와 'underspreading "의 효과는 감수 분열 재조합 단백질에 대한 항체를 사용하여 설명 될 수있다. 그림 1에서 감수 핵은 DAPI와 DNA에 대한 염색이 진핵 가닥 교환 단백질 RAD51 및 Dmc1 및 카운터에 대한 면역 염색 더블 있습니다. 최적 확산 핵의 두 가지 예는도 1a에 도시되어있다.도 1b는 두 underspread 핵에 퍼지 핵도 1C 예의 예를 도시한다. 노트RAD51 및 Dmc1의 적은 초점이 제대로 핵 확산에 비해 이상과 underspread 핵 모두에서 관찰됩니다. 시료가 충분히 평탄하지 않기 때문에 underspread 핵의 경우, 어떤 초점이 초점이 있습니다. 또한, 항원 접근성은 모든 초점 검출의 실패에 기여할 수있다. 또한, 확산의 작은 직경은 근접한 구조의 해상도를 배제 할 수있다. 핵에 퍼지의 경우, 단백질이 부족 고정 및 / 또는 과도한 세제 처리 손실 될 수있다.
표준 방법의 변형 Lipsol의 사용을 피할 수있다. Loidl 등의 알에 의해 기술 확산 방법의 원래 버전. Lipsol, 타당성 실험실 유리 세제 (1)을 사용한다. 이 세제가 현재 염색체 여러 실험실에서 확산을 위해 사용되지만, 원래의 제제는 상업적으로 더 이상 사용할 수없는 그 이름과 현재 시판 제품은 재 공식화되었다. Furthermore, Lipsol 원래 공식은 (프란츠 클라인, 개인 통신)도 사용할 수 없습니다. 이러한 문제점을 극복하기위한 노력에서, 우리는 시판 및 화학적 NP40 세정제가 Lipsol 대신에 사용되는 실험을 수행; 표준 프로토콜의 수정은 감수 핵 RAD51과 Zip1, synaptonemal 복잡한 (그림 2A)의 중심 영역의 구성 요소에 대한 염색 확산하는 실험에 대한 만족스러운 결과를 제공하는 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, DH 2 0의 동일한 부피 Lipsol 용액을 교체 또한 만족스러운 결과 (도 2b)을 수득 하였다. 이러한 결과는 상술 한 확산 방법 Lipsol없이 성공적으로 이용 될 수 있음을 나타낼지라도, 일부 전술 결과 Lipsol의 사용에 의존하고 NP40 또는 H 2 0이 그 대신에 사용되면 재현되지 않을 수있다. 확산 방법 마일 학습 개인GHT 합리적으로 Lipsol 대신에 NP40 및 / 또는 H 2 O를 사용하여 시작을 선택합니다. 문제가 발생하는 경우, 조사원은 중단되기 전에 시약 비축 수득 실험실에서 Lipsol의 분취 량을 요구할 수있다; Lipsol 저렴이고 하나 주문할 수 최소량 수백만 슬라이드를 생성하기에 충분했다.
확산 방법은 수퍼 - 해상도 광 현미경 방법에 사용하기에 적합하다. synaptonemal 복합체는 소자에 결합 된 각각의 루프의 염기와 루프 어레이의 집합으로 자매 염색 분체의 쌍을 조직 각각 2 개의 선형 축 / 측면 요소로 구성된다. Pachytene 염색체 synaptonemal 착체의 중앙 영역을 형성하는 단백질에 의해 100nm의 거리에 평행하게 유지 횡 요소의 쌍을 synapsed있다. 이들 한 쌍의 측 방향 엘리먼트는 종래의 위드 표면 형광 현미경에 의해 해결 될 수 있지만, 슈퍼 resolu에 의해 해결 될 수있다기 방법. 그림 3에서, pachytene 핵는이 그림 2의 실험에 사용 Zip1 단백질 같은 항체로 염색되어 표시됩니다. 샘플도 red1라면 단백질, 축 / 측면 요소의 구성 요소에 대한 염색. 결과 Zip1 항체 긴 알파 나선이 횡 요소 결합 영역 사이에있는 영역을 코일을 코일보다는 Zip1의 횡 요소 결합 영역을 인식하는 것으로 나타났다. 따라서,이 항체 Zip1 관찰 염색 패턴은 한 쌍의 측 방향 소자의 병렬 경로를 보여준다. 측 방향 엘리먼트 따라 red1라고 병소의 분포 Zip1 병소에 비해 상대적으로 부족한이지만 이중 염색법은 병소 red1라고 일반적 Zip1 병소에 의해 정의 된 선형 경로 근처에 놓여 있음을 보여준다. 이러한 결과는 동일한 확산 방법은 전자 현미경에 의한 분석 용 샘플을 제조하는데 사용되었던 이전의 연구와 일치한다; synaptonemal 완의 노사정 구조렉스는 확산 과정 동안 유지됩니다. 도 3에 도시 된 이미지는 STED 현미경 (9)에 의해 생성되었다.
그림 1 : 전파 핵의 예 Dmc1 (녹색), RAD51 (적색), 및 DNA에 대한 염색 감수 핵 (DAPI, 파란색).. 바 = 1 μm의. (A) 최적화 확산 핵이 예. (B) underspread 핵의 예. (C)에 퍼지 핵의 두 가지 예. 왼쪽 예에서는 상부가 퍼졌다되는 핵이다.
그림 2 : Lipsol를 사용하지 않고 준비 감수 핵 단계에서 감수 핵 RAD51 (빨간색)에 대한 염색하여 표시된 확산.Zip1 (녹색), 및 DNA (DAPI 청색). pachynema에 leptonema의 세포 전환으로 발생하는 염색체 압축은 크게 보존되어 있습니다.
그림 3 : STED 현미경을 통해 synaptonemal 단지의 시각화 Zip1 (녹색)과 red1라고 (빨간색)에 대한 스테인드 pachytene 핵.. 데이터는 측정 된 STED의 PSF와 리처드슨 - 루시 모델을 사용하여 100 반복을 실행 DeconvolutionLab ImageJ에 플러그인 (10)를 사용하여 처리 하였다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75x25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
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- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
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