Surface Sprer og Farging av gjær Kromosomer

Introduction

Den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae gir mange fordeler for studier av molekylære mekanismer for biologiske prosesser, herunder studiet av proteiner som kontrollerer kromosom funksjon. Selv om det er velkjent fordeler ved spirende gjær for genetiske, molekylære og biokjemiske studier er cytologiske undersøkelser av fordelingen av proteinene i cellens kjerne kompliseres av sin lille størrelse. Den typiske gjær kjernen har en diameter på mindre enn en mikron, som bare er omtrent fem ganger oppløsning grensen av synlig lys på. Således kan mengden av informasjon om fordeling av kjerneproteiner som kan oppnås fra konvensjonell farging eller ved hjelp av fluorescerende protein koder, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP), er begrenset. En nyttig måte å karakterisere subnuclear fordeling av proteiner er kromosom overflatespredning. Denne fremgangsmåten involverer fjerning av celleveggen, forstyrre celle og nukleære membraner, og enllowing de uløselige innholdet i kjernen til å slå seg ned på overflaten til et objektglass. Disse uoppløselige komponenter inkluderer atom matrise og kromosomene. I tillegg til å tillate fjernelse av oppløselige atominnhold, noe som forbedrer evnen til å detektere kromatin bundne proteiner, kromosomet sprer metode fører til betydelig dekompresjon av kromosomer slik at spredningen kjerner har diameter på rundt 3 til 5 mikrometer (for diploide meiotisk kjerner) og 2 til 3 pm for diploide mitotiske kjerner. Dette dekompresjon tillater påvisning av kjernekonstruksjonen som er relativt vanskelig eller umulig å løse i intakte kjerner.

En åpenbar ulempe til kromosom spredning er muligheten for at sprednings prosedyren kan helt eller delvis forstyrre strukturen av interesse. Av spesiell bekymring er at et spesielt kromosom bundet protein kan ha gått tapt som følge av spredning prosedyren. Dette potensialet komplikasjon should holdes i bakhodet når man skal tolke data. Et eksempel på et protein som er følsom for sprednings prosedyren er beta-tubulin. Under noen forhold, spindelen, som består hovedsakelig av tubulin, er bevart under spredning ^3. Visualisering av spindelen er ofte nyttig å iscenesette kjerner av interesse. Imidlertid visualisere tubulin krever behandling med en høy konsentrasjon bindemiddel; Spindlene går tapt under de standardbetingelser som er beskrevet nedenfor. Dette eksempel illustrerer at, når analysere fordelingen av en tidligere uncharacterized protein, er det viktig å variere konsentrasjonen av fiksativ for å bestemme hvor følsomt protein er i en slik variasjon. Til tross for bekymring om effekten av spredningsforholdene på kromosom struktur, har nytte og effekt av å spre metoden blitt vist i mange sammenhenger, og har bred anvendelse i karakterisering av mitotisk og, spesielt meiotisk celler ^4-7.

Two sprer metoder har blitt brukt mye. Den første av disse metoder, er utviklet av Dresser og Giroux ^8, unngår bruk av detergent, og kan gi spredt preparater som synes å ha forholdsvis godt bevarte kromosom morfologi når farget for DNA-spesifikke fargestoff DAPI. Imidlertid er denne fremgangsmåte forholdsvis vanskelig å perfeksjonere og kvaliteten på spredningen kjerner varierer dramatisk når en region av et lysbilde er i forhold til andre områder. Dette problemet kan komplisere kvantitative tilnærminger som involverer bildebehandling mange uselekterte kjerner fra ett lysbilde for å unngå datainnsamling bias. Den andre kromosomet sprer metoden, utviklet av Loidl og Klein ^1, innebærer balansering fiksering av paraformaldehyde, med lyse og kromatin dekompresjon fremmet av et rengjøringsmiddel. Når den er riktig utført, gir denne metoden svært reproduserbare resultater med mindre region-til-regionen variasjon i forhold til Dresser og Giroux metode. Denne presentasjonen fokuserer på en Modified versjon av fremgangsmåten ifølge Loidl og Klein, på grunn av dens pålitelighet og enkelhet.

Kromosom spredning er ikke komplisert eller tidkrevende; opp til 100 lysbilder kan fremstilles for farging på en enkelt dag. Videre kan spre forberedelsene oppbevares i fryseren i årene før farging, og dermed laboratorier kan utvikle et oppbevaringssted for frosne kromosom oppslag som kan brukes når nye biologiske oppstår spørsmål eller nye Fargingsreagensmidlene blir tilgjengelige.

Kromosomet spredning metode som er mest vanlig brukt i kombinasjon med immunfarging og fluorescens mikroskopi Widefield, men det er også mulig å fremstille lysbilder for super-oppløsning lette mikroskopiske metoder som stimulert emisjon uttømming (STED) mikroskopi.

Protocol

MERK: Noen trinnene i protokollen under kreve å jobbe i et rent avtrekkshette. I tillegg er fremgangsmåten krever en gjær tetrad disseksjon mikroskop utstyrt med en 10X lang arbeidsavstand formål å overvåke spheroplasting. Mikroskopet bør settes opp i panseret på forhånd. Fjern mikromanipluatoren arm og plate holderen fra omfanget og plassere disse elementene på et trygt sted borte fra arbeidsområdet.

1. Fremstilling av sfæroplaster

1. Grow gjær henhold ønskede forhold. Bruker omtrent 2 x 10 ⁸ celler for hver prøve, for eksempel 4 ml av en kultur på OD600 = 1,4 5 x 10 ⁷ celler / ml. Selv om øyeblikkelig behandling av prøver kan være å foretrekke i noen tilfeller, for de fleste anvendelser, celle alikvoter kan lagres på is i opptil 8 timer før de blir behandlet.
2. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugerør og spinne i en klinisk sentrifuge ved innstilling 5 (2345 opm / 857,5 x g) i 3 minutter for å pelletere cellene. Dekanter medium ta vare for ikke å miste celler fra pelleten. Forsiktig resuspender cellene i en ml ZK buffer og deretter legge til 40 mL 1 M dithiothreitol (DTT). Inkuber 2 min med forsiktig omrøring. Pellet celler som før (se trinn 1.2).
3. Resuspender pellets i en ml ZK buffer. Tilsett 5 ul av en ferskt fremstilt løsning av zymolyase 100T som er blitt grundig blandet. Inkuber i 20-30 min ved 30 ° C for å fjerne celleveggen, og produserer sfæroplaster.
4. Analysere en 10 pl dråpe av cellesuspensjonen på et objektglass for å bestemme om spheroplasting er fullført. Celler så under disseksjon mikroskop uten dekkglass. Celler som skal vises oppblåst og rund i stedet for svakt avlange og bør lyserer etter tilsetning av 20 ul vann. Dersom cellene ikke klarer å lyse, returnere prøven til 30 ° C og re-assay hvert 10 min inntil vannet indusert lyse kan lett observeres. Pellet celler som før (se trinn 1.2).
5. Forsiktig resuspender og vaske cellepellet jegn 2,5 ml kaldt MES / sorbitol buffer. Pellet celler som før (se trinn 1.2). Forsiktig resuspender cellepelleten i 300-400 ul kald MES / sorbitol buffer. Celler kan holdes på is på dette stadium i flere timer.

2. Chromosome Sprer

MERK: glassflater hvorpå kromosomer vil bli spredt-enten lysbilder eller dekk-bør være forberedt på forhånd. Hver side eller dekkglass bør senkes i vann, deretter EtOH, deretter tørke, og polert med linsepapir. Hvis kromosomene vil bli spredt på dekkglass, bør dekkglass festes til et lysbilde med Scotch tape eller gummi sement. Med mindre annet er nevnt, vil resten av protokollen beskriver spredning på enten en side eller dekk

1. Ved hjelp av en pipette P20, pipette 20 ul av cellesuspensjonen på overflaten av en ren lysbilde.
2. Ved hjelp av en P200 pipette, tilsett 40 mL av 3% PFA / sukroseløsning og forsiktig blande løsning;n av "virvler" raset med hånden inntil Schlieren linjene forsvinner. Plasser skyve under mikroskop og bekrefter at cellene er i fokus. PFA Løsningen bør være nylaget i avtrekksskap på dagen i bruk.
   MERK: Hvis proteinet av interesse ikke er blitt undersøkt ved hjelp av metoden tidligere, er det tilrådelig å fremstille ytterligere lysbilder ved hjelp av løsninger som inneholder 2 og 4% PFA å bestemme om retensjon av proteinet er følsom for fikseringsforhold. En 4% PFA / sukroseløsning brukes i tilfeller hvor det er ønskelig å visual forbundet tubulin mikrotubuli. Ulempen med den høyere konsentrasjonen er fikser at kromosomene vil være "underspread," 2% PFA har også en tendens til å gi "underspread" kromosomer.
3. Ved hjelp av en P200 pipette, tilsett 80 mL av 1% Lipsol, virvle som før å blande løsninger så fullstendig som mulig, starter en tidtaker. Dersom Lipsol ikke er tilgjengelig, kan 80 pl 1% NP40 eller 80 ul dH ₂ O blierstattes (se Representative Resultater, figur 2).
4. Se cellene nøye og forsiktig virvel raset hvert 15 sek. Når omtrent 80% av cellene er lysert (borte) vil stoppe tidtakeren, umiddelbart fjerne lysbildet fra mikroskopet, tilsett 80 mL av PFA / sukroseløsning, og virvel å blande. Lysis bør skje fra mellom 30 og 90 sekunder etter start tidtakeren.
   MERK: Hvis flere sider viser lysis på omtrent samme tid, kan man eventuelt utelate mikroskopisk overvåking for resten av lysbildene og bare forsiktig tidsperioden mellom tilsetningen av lipsol og tilsetning av den siste porsjon av fiksativ. Men dette er snarveien eneste pålitelige når du forbereder flere lysbilder fra den samme prøven. Det er best å overvåke lysis av hver prøve mikroskopisk når ulike sider blir fremstilt fra prøver som er tatt på forskjellige tidspunkter, eller fra forskjellige kulturer.
5. Plasser lysbildet på en ren flate og spre væsken over hele unfrosted surface av sleiden ved hjelp av på siden av en ren, engangs beite pipette holdes under menisken av "dammen", men over overflaten av selve glide, f.eks. ikke "rake" overflate av objektglasset med pipette. Ikke bruk pipette på ulike sider for å unngå forurensning av prøvene.
6. La lysbildene tørke over natten i avtrekksskap. Uløselige kjernefysiske komponenter vil bosette på glideflate og binder seg til det. For store eksperimenter, planlegger bruk av plass til tørketrinnet er viktig.
7. Når tørket, blir optimale resultater oppnås ved å komme videre til farging trinnet på samme dag. Imidlertid bygger de tørkede sukroseløsning spredningen kromosomene i en «honning» som tillater frysing av prøver: slides, kan overføres til en plastglideboks og lagret ved -20 ° C i flere år.

3. Farging

1. Dypp lysbilder i 0,2% Photo-Flo til 30 sek. å fjerne honning. Lean lysbilder påen kant, med kanten hviler på et papirhåndkle for å fjerne gjenværende foto-Flo.
2. Dypp lysbilder i 1x TBS for 5 min å vaske. Fjern overflødig væske ved å lene lysbilder på en kant, men ikke la dem tørke ut.
3. Lå lysbilder frostet siden opp, pipette 300 mL TBS / BSA på gli over unfrosted delen av raset.
4. Inkuber i et fuktig kammer ved RT i 15 min. (Stor plastbeholder foret med vannmettet tørkepapir under en perforert metallplate eller plastsklie boks med mettet tørkepapir).
5. Renne lysbilder ved å hvile en kort kanten av rasgropa på et papirhåndkle og lener raset mot en passende støtte (for eksempel et reagensrør stativ). Ikke la overflaten tørke.
6. Umiddelbart anvende 80 ul TBS / BSA buffer inneholdende den passende fortynning av primært antistoff. Hvis antistoff er begrensende, bruker 40 ul og en 22 x 22 mm dekkglass. For råolje kaninserum, dette er typisk mellom en 1/50 og 1/500 fortynning.
   NOTAT:Utfør titreringer for nye antistoffpreparater. Den mest fortynnede preparatet som gir høyt signal over bakgrunnen er valgt. For å kontrollere for nivået av bakgrunnsfarging skal kjerner fremstilles fra det passende delesjonsmutant-stammen og / eller dupliserte objektglass bør farget med pre-immunserum.
7. Plasser en polert 22 x 50 mm dekkglass på lysbildet unngå bobler. Gjør dette ved å holde dekkglass mellom tommelen og pekefingeren langs langsiden på posisjoner nær den ene kortsiden. Holder dekkglass i en 30 graders vinkel i forhold til å gli, kortsiden lengst fra fingrene senkes til den hviler på lysbildet rett innenfor kanten av "dammen" nærmest frostet regionen i raset. Så sakte senke dekkglass i en jevn bevegelse inntil fingrene holder sklie berøring benken, og slipp. Ikke forsøk å justere plasseringen av dekk når den lander.
   MERK: Hvis kromosom sprer var forberedt påFestet Dekkglass (i stedet for direkte på overflaten av objektglass), vil denne prøve dekk forblir festet til sleiden gjennom beising og vasketrinn. En ytterligere dekk vil bli plassert på toppen av prøven dekkglass for å fordele antistoffløsning under beising og deretter kastes.
8. Plasser glir i en forseglet fuktig kammer og inkuber over natten ved 4 ° C.
9. Holder frostet kanten overføre lysbilder til et glass slide farging rack og senk i en farge krukke som inneholder TBS.
10. Forsiktig dyppe raset opp og ned for å fjerne dekkglass. Prøv å ikke bruke for mye kraft til å gjøre dette. Vask lysbildene 2x 10 min ved å senke i TBS. Fjern lysbilder fra stativet og drenere overflødig væske ved å berøre kanten til papirhåndkle. Ikke la overflaten tørke.
11. Arbeider under dempet lys, straks legge 80 mL TBS / BSA som inneholder en 1/1000 fold fortynning av fluorokromkonjugerte konjugert sekundært antistoff (eller 40 ml med en 22 x 22 mm dekkglass). Add dekkglass som før, og inkuber ved 4 ° C i 2 timer i det fuktige kammeret i mørket.
12. Fjern Dekkglass som før, avløp slides, og at overflaten til lufttørke i 1 til 2 timer i mørket. Lean lysbilder på tørkepapir som før.
    MERK: Hvis sprer ble utført på et montert dekkglass, løsne dekkglass fra raset før tørking. Dekk tørkes deretter som beskrevet for lysbilder i forrige trinn.
13. Arbeider under dempet lys, legge til ca 30 mL montering medium som inneholder DAPI (tre 10 mL dråper) og deretter forsiktig senke en dekkglass. Hvis oppslagene er på Dekk, plassere dråpene av montering medium på en ren raset og senke dekkglass, kromosom side ned, på lysbildet.
14. Fortsatt under dempet lys, vent 2 min for dekkglass å bosette og forsegle kantene av dekkglass med klar neglelakk. Plasser lysbilder i en flat lysbilde boks.
    MERK: For STED mikroskopi, montere med forlenge Gold. Bruk 30 ul forlenge Golduten DAPI og la det herde over natten. Tetting med neglelakk er unødvendig.
15. Vis lysbilder av widefield epifluorescence mikroskopi med 40 eller 100X objektiv du bruker et filter satt riktig for DAPI å fokusere. Eventuelt lagre raset i mørket ved 4 ° C i flere uker. Må ikke fryses.

Representative Results

Utseendet til spredning kjerner kritisk avhenger av balansen mellom kromosomet fiksering og de-komprimering. Selv når reagensene er riktig balansert, kan variasjoner i graden av kromosom de-komprimering forekommer i ulike regioner av samme lysbilde og / eller mellom ulike sider. Således bør kvaliteten av oppslag i et gitt område av en glide bli vurdert før tolkes bilder.

Effektene av "overspreading" og "underspreading" kan illustreres ved hjelp av antistoffer mot meiotisk rekombinasjon proteiner. I figur 1, meiotisk Kjernene er dobbelt immunofarget for de to eukaryote tråd vekslings proteiner Rad51 og Dmc1 og benke farget for DNA med DAPI. To eksempler på optimalt sprer kjerner er vist i Figur 1A. Figur 1B viser et eksempel på en underspread kjernen og figur 1C eksempler på to bredte kjerner. Notatat færre brennpunktene Rad51 og Dmc1 er observert i både over og underspread kjerner i forhold til skikkelig spre kjerner. I tilfelle av underspread kjerner, noen foci er ute av fokus, fordi prøven ikke er tilstrekkelig flat. I tillegg kan epitope tilgjengelighet bidra til svikt å oppdage alle foci. Videre kan mindre diameter for spredning utelukke oppløsning av tett plasserte strukturer. I tilfelle av bredte kjerner, kan proteinet være tapt på grunn av utilstrekkelig fiksering og / eller overdreven vaskemiddel behandling.

Variasjoner av standardmetoden kan unngå bruk av Lipsol. Den opprinnelige versjon av spredningsmetoden beskrevet av Loidl et al. gjør bruk av Lipsol, en anstendighet laboratorieglass vaskemiddel ^1. Selv om dette vaskemiddel brukes i dag for kromosom sprer seg i mange laboratorier, er den opprinnelige formuleringen ikke lenger kommersielt tilgjengelig og produktet i dag solgt under det navnet har blitt re-formulert. Furthermore, er den opprinnelige formelen for Lipsol heller ikke tilgjengelig (Franz Klein, personlig meddelelse). I et forsøk på å overvinne dette problemet ble det gjennomført forsøk hvor den kommersielt tilgjengelige, og kjemisk definert vaskemiddel NP40 ble anvendt i stedet for Lipsol; denne modifikasjon av standard-protokoll ble funnet å gi tilfredsstillende resultater for et eksperiment som spredte meiotisk kjerner ble farget for Rad51 og Zip1, en ​​komponent av den sentrale regionen av synaptonemal kompleks (figur 2A). Det er interessant å erstatte Lipsol oppløsningen med det samme volum av dH ₂ 0 har også gitt tilfredsstillende resultater (figur 2B). Selv om disse funnene tyder på at spredningsfremgangsmåten beskrevet ovenfor, kan anvendes med hell uten Lipsol, er det mulig at noen av de tidligere beskrevne resultater avhenger av bruken av Lipsol og vil ikke være reproduserbare hvis NP40 eller H ₂ 0 brukes i stedet. En individuell læring spredningsmetode miGHT rimelig velger å begynne med å bruke NP40 og / eller _H2O i stedet for Lipsol. I det tilfelle at man støter på vanskeligheter, kan undersøkeren kreve en alikvot av Lipsol fra et laboratorium som erholdes et lager av reagenset før den ble avbrutt; Lipsol var billig og det minimum en kunne bestille var tilstrekkelig til å generere millioner av lysbilder.

Sprednings metoden er egnet for bruk sammen med super-oppløsning lysmikroskopi metoder. Den synaptonemal Komplekset består av to lineære aksielle / sideelementer som hver organiserer et par av søsterkromatider til et sett med løkke matriser, med undersiden av hver sløyfe er bundet til et element. Pachytene kromosomer har synapsed par av sideelementer som holdes parallelt i en avstand på 100 nm av proteiner som danner den sentrale regionen av synaptonemal komplekset. Disse sammenkoblede sideelementer kan ikke løses ved konvensjonell widefield epifluorescence mikroskopi, men kan løses ved super-vedtaketsjonsmetoder. I figur 3 er en pachytene kjerne vist som er farget med det samme antistoff i Zip1 protein, anvendt for forsøket i figur 2. Prøven ble også farget for Red1 protein, en komponent av aksiale / sideelementer. Resultatet viser at Zip1 antistoffet gjenkjenner det laterale element bindende region av Zip1, snarere enn den langstrakte alfa heliske kveil-spole domene som ligger mellom sideelement bindende regioner. Således kan fargingsmønsteret observert med denne Zip1 antistoff avslører de parallelle banene til de parvise sideelementene. Fordelingen av Red1 foci langs sideelementer er relativt sparsom i forhold til Zip1 foci, men den doble fargemetoden viser at Red1 foci generelt ligge nær de lineære baner definert av Zip1 foci. Disse funn er i overensstemmelse med tidligere arbeid hvor samme spredningsmetoden ble brukt for å fremstille prøver for analyse ved elektronmikroskopi; den tredelte strukturen i synaptonemal komplex beholdes under spredning prosedyren. Bildet vist i figur 3, ble generert ved STED mikros ^9.

Figur 1: Eksempel på spredt kjerner meiotisk kjerner farget for Dmc1 (grønt), Rad51 (rødt), og DNA (DAPI, blå).. Bar = 1 mikrometer. (A) 2 eksempler på optimalt sprer kjerner. (B) Et eksempel på en underspread kjerne. (C) To eksempler på bredte kjerner. Eksempelet til venstre er en kjerne hvor bare den øvre delen er overspread.

Figur 2: meiotisk kjerner fremstilt uten bruk av Lipsol Spre meiotisk kjerner fra stadier indikert farget for Rad51 (rød),.Zip1 (grønn), og DNA (DAPI, blå). Merk at kromosom komprimering som oppstår som celler overgang fra leptonema til pachynema er i stor grad bevart.

Figur 3: Visualisering av synaptonemal komplekset via STED mikros En pachytene nucleus farget for Zip1 (grønn) og Red1 (rød).. Dataene ble behandlet ved hjelp av DeconvolutionLab ImageJ plugin ^ti å kjøre 100 iterasjoner bruker Richardson-Lucy modell med en målt STED PSF.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.