Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura

Introduction

A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens para estudos de mecanismos moleculares de processos biológicos, incluindo o estudo de proteínas que controlam a função cromossoma. Embora existam vantagens bem conhecidas de brotamento de levedura para estudos genéticos, moleculares e bioquímicos, estudos citológicos da distribuição de proteínas no núcleo da célula é complicada pelo seu tamanho pequeno. O núcleo típico de levedura tem um diâmetro de menos de um micron, que é apenas cerca de 5 vezes o limite de resolução da luz visível. Assim, a quantidade de informação sobre a distribuição de proteínas nucleares que pode ser obtido a partir de imunocoloração convencional ou usando as marcas de proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP), é limitada. Uma abordagem útil para caracterizar a distribuição de proteínas é subnuclear superfície cromossoma espalhamento. Esta abordagem envolve a remoção da parede celular, interrompendo celular e membranas nucleares, e umllowing o conteúdo insolúveis do núcleo para assentar sobre a superfície de uma lâmina de microscópio. Estes componentes insolúveis incluem a matriz nuclear e os cromossomas. Além de permitir a remoção do conteúdo nuclear solúveis, o que aumenta a capacidade para detectar proteínas ligadas cromatina, o cromossoma espalhando método resulta em substancial descompressão dos cromossomas de modo a que os núcleos propagação têm diâmetros de cerca de 3 a 5 um (para os núcleos diplóides meióticas) e 2 a 3 mm para núcleos diplóides mitóticas. Isto permite a detecção de descompressão subestrutura nuclear que é relativamente difícil ou impossível de resolver em núcleos intactos.

Uma desvantagem óbvia no cromossoma de espalhamento é a possibilidade de que o processo de espalhamento podem parcialmente ou completamente perturbar a estrutura de interesse. Particularmente preocupante é que um cromossomo ligado proteína particular podem ser perdidos como consequência do processo de propagação. Esta complicação potencial should ser mantido em mente ao interpretar os dados. Um exemplo de uma proteína que é sensível ao procedimento de propagação é o beta-tubulina. Sob algumas condições, o fuso, o qual é composto principalmente de tubulina, é preservada durante o espalhamento ^3. Visualização do fuso é frequentemente útil para encenar núcleos de interesse. No entanto, visualizando tubulina requer tratamento com um fixador de elevada concentração; fusos são perdidos sob as condições padrão descritas abaixo. Este exemplo ilustra que, quando se analisa a distribuição de uma proteína anteriormente não caracterizada, é importante variar a concentração do fixador para determinar a sensibilidade da proteína é referida variação. A despeito da preocupação com o impacto das condições de propagação em estrutura dos cromossomas, a utilidade e o método de alimentação de propagação tem sido demonstrada em muitos contextos e tem ampla utilidade na caracterização de mitose e, especialmente células meióticas ^4-7.

TwO espalhamento métodos têm sido utilizados extensivamente. O primeiro destes métodos, desenvolvidos pela Dresser Giroux e ^8, evita a utilização de detergente e pode produzir preparações propagação que parecem ter morfologia cromossoma relativamente bem preservada quando coradas para o corante de DAPI-ADN específica. No entanto, este método é relativamente difícil e aperfeiçoar a qualidade dos núcleos propagação varia dramaticamente, quando uma região de uma corrediça é comparada com outras regiões. Este problema pode complicar abordagens quantitativas que envolvem imagiologia muitos núcleos não selecionados de um slide para evitar viés de aquisição de dados. O segundo cromossomo método espalhando, desenvolvido pela Loidl e Klein ^1, envolve o equilíbrio de fixação por paraformaldeído, com lise e descompressão cromatina promovido por uma solução de detergente. Quando executado corretamente, este método dá resultados muito reprodutíveis com menos variação de região para região, em comparação com o método Dresser and Giroux. Esta apresentação se concentra em um modified versão do método de Loidl e Klein, por causa da sua fiabilidade e a simplicidade.

Cromossoma propagação não é complicada ou demorada; até 100 lâminas pode ser preparado para a imunocoloração num único dia. Além disso, as preparações de propagação pode ser armazenado no congelador durante anos antes da imunocoloração, e, assim, laboratórios pode desenvolver um repositório de barrar cromossómicas congelados que podem ser usados ​​quando novas perguntas biológicos surgem novos reagentes de coloração ou tornar-se disponíveis.

O método cromossoma espalhamento é mais comummente usado em combinação com imuno fluorescência e microscopia de campo amplo, mas também é possível preparar as lâminas de super-resolução métodos microscópicos de luz, tais como esgotamento de emissão estimulada microscopia (STED).

Protocol

NOTA: Alguns passos do protocolo a seguir exigem a trabalhar em um exaustor limpa. Além disso, o método requer um microscópio de dissecção de levedura tétrade equipado com uma objectiva 10X de longa distância de trabalho para monitorizar spheroplasting. O microscópio deve ser configurada na capa antes do tempo. Retire o braço micromanipulador e suporte da placa do âmbito de aplicação e colocar esses itens em um local seguro longe da área de trabalho.

1. Preparação de Esferoplastos

1. Levedura crescer sob condições desejadas. Use cerca de 2 x 10 ⁸ células para cada amostra, por exemplo, 4 ml de uma cultura em OD600 1,4 = 5 x 10 ⁷ células / ml. Embora o processamento imediato de amostras pode ser preferível em alguns casos, para a maioria das aplicações, alíquotas de células pode ser armazenada em gelo durante até 8 horas antes de ser processado.
2. Transferir suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugação numa centrífuga clínica na posição 5 (2345 rpm / 857,5 xg) durante 3 min para sedimentar as células. Decantar o meio tomando cuidado para não perder as células do sedimento. Suavemente ressuspender as células em 1 ml de tampão ZK e, em seguida, adicionar 40 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT). Incubar 2 min com mistura suave. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2).
3. Suspenda as pelotas em tampão ZK 1 ml. Adicionam-se 5 ul de uma solução preparada de fresco de 100T zimoliase que tenha sido cuidadosamente misturado. Incubar durante 20-30 min a 30 ° C para remover a parede celular e produzir esferoplastos.
4. Dosear uma gota de 10 ul de suspensão de células numa lâmina de microscópio para determinar se spheroplasting é completa. Células vistos sob o microscópio de dissecação, sem uma lamela. As células devem aparecer inchado e volta em vez de ligeiramente oblonga e deve lisar após a adição de 20 l de água. Se as células não conseguem lisar, devolver a amostra a 30 ° C e re-ensaio a cada 10 minutos até que a água de lise induzida é facilmente observado. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2).
5. Volte a suspender suavemente e lavar pellet celular in 2,5 ml MES / tampão sorbitol frio. Células de pellets como antes (veja o passo 1.2). Delicadamente ressuspender pellet celular em 300-400 ul frio MES / tampão sorbitol. As células podem ser mantidas em gelo, nesta fase, por várias horas.

2. Chromosome Espalhando

NOTA: As superfícies de vidro sobre o qual os cromossomos serão distribuídos-quer slides ou lamelas-deve ser preparado antes do tempo. Cada um dos slides ou lamela deve ser submerso em água, seguida de EtOH, depois deixou-se secar, e polido com papel para lentes. Se cromossomos serão distribuídos em lamelas, a lamela deve ser afixada a um slide com fita adesiva ou cimento de borracha. A menos que indicado de outra forma, o restante do protocolo irá descrever espalhamento de cada um slide ou lamela

1. Usando um pipetador P20, pipeta 20 ul de suspensão de células sobre a superfície de uma lâmina limpa.
2. Usando uma pipeta P200, adicionar 40 ul da PFA / solução de sacarose 3% e misture delicadamente o solution por "rodar" o slide com a mão até que as linhas Schlieren desaparecer. Coloque a corrediça sob o microscópio e confirmar que as células estão em foco. A solução PFA deve ser recém-preparado no exaustor de fumos no dia da utilização.
   NOTA: Se a proteína de interesse não foi examinado pelo método anteriormente, é aconselhável preparar lâminas adicionais utilizando soluções que contêm 2 e 4% PFA para determinar se a retenção da proteína é sensível às condições de fixação. Uma solução / sacarose PFA a 4% é utilizado nos casos em que é desejável para visualizar microtúbulos tubulina associados. A desvantagem do fixador concentração mais elevada é que os cromossomas será "underspread", 2% de PFA também tende a produzir cromossomas "underspread".
3. Usando uma pipeta P200, adicionar 80 ul de 1% LIPSOL, redemoinho como antes para misturar soluções tão completamente quanto possível, iniciar um temporizador. Se LIPSOL não está disponível, 80 ul de 1% NP40, ou 80 ul _{de dH2O} pode sersubstituído (ver resultados representativos, Figura 2).
4. Assista as células com cuidado e agite gentilmente o slide a cada 15 segundos. Quando cerca de 80% das células foram lisadas (desaparecido) parar o temporizador, retire imediatamente a lâmina do microscópio, adicionar 80 ul de PFA / solução de sacarose, e agite para misturar. A lise deve ocorrer a partir de entre 30 e 90 segundos após o início do temporizador.
   NOTA: Se várias lâminas mostram lise em aproximadamente o mesmo tempo, pode-se omitir eventualmente monitorização de microscópio, para o restante das lâminas e simplesmente cuidadosamente o tempo entre o período de adição de LIPSOL e adição da aliquota final do fixador. No entanto, este atalho só é confiável quando se prepara vários slides a partir da mesma amostra. É melhor controlar a lise de cada amostra quando microscopicamente diferentes lâminas são preparadas a partir de amostras tomadas a diferentes tempos ou de diferentes culturas.
5. Coloque o slide em uma superfície plana e limpa e espalhar o líquido em todo o surfac unfrostede da lâmina utilizando o lado de um limpa, pipeta descartável Pasto mantido abaixo do menisco de "poça", mas acima da superfície da própria corrediça, isto é. não "acumular" a superfície da lâmina com a pipeta. Não reutilize pipeta em slides diferentes para evitar a contaminação das amostras.
6. Deixe os slides para secar durante a noite na capela. Componentes nucleares insolúveis vai resolver sobre a superfície da lâmina e se ligar a ele. Para grandes experimentos, o planejamento do uso do espaço para a etapa de secagem é importante.
7. Uma vez secos, os melhores resultados são obtidos por progredir para a fase de imunocoloração no mesmo dia. No entanto, a solução de sacarose a seco incorpora os cromossomas espalhados numa "mel" que permite a congelação de amostras: As lâminas podem ser transferidos para uma caixa de corrediça de plástico e armazenado a -20 ° C durante anos.

3. Immunostaining

1. Dip slides em 0,2% Photo-Flo por 30 s. para remover o mel. Lâminas Lean Onuma borda, com a borda que descansa em uma toalha de papel, para remover residual Photo-Flo.
2. Dip slides em 1x TBS por 5 minutos para lavar. Retire o excesso de líquido, inclinando-se lâminas em uma borda, mas não deixá-los secar.
3. Lay lâminas fosco lado de cima, pipeta 300 mL TBS / BSA para o slide em toda a parte unfrosted do slide.
4. Incubar numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 15 min. (Grande recipiente de plástico forrado com água saturada toalhas de papel debaixo de uma placa de metal ou de plástico caixa de lâminas perfuradas com toalhas de papel saturados).
5. Escorra slides, descansando uma margem mais curta do slide em uma toalha de papel e inclinando-se o slide contra um apoio adequado (tal como um rack de tubo de ensaio). Não permita que a superfície para secar.
6. Imediatamente aplicar 80 ul de tampão de TBS / BSA contendo uma diluição adequada de anticorpo primário. Se o anticorpo é limitativo, utilizar 40 ul e uma lamela de 22 mm x 22. Para soro de coelho em bruto, este é, tipicamente, entre uma diluição de 1/50 e 1/500.
   NOTA:Realizar titulações para novas preparações de anticorpos. A preparação mais diluído que gera alto sinal acima do fundo é escolhido. Para controlar o nível de coloração de fundo, os núcleos devem ser preparados a partir da estirpe mutante de deleção adequada e / ou lâminas de duplicados devem ser coradas com soro pré-imune.
7. Coloque um polido 22 x 50 mm lamela na lâmina evitar bolhas. Faça isso, mantendo a lamela entre o polegar eo dedo indicador ao longo da borda longa em posições perto de uma margem curta. Segurando a lamela a um ângulo de 30 ° em relação ao deslize, o mais distante borda curta a partir dos dedos é reduzido até que repousa sobre a corrediça apenas no interior da borda do "poça" mais próximo da região fosco da corrediça. Em seguida, abaixe lentamente a lamela em um movimento suave até que os dedos segurando o toque de slides do banco, e depois solte. Não tente ajustar a posição da lamela uma vez ele cair.
   NOTA: Se os spreads de cromossomos foram preparadas noapostos lamelas (em vez de directamente sobre a superfície de lâminas), esta amostra lamela permanecerá fixada à corrediça ao longo dos passos de coloração e de lavagem. Uma lamela adicional será colocada em cima da lamela amostra para distribuir uniformemente a solução de anticorpo durante a coloração e, em seguida, descartado.
8. Colocar as lâminas em uma câmara de humidade selada e incubar durante a noite a 4 ° C.
9. Segurando a borda transferência fosco os slides para um suporte de coloração lâmina de vidro e submergir em uma tina de coloração contendo TBS.
10. Delicadamente mergulhe o slide para cima e para baixo para remover a lamela. Tente não usar muita força para fazer isso. Lavar as lâminas 2x 10 min por submersão em TBS. Remover as lâminas da cremalheira e drenar o excesso de líquido, tocando a borda toalha de papel. Não deixe que a superfície seca.
11. Trabalhando sob luz difusa, imediatamente adicionar 80 ul TBS / BSA contendo um 1 / 1.000 diluição vezes de anticorpo secundário conjugado fluorocromo (ou 40 ul com uma lamela de 22 x 22 mm). De Anúnciosd lamela como antes e incubar a 4 ° C durante 2 horas na câmara húmida no escuro.
12. Remover lamelas como antes, drenar lâminas, e permita que a superfície secar ao ar durante 1-2 horas no escuro. Lâminas Lean On toalhas de papel como antes.
    NOTA: Se se espalhando foi realizada sobre uma lamela montado, retirar a lamela do diapositivo antes da secagem. As lamelas são em seguida secou-se como descrito para corrediças no passo anterior.
13. Trabalhando sob luz difusa, adicionar cerca de 30 ul de meio contendo DAPI (10 gotas três ul) de montagem e abaixe cuidadosamente a lamela. Se os spreads são em lamelas, coloque as gotas de meio de montagem sobre uma lâmina limpa e reduzir lamela, o lado do cromossomo para baixo, para o slide.
14. Ainda sob luz difusa, espere 2 minutos para lamela para se estabelecer e selar bordas da lamela com unha polonês claro. Colocar as lâminas em uma caixa de slides plana.
    NOTA: Para a microscopia STED, montagem com prolongar Gold. Use 30 ul de prolongar OuroDAPI e sem deixar curar durante a noite. Vedação com unha polonês é desnecessário.
15. Veja as lâminas de microscopia de epifluorescência widefield com 40 ou objetiva 100X, utilizando um filtro adequado para definir DAPI para se concentrar. Opcionalmente armazenar a corrediça no escuro a 4 ° C durante várias semanas. Não congelar.

Representative Results

O aparecimento de propagação núcleos depende criticamente sobre o equilíbrio entre a fixação cromossomo e de compactação. Mesmo quando os reagentes são adequadamente equilibrado, variação no grau de cromossoma de compactação pode ocorrer em diferentes regiões da mesma lâmina e / ou entre as diferentes lâminas. Assim, a qualidade dos spreads em uma determinada região de um slide deve ser avaliada antes imagens são interpretadas.

Os efeitos da "asa" e "underspreading" pode ser ilustrada utilizando anticorpos contra as proteínas de recombinação meiótica. Na Figura 1, os núcleos são meióticas dupla imunocoradas para as duas proteínas de troca de cadeias eucarióticas RAD51 e Dmc1 e contra coradas para ADN com DAPI. Dois exemplos de núcleos optimamente distribuídos está mostrado na Figura 1A. A Figura 1B mostra um exemplo de um núcleo underspread e exemplos Figura 1C de dois núcleos overspread. Notaque menos focos de Rad51 e Dmc1 são observados em ambos os mais núcleos e underspread comparação para espalhar adequadamente núcleos. No caso de núcleos underspread, alguns focos estão fora de foco porque a amostra não é suficientemente lisa. Além disso, a acessibilidade epitopo pode contribuir para a falha na detecção de todos os focos. Além disso, o menor diâmetro da propagação pode obstar resolução de estruturas estreitamente espaçadas. No caso de núcleos povoada, a proteína pode ser perdido por causa da fixação insuficiente e / ou tratamento com detergente excessiva.

Variações do método padrão pode evitar o uso de LIPSOL. A versão original do método descrito por espalhar Loidl et al. faz uso de LIPSOL, um laboratório de decoro copos detergente ^1. Embora esse detergente é usado atualmente para o cromossoma espalhando em muitos laboratórios, a formulação original já não está disponível comercialmente eo produto vendido atualmente sob esse nome tem sido re-formulada. Furthermore, a fórmula original para LIPSOL também não está disponível (Franz Klein, comunicação pessoal). Em um esforço para superar este problema, realizamos experimentos em que o detergente NP40 comercialmente disponíveis e química definida foi usado no lugar de LIPSOL; essa modificação do protocolo padrão foi encontrado para dar resultados satisfatórios para uma experiência em que se espalhou núcleos meióticas foram coradas para Rad51 e ZIP1, um componente da região central da sinaptonêmico complexo (Figura 2A). Curiosamente, substituindo a solução LIPSOL com o mesmo volume de dH ₂ 0 também deu resultados satisfatórios (Figura 2B). Embora estes resultados indicam que o método de difusão acima descrito pode ser empregue com sucesso sem LIPSOL, é possível que alguns resultados anteriormente descritos dependem da utilização de LIPSOL e não são reprodutíveis se NP40 ou H ₂ 0 é usada em seu lugar. Um indivíduo aprender o método de espalhamento milutar razoavelmente optar por começar usando NP40 e / ou H ₂ O em lugar de LIPSOL. No caso de surgirem dificuldades, o investigador pode requerer-se uma alíquota de LIPSOL de um laboratório de que obtido um armazenagem do reagente, antes de ser descontinuado; LIPSOL foi barato eo montante mínimo um poderia pedir foi suficiente para gerar milhões de slides.

O método de propagação é adequado para utilização com super-resolução métodos de microscopia de luz. O complexo é composto por dois sinaptonêmico axiais / elementos laterais lineares cada um dos quais organiza um par de cromatídeos irmãos num conjunto de matrizes de ansa, com a base de cada circuito ligado a um elemento. Cromossomas pachytène ter synapsed pares de elementos laterais realizadas em paralelo a uma distância de 100 nm por proteínas que formam a região central do complexo sinaptonêmico. Estes elementos laterais emparelhadas não pode ser resolvido por meio de microscopia de epifluorescência widefield convencional, mas pode ser resolvido por super-resolumétodos ção. Na Figura 3, um núcleo paqu�eno está demonstrado que é corado com o mesmo anticorpo para a proteína ZIP1, utilizados na experiência na Figura 2. A amostra foi também coradas para proteína Red1, um componente de axiais / elementos laterais. O resultado revelou que o anticorpo reconhece ZIP1 a região de ligação ao elemento lateral da ZIP1, em vez do alfa helicoidal alongado em espiral enrolada do domínio que se encontra entre as regiões de ligação dos elementos laterais. Assim, o padrão de coloração observado com este anticorpo ZIP1 revela os caminhos paralelos de elementos laterais emparelhadas. A distribuição de Red1 focos juntamente elementos laterais é relativamente escasso em comparação com ZIP1 focos, mas o método de coloração dupla mostra que Red1 focos geralmente se encontram perto os caminhos lineares definidas por ZIP1 focos. Estes resultados são consistentes com trabalhos anteriores em que o mesmo método de difusão foi utilizada para preparar as amostras para análise por microscopia electrónica; a estrutura tripartida do sinaptonêmico compLex é preservada durante o procedimento de disseminação. A imagem mostrada na Figura 3 foi gerado por microscopia STED ^9.

Figura 1: Exemplos de propagação núcleos núcleos meióticos coradas para Dmc1 (verde), Rad51 (vermelho) e DNA (DAPI, azul).. Barra = 1 um. (A) 2 exemplos de núcleos optimamente distribuídos. (B) Um exemplo de um núcleo underspread. (C) Dois exemplos de núcleos povoada. O exemplo da esquerda é um núcleo em que apenas a parte superior está overspread.

Figura 2: núcleos meióticos preparadas sem utilização de LIPSOL Espalhe núcleos das fases meióticas indicado coradas para Rad51 (vermelho),.ZIP1 (verde) e DNA (DAPI, azul). Note-se que a compactação do cromossoma que ocorre como células de transição da leptonema para pachynema é largamente preservada.

Figura 3: Visualização do complexo sinaptonêmico via microscopia STED Um núcleo pachytene coradas para ZIP1 (verde) e Red1 (vermelho).. Os dados foram processados ​​usando o plugin DeconvolutionLab ImageJ ¹⁰ para rodar 100 iterações utilizando o modelo de Richardson-Lucy com um PSF STED medido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymolyase	US Biological	Z1004	Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use.
Lipsol	L.I.P. Ltd	no longer commercially available	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
NP-40	USB	19628	Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.
Tween 20	Sigma	P2287
Slides	Corning	2948-75x25
Standard coverslip	Fisher	12-544-E or 12-540-B
High resolution coverslips	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solution	Kodak	P-7417	Prepare 0.2% (v/v) solution in water.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month.
Primary antibody
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antibody
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber.
Cardboard slide box	Fisher	12-587-10	Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C.
Coplin jar	Fisher	08-816	Use as a wash basin for slides.