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Immunology and Infection

पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक 3 डी मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल Published: October 5, 2015 doi: 10.3791/53084
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1,2
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Department of Medicine, Karolinska Institute

Abstract

क्षय रोग (टीबी) अभी भी दुनिया भर में लोगों के स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा मानती है, और हमें नए उपचार के विकल्प की खोजों रोग तंत्र को समझने और आगे बढ़ने में मदद करने के लिए लागत प्रभावी है लेकिन विश्वसनीय मॉडल के लिए एक की जरूरत है। Monolayers के इन विट्रो सेल संस्कृतियों या सह संस्कृतियों तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण और ऊतक प्रतिक्रियाओं की कमी है। इस के साथ साथ, हम माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एम तपेदिक) के साथ संक्रमण के दौरान होने वाले जटिल घटनाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण हो वादा रखती है जो एक मानव फेफड़े के ऊतकों के इन विट्रो मॉडल में एक अभिनव का वर्णन है। 3 डी ऊतक मॉडल एक झरझरा झिल्ली के शीर्ष पर कोलेजन के एक मैट्रिक्स में सुसंस्कृत हैं जो ऊतक विशेष उपकला कोशिकाओं और fibroblasts के होते हैं। हवा जोखिम होने पर, उपकला कोशिकाओं विभक्त हो जाना और शिखर की ओर से बलगम स्राव करते हैं। मानव प्राथमिक मैक्रोफेज शुरू करके एम से संक्रमित ऊतक मोड के लिए तपेदिकएल, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रमित ऊतक में विस्थापित और टीबी ग्रेन्युलोमा की प्रारंभिक अवस्था है कि फार्म का पता चला है। इन संरचनाओं मौलिक रूप से अलग या आमतौर पर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक पशु मॉडल में नहीं मनाया जाता है जो मानव टीबी, ग्रेन्युलोमा, की अलग विशेषता पुनरावृत्ति। इस organotypic संस्कृति विधि मेजबान सेल रोगज़नक़ बातचीत के स्थानिक और लौकिक सुविधाओं पर निर्णायक जानकारी प्रदान करता है कि 3 डी दृश्य और मजबूत मात्रात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है। साथ में ले ली, फेफड़े के ऊतकों मॉडल टीबी पर अध्ययन के लिए एक physiologically प्रासंगिक ऊतक सूक्ष्म वातावरण प्रदान करता है। इस प्रकार, फेफड़े के ऊतकों मॉडल बुनियादी यंत्रवत और एप्लाइड अध्ययन दोनों के लिए संभावित प्रभाव पड़ता है। महत्वपूर्ण बात है, मॉडल, जिससे फेफड़ों को प्रभावित करने वाले संक्रामक रोगों की एक किस्म मॉडलिंग के लिए इसके उपयोग चौड़ी, जो अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं, के अलावा या हेरफेर की अनुमति देता है।

Introduction

मनुष्यों में संक्रमण, ऊतक सूजन, सेलुलर भर्ती, ऊतक remodeling और ऊतक homeostasis के विनियमन के लिए प्रतिक्रियाओं विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से जुड़े जटिल घटनाओं रहे हैं। इसलिए, इन प्रक्रियाओं को सबसे अच्छा स्थानीय ऊतक वातावरण में अध्ययन कर रहे हैं। इससे पहले, यह मुख्य रूप से प्रयोगात्मक पशु मॉडल का उपयोग संभव हो गया है। वे अक्सर मनुष्यों की तुलना में एक अलग तरीके से रोगजनकों का जवाब और भी रोग 1 का एक अलग कोर्स प्रदर्शित हालांकि, के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रायोगिक पशुओं कई सीमाएं पकड़। इन विट्रो फेफड़े के ऊतकों मॉडल में एक मानव मानव फेफड़ों में विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं रखती है।

मानव तपेदिक संक्रमण (टीबी)। माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एम तपेदिक), टीबी की प्रेरणा का एजेंट, जीवाणु फेफड़े dendri से घिरा हुआ है, जहां वायुकोशीय अंतरिक्ष में ले जाया जाता है कि एयरोसोल बूंदों के माध्यम से फेफड़ों तक पहुँचता मुख्य रूप से फेफड़ों को प्रभावित करने के लिए एक बीमारी हैटिक कोशिकाओं और संक्रमण 2,3 करने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप वायुकोशीय मैक्रोफेज। रोगज़नक़ के phagocytosis एक फेगोसोम भीतर बग के compartmentalization की ओर जाता है और आदर्श भक्षककोशिकीय द्वारा निराकरण और रोगज़नक़ की हत्या में यह परिणाम है। एम को उजागर व्यक्तियों के 50% तपेदिक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4 के माध्यम से संक्रमण को खत्म करने में सक्षम माना जाता है। संक्रमण के अन्य परिणामों एक बाद में मंच, अव्यक्त संक्रमण पर या सबसे खराब मामलों पुरानी सक्रिय रोग 5 में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मंजूरी के हैं।

इससे पहले मानव टीबी की पढ़ाई के लिए कोई इन विट्रो ऊतक मॉडल किया गया है। मानव मैक्रोफेज या अन्य परिधीय रक्त कोशिकाओं के एकल सेल संस्कृतियों अक्सर 6.7 इस्तेमाल किया गया है। इस दृष्टिकोण का नुकसान है कि वे एम के संपर्क में एक फेफड़े के ऊतकों में एक साथ काम कर रही विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की गतिशीलता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं यक्ष्मा इन विट्रो मॉडल के लिए एक की जरूरत है। सेल आधारित यहाँ वर्णित विट्रो मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल में मूल रूप से वृक्ष के समान सेल कार्यों 8 पर अध्ययन के लिए हमारे समूह द्वारा स्थापित किया गया था। हम टीबी के अध्ययन के लिए इस विधि ढाल लिया है।

यहाँ प्रस्तुत मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल ऊतक विशेष उपकला कोशिकाओं और fibroblasts 8 के होते हैं। इन कोशिकाओं को एक transwell डालने और सामान्य मानव फेफड़े के ऊतकों (चित्रा 1) दिखने के रूप ढांचे में एक झरझरा झिल्ली के शीर्ष पर कोलेजन के एक मैट्रिक्स में सुसंस्कृत हैं। जब हवा के संपर्क कोशिकाओं शिखर की ओर 8 पर बलगम स्रावित करने के लिए शुरू करते हैं। मानव प्राथमिक मैक्रोफेज दाखिल द्वारा एम से संक्रमित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऊतकों में विस्थापित और टीबी कणिकागुल्मों 9 के प्रारंभिक दौर फार्म कैसे मॉडल को तपेदिक, हम मनाया गया है। यह पहला मानव ऊतक मॉडल Descr हैटीबी के लिए ibed और यह टीबी और फेफड़ों की अन्य बीमारियों के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए एक आशाजनक उपकरण बन गया है। तिथि करने के लिए, हम मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में केवल monocytes और मैक्रोफेज का इस्तेमाल किया है, लेकिन जटिलता के स्तर अतिरिक्त प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं के शामिल किए जाने से बढ़ाया जा सकता है।

चित्र 1
फेफड़े के ऊतकों मॉडल के 1. योजनाबद्ध रूपरेखा चित्रा। (ए) मॉडल एम, मानव फेफड़ों-विशिष्ट उपकला कोशिकाओं से बना है तपेदिक प्राथमिक मैक्रोफेज -infected और लाल रंग लेबल monocytes एक transwell फिल्टर पर तैयार कोलेजन एम्बेडेड fibroblasts पर वरीयता प्राप्त। हवा के लिए ऊतक मॉडल का एक्सपोजर उपकला से अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के उत्पादन, बलगम स्राव और स्तरीकरण शुरू की। इस प्रकार विकसित 3 डी ऊतक मॉडल एम अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है clo कि एक वातावरण में तपेदिक संक्रमणSely एक मानव फेफड़े। (बी) के ऊतक मॉडल की तैयारी में विभिन्न चरणों के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों। (सी) फेफड़ों मॉडल ऊतक अनुभाग की पूरी संरचना जैसा दिखता है। स्केल -। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

नोट: लिंकोपिंग विश्वविद्यालय अस्पताल के ब्लड बैंक में खरीदा स्वस्थ गुमनाम रक्त दाताओं से मानव परिधीय रक्त, स्वीडन इस अध्ययन के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस प्रोटोकॉल 24 मिमी 6 अच्छी तरह से थाली आवेषण के लिए बनाया गया है। दूसरे को अच्छी तरह प्रारूपों के लिए प्रत्यक्ष अनुकूलन के विकास के दौरान दोनों खड़ी है और क्षैतिज ऊतक मॉडल अनुबंध के बाद से सिफारिश नहीं है।

बैक्टीरिया / सेल लाइनों की सामग्री, मीडिया और संस्कृति के 1. तैयारी

  1. बैक्टीरिया की संस्कृति:
    1. माइक्रोबैक्टीरियल तनाव एम बढ़ो 0.05% से युक्त Middlebrook 7H9 माध्यम में अनिवार्यता से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को व्यक्त करने के pFPV2 प्लाज्मिड ले जाने तपेदिक H37Rv, बीच -80, 0.5% ग्लिसरॉल, केनामाइसिन (20 माइक्रोग्राम / एमएल), और (Middlebrook एल्बुमिन, डेक्सट्रोज और Catalase संवर्धन के साथ पूरक Middlebrook एडीसी संवर्धन), 7-10 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: सभी प्रयोगात्मक कदमलाइव विषमय एम एस से जुड़े तपेदिक उपभेदों एक बीएसएल 3 सुविधा में किया जाना चाहिए।
  2. 1x Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) पूरा मध्यम तैयार (1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी HEPES, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड और 10 के साथ पूरक % भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)) गर्मी निष्क्रिय। यह भी एंटीबायोटिक मुक्त DMEM पूरा मध्यम तैयार करें।
  3. 1x न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) पूरा मध्यम तैयार (1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी HEPES, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है और 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS))।
  4. फ़ाइब्रोनेक्टिन / कोलेजन लेपित बोतल (कुल 10 एमएल) की तैयारी:
    1. एक स्वच्छ ट्यूब में पिपेट 8.8 मिलीलीटर बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)। 1 मिलीलीटर गोजातीय सीरम albumin (1 मिलीग्राम / एमएल), 100 μl प्रकार मैं कोलेजन (3 मिलीग्राम / एमएल) गोजातीय और 100 μl पुनः संयोजक हू जोड़ेंआदमी फ़ाइब्रोनेक्टिन (/ एमएल 1 मिलीग्राम)।
    2. ऊपर से नीचे 5 बार ट्यूब बदल कर समाधान मिलाएं। बोतल (एक टी 25 और टी 75 फ्लास्क के लिए 2 मिलीलीटर के लिए 1 मिलीलीटर) एक फ़ाइब्रोनेक्टिन / कोलेजन समाधान के साथ लेपित हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर / ओ एन छोड़ दें। ऊष्मायन के बाद, समाधान निकालने और आरटी पर लेपित बोतल की दुकान।
      नोट: एकत्र समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और तीन बार के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए भंडारण तरल इसे खारिज कर दिया जाना चाहिए, जहां पर ब्राउन (क्रिस्टल के गठन), बारी करने के लिए कारण हो सकता है।
  5. Fibroblasts की संस्कृति:
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में पूरा DMEM में बढ़ने और एमआरसी -5, (एक 14 सप्ताह पुरानी नर भ्रूण के सामान्य फेफड़े के ऊतकों से निकाली गई एक मानव फेफड़े fibroblast सेल लाइन) बनाए रखें। मार्ग 24-26 में fibroblasts का प्रयोग करें और 70-80% मिला हुआ है, जब तक बढ़ता है।
      नोट: बीतने के> 30 पर एमआरसी -5 सेल लाइन आकृति विज्ञान खो देते हैं और ऊतक मॉडल में उपयोग के लिए सिफारिश नहीं है।
  6. उपकला कोशिकाओं की संस्कृति:
    1. 16HBE14o- (16HBE), सामान्य मानव एयरवे epithelia की विभेदित आकृति विज्ञान और समारोह को बरकरार रखे हुए है कि एक अमर मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिका लाइन, (इस डॉ डाइटर Gruenert, माउंट सिय्योन कैंसर केंद्र, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को से एक उपहार था प्राप्त करें संयुक्त राज्य अमेरिका, 10।)। फ़ाइब्रोनेक्टिन / कोलेजन लेपित बोतल में संस्कृति 16HBE कोशिकाओं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में पूरा सदस्य में कोशिकाओं को बनाए रखने।
  7. 5x DMEM की तैयारी
    1. DMEM पाउडर का 13.4 ग्राम और बाँझ आसुत पानी की 150 मिलीलीटर में सोडियम बाइकार्बोनेट की 3.7 ग्राम भंग करके 5x DMEM तैयार करें। 7.3 करने के लिए माध्यम के पीएच को समायोजित 200 मिलीलीटर मात्रा बनाने के लिए और 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग कर इसे फिल्टर। एक बाँझ कंटेनर में फ़िल्टर मध्यम लीजिए और आरटी पर उपयोग करें जब तक संग्रहित।

कोलेजन एम्बेडेड fibroblasts की 2. तैयारी

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में FBS और एल glutamine का पिघलना जमे हुए aliquots।विगलन के बाद बर्फ पर नमूने रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर सोडियम बाइकार्बोनेट (71.2 मिलीग्राम / एमएल) और Gentamicin (50 मिलीग्राम / एमएल) रखें। 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और 4 डिग्री सेल्सियस तक 10 मिलीलीटर बाँझ pipettes पूर्व शांत।
    नोट: (5x DMEM) को छोड़कर सभी सामग्री का इस्तेमाल का उपयोग करने से पहले बर्फ पर ठंडा कर रहे हैं और सभी चरणों बर्फ पर प्रदर्शन कर रहे हैं। इस कोलेजन के solidification रोकता के रूप में मैं गोजातीय कोलेजन (1.1 मिलीग्राम / एमएल), ठंड रखा जाना चाहिए टाइप करें।
  2. Fibroblast कोशिकाओं तैयार:
    1. गर्म एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में trypsin और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 पर 10 मिनट के लिए फेफड़ों fibroblasts (एमआरसी -5) कोशिकाओं के साथ पर्याप्त मात्रा में सेते हैं। 1x DMEM पूरा जोड़कर trypsin बेअसर। 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज Aspirate। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पूरा DMEM में 2.3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspend। उपयोग के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  3. पूर्व मिश्रण तैयार करें:
    1. "पूर्व मिश्रण" लेबल एक ट्यूब के लिए निम्न जोड़ें; 3955x DMEM के μl, 40 μl एल Glutamine, 120 μl NaHCO3 (71.2 मिलीग्राम / एमएल), 440 μl एफबीएस, 5 μl Gentamicin (50 मिलीग्राम / एमएल), कुल मात्रा 1,000 μl, तो अच्छी तरह से पूर्व मिश्रण और पर डाल ज़ुल्फ़ बर्फ।
      नोट: दी मात्रा में एक 24 मिमी 6 अच्छी तरह से संस्कृति डालने के लिए कर रहे हैं। सम्मिलित करता है की कुल संख्या के लिए आवश्यक विशिष्ट मात्रा की गणना लेकिन यकीन है कि पर्याप्त है, पूर्व मिश्रण तैयार किया जाता है होना करने के लिए अतिरिक्त एक जोड़ें।
  4. अकोशिकीय कोलेजन मिश्रण तैयार करें:
    1. प्रत्येक संस्कृति के लिए अकोशिकीय कोलेजन मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ें। दिए गए आदेश में बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए निम्न जोड़ें; 1.1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन के 686 μl, 250 μl पूर्व मिश्रण और 1000 μl की कुल मात्रा 64 μl 1x पूरा DMEM। अच्छी तरह से कोई हवाई बुलबुले सुनिश्चित समाधान मिलाएं। तेजी से काम करते हैं और हवा के बुलबुले से बचने के लिए ट्यूब की दीवार पर कोलेजन जोड़ें।
    2. 6 अच्छी तरह से थाली में रखा डालने के लिए अकोशिकीय परत मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ें। डालने के बाहर अच्छी तरह से करने के लिए किसी भी माध्यम जोड़ नहीं है। मेंएक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए cubate। अकोशिकीय मिश्रण किसी भी हवाई बुलबुले के बिना पूरे डालने शामिल किया गया है सुनिश्चित करें।
  5. सेलुलर कोलेजन मिश्रण तैयार करें:
    1. इस क्रम में बर्फ पर रखा एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेलुलर परत के घटकों का मिश्रण; 2 मिलीलीटर कोलेजन, 615 μl पूर्व मिश्रण, 1x पूरा DMEM के 58 μl और 327 μl सेल निलंबन फेफड़े fibroblasts (एमआरसी -5) 3,000 μl के लिए कुल मात्रा को बनाने के लिए। प्रत्येक संस्कृति सेलुलर कोलेजन मिश्रण के 3 मिलीलीटर की आवश्यकता है।
      महत्वपूर्ण कदम: ध्यान से सेल निलंबन के अलावा पहले कोलेजन और Premix मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें। इस fibroblasts पर विषाक्त प्रभाव से बचने के लिए कोलेजन का पीएच बेअसर करेंगे।
    2. अकोशिकीय कोलेजन परत के शीर्ष पर सेलुलर परत (3 एमएल) जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए सेते हैं। तेजी से काम करते हैं और हवा के बुलबुले से बचने के लिए ट्यूब की दीवार पर कोलेजन जोड़ें।
    3. Polymerization के बाद, टी करने के लिए पूरा DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़नेवह (डालने) के तहत 6 अच्छी तरह से थाली के नीचे और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: बहुलकीकरण नहीं होती थी, तो fibroblast-कोलेजन मैट्रिक्स युक्त थाली सम्मिलित करता त्यागने और शुरू फिर से। सबसे संभावित कारण इसके अलावा या ऊपर सूचीबद्ध अभिकर्मकों में से एक की गलत मात्रा में एक त्रुटि है।

तंतुकोशिका-कोलेजन मैट्रिक्स की 3. सतत संस्कृति

  1. ध्यान से एक स्वच्छ संदंश का उपयोग डालने उठा और अच्छी तरह से नीचे से संस्कृति मीडिया महाप्राण। डालने के भीतर 2 मिलीलीटर पूरा DMEM द्वारा अच्छी तरह से पालन किया की तह तक 2 मिलीलीटर पूरा DMEM जोड़ें। इस बाहरी और भीतरी कक्षों के बीच पोषक तत्वों के प्रसार को रोकने के रूप में होगा, डालने के तहत हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें। एक micropipette टिप के साथ हवाई बुलबुले निकालें।
  2. लगभग 5-7 दिनों के लिए संस्कृति मीडिया (अंदर और डालने के नीचे) हर दूसरे दिन और संस्कृति बदलें। डालने से मीडिया को दूर करने में अपना ध्यान रखना। Conta से बचने के लिएfibroblast-कोलेजन मैट्रिक्स के साथ सीटी, थोड़ा एक साफ संदंश का उपयोग डालने झुकाव और डालने दीवारों से मीडिया महाप्राण।
    महत्वपूर्ण कदम: कोलेजन मैट्रिक्स में fibroblasts एक लम्बी फेनोटाइप मिलता है, और कोलेजन, जो तब ठेके फिर से तैयार करना चाहिए। 5-7 दिनों के बारे में, मैट्रिक्स डालने के केंद्र में एक मंच (व्यास में 10-14 मिमी) के रूप में करने के लिए अनुबंधित किया है। अनुबंधित मैट्रिक्स अगले चरण में प्रयोग के लिए तैयार है। Fibroblasts प्रायर (चरण 2.6.1) बोने के लिए कोलेजन के साथ अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं कि यह महत्वपूर्ण है मैट्रिक्स के एक समान संकुचन प्राप्त करने के लिए।

प्रतिरक्षा कोशिकाओं (संक्रमित / असंक्रमित Monocyte-बृहतभक्षककोशिका मिश्रण) 4. सीडिंग

नोट: निम्न प्रयोगात्मक कदम विषमय माइक्रोबैक्टीरिया शामिल है और इसलिए एक बीएसएल 3 सुविधा में किया जाना चाहिए।

  1. प्राथमिक monocytes और मैक्रोफेज की तैयारी:
    1. एक establi का उपयोग कर दाता रक्त से परिधीय रक्त monocytes पृथकप्रोटोकॉल बहाया। ऊतक मॉडल और संस्कृति की स्थापना के रूप में एक ही दिन में monocytes अलग और एम के साथ संक्रमण से पहले लगभग 7 दिनों के लिए मैक्रोफेज में उन्हें अंतर तपेदिक।
      नोट: यह सुनिश्चित करेंगे कि दोनों मैक्रोफेज और अनुबंधित fibroblast-कोलेजन मैट्रिक्स 7 दिन बाद उपलब्ध हैं। इसके अलावा संक्रमित मैक्रोफेज के साथ एक साथ जोड़ दिया जाएगा कि ताजा monocytes अलग।
  2. एम की तैयारी तपेदिक -infected मैक्रोफेज
    1. , 1x पीबीएस एंटीबायोटिक मुक्त पूरा DMEM में 0.05% बीच 80, resuspend युक्त से धो लें, सुसंस्कृत बैक्टीरिया फसल बैक्टीरियल झुरमुटों फैलाने और ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए एक छोटा बाँझ 27 जी सुई के माध्यम से गुजरती हैं।
      नोट: एम पूर्व निर्धारित प्रयोगशाला में ऑप्टिकल घनत्व की इकाई के समकक्ष बनाने तपेदिक कॉलोनी। इस बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए दे देंगे।
    2. साथ 4 घंटे के लिए मैक्रोफेज सेते <उन्हें> एम। संक्रमण की बहुलता (MOI) 10) पर तपेदिक। संक्रमण के बाद, बाह्य बैक्टीरिया को दूर करने के लिए 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें। एम उसी तरह से, लेकिन बिना सभ्य असंक्रमित मैक्रोफेज का उपयोग करें तपेदिक, नियंत्रण के रूप में।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2 मिमी EDTA के साथ इलाज के द्वारा संस्कृति की थाली से मैक्रोफेज को अलग करें और एंटीबायोटिक मुक्त पूरा DMEM में कोशिकाओं resuspended।
  3. Monocytes की लेबलिंग
    नोट: monocytes के अलगाव और लेबलिंग बीएसएल -2 बेंच में प्रदर्शन किया और उसके बाद आगे की प्रक्रिया के लिए बीएसएल 3 सुविधा में लिया जा सकता है।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 5 मिनट के लिए 2 माइक्रोन PKH26 लाल रंग की एक अंतिम एकाग्रता के साथ हौसले से तैयार monocytes (2 10 x 7 कोशिकाओं) दाग। धो 3x 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर एंटीबायोटिक मुक्त पूरा DMEM के साथ कोशिकाओं resuspend और।
  4. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलावा fibroblast-कोलेजन को मैट्रिक्स
    1. एfter fibroblast-कोलेजन मैट्रिक्स की संस्कृति के 5-7 दिन, बाहरी और भीतरी कक्षों से संस्कृति मीडिया महाप्राण और बाहरी कक्ष को पूरा ताजा एंटीबायोटिक मुक्त DMEM के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. एमओ के अनुपात के साथ एक लेबल एककेंद्रकश्वेतकोशिका-बृहतभक्षककोशिका (असंक्रमित / संक्रमित) मिश्रण तैयार करें: MQ (5: 1) 50 μl DMEM में पूरा करें। 50,000 मैक्रोफेज के लिए, 250,000 लेबल monocytes ले।
    3. Fibroblast-कोलेजन मैट्रिक्स के लिए MQ के मिश्रण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में 1 घंटे के लिए सेते: 50 μl एमओ जोड़ें। ऊष्मायन के बाद, धीरे डालने में संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: जोड़ा कोशिकाओं शिथिल संलग्न कर रहे हैं, मीडिया के अलावा धीरे डालने की दीवारों पर जोड़कर धीमी गति से होना चाहिए।

फेफड़े उपकला कोशिकाओं के 5. सीडिंग (16HBE)

नोट: निम्न चरणों का एक बीएसएल 3 सुविधा में किया जाना चाहिए।

  1. बीज फेफड़ों ईMQ-fibroblast-कोलेजन परत: एमओ के शीर्ष पर pithelial कोशिकाओं (16HBE)। इस प्रदर्शन के लिए, पहले (। 2.2.1 के रूप में) trypsin के साथ इलाज से कुप्पी से 16HBE कोशिकाओं को अलग कर देना और एंटीबायोटिक मुक्त DMEM में 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल में resuspend।
  2. अंदर और डालने के बाहर संस्कृति मीडिया Aspirate। तब सम्मिलित बाहर अच्छी तरह से नीचे में पूरा 1.5 मिलीलीटर एंटीबायोटिक मुक्त DMEM जोड़ें।
  3. प्रतिरक्षा सेल fibroblast कोलेजन मैट्रिक्स के शीर्ष पर 16HBE के 50 μl जोड़ें। हुड में 2 मिनट के लिए छोड़ दें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डालने और संस्कृति के भीतर पूरा एंटीबायोटिक मुक्त DMEM के धीरे 2 मिलीलीटर जोड़ें। संस्कृति कदम ऊतक मॉडल में उपकला कोशिकाओं के प्रसार की सुविधा।
    नोट: जोड़ा कोशिकाओं शिथिल संलग्न कर रहे हैं, मीडिया के अलावा डालने की दीवारों के माध्यम से फिसलने से धीमी और कोमल होना चाहिए।

3 डी फेफड़े के 6. एयर-प्रदर्शनआदर्श

नोट: संक्रमित मैक्रोफेज के दिन 5 पद अलावा के बाद, ऊतक मॉडल हवा में उजागर कर रहे हैं और अगले कदम एक बीएसएल 3 सुविधा में किया जाना चाहिए।

  1. अंदर और डालने के बाहर संस्कृति मीडिया Aspirate।
    नोट: इस चरण में supernatants स्रावित कारकों का पता लगाने के लिए एकत्र किया जा सकता है। -70 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, बाँझ फिल्टर और दुकान supernatants।
  2. बाहरी कक्ष में 1.8 मिलीलीटर एंटीबायोटिक मुक्त DMEM पूरा जोड़ें और 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 में सेते हैं। डालने के भीतर संस्कृति मीडिया न जोड़ें।
    नोट: ऊतक मॉडल की एयर उठाने मानव फेफड़े के ऊतकों के लिए ऊतक और शारीरिक समानता को शक्ति प्रदान करता है जो स्तरीकृत epithelia और बलगम स्राव के गठन की सुविधा।

7. कटाई और 3 डी फेफड़े के ऊतकों मॉडल बढ़ते


नोट: निम्न चरणों का एक बीएसएल 3 सुविधा में किया जाना चाहिए।

  1. संक्रमित मैक्रोफेज के दिन 7 पद आरोपण पर, ऊतक मॉडल कटाई के लिए तैयार कर रहे हैं। ऊतक मॉडल से पूरी तरह से संस्कृति मीडिया निकालें। आरटी पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ ऊतक मॉडल को ठीक करें। यह कदम बैक्टीरिया को मारता है और आगे की प्रक्रिया के लिए ऊतक / सेल आकृति विज्ञान को ठीक करता है।
  2. एक छुरी का उपयोग करना, अच्छी तरह से डालने से झिल्ली अलग। एक अच्छी तरह से युक्त 1x पीबीएस के लिए ऊतक युक्त झिल्ली स्थानांतरण।
  3. कट और एक साफ छुरी का उपयोग ऊतक मॉडल के पक्षों को हटा दें। तब 4 लगभग बराबर चौकोर टुकड़ों में ऊतक मॉडल टुकड़ा। एक Superfrost गिलास स्लाइड पर ऊतक का एक टुकड़ा स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में ऊतक टुकड़े स्टोर।
  4. 5 मिनट के लिए ऊतक सूखी और DAPI और coverslip साथ लम्बा गोल्ड antifade का उपयोग कर माउंट। सूखे तक आरटी पर अंधेरे में परेशान बिना स्लाइड छोड़ दें।
    नोट: ऊतक की मोटाई मामूली tilti, जिससे केंद्र और परिधि के बीच भिन्न हो सकते हैंcoverslip की एनजी। इससे बचने के लिए, (उदाहरण के parafilm के लिए) एक स्पेसर कवर पर्ची के कोने पर रखा जा सकता है।
  5. Coverslip के किनारों के लिए नेल पॉलिश लागू करें और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं। बीएसएल 3 सुविधा से बाहर लाने के लिए उन्हें सुरक्षित बनाने के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जित स्लाइड।

8. दृश्य, अधिग्रहण और मात्रात्मक 3 डी विश्लेषण

  1. लेज़रों क्रमशः GFP (ग्रीन चैनल), PKH26 लेबल monocytes के लिए DAPI (नीला) के लिए 420 एनएम और 555 एनएम (लाल) की उत्तेजना के लिए 488 एनएम पर उत्सर्जन के साथ एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग ऊतक स्लाइड कल्पना।
  2. ढेर के बीच 1.5 माइक्रोन जुदाई - जेड के ढेर 20 माइक्रोन मोटाई की एक न्यूनतम पर कवर और 1 होने के साथ एक 512x512 संकल्प पर 3 डी छवियों मोल। ऊतक के पूरे टुकड़ा को कवर 5-10 विभिन्न क्षेत्रों मोल।
    नोट: ऑप्टिकल संकल्प (तरंगदैर्ध्य, लेजर शक्ति / जोखिम, पिक्सेल आकार और ज़ूम) का इष्टतम सेटिंग्स के लिए इस तरह के Nyqvist के रूप में विन्यास का प्रयोग करें। संयुक्त राष्ट्र से बचेंder या पिक्सल के संतृप्ति पर।
  3. 3 डी इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ confocal छवियों का विश्लेषण। सेल समूहों के 3 डी मात्रा का ठहराव के लिए, निम्न चरणों का इष्टतम विश्लेषण के लिए सिफारिश कर रहे हैं।
  4. 3 डी इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर खोलें और छवि को लोड। उदाहरण के लिए, छवि में विश्लेषण किया जा करने के लिए वस्तुओं के आयाम को मापने, एक नाभिक, व्यक्तिगत एककेंद्रकश्वेतकोशिका और एकल बैक्टीरिया के आकार। इन टिप्पणियों वस्तुओं को परिभाषित करने या छानने के लिए उपयोगी होते हैं।
  5. एक प्रदर्शन समायोजन उपकरण का उपयोग, छवि के विपरीत, चमक और अस्पष्टता मिश्रण के लिए हर चैनल का समायोजन करके मात्रा प्रतिपादन अनुकूलन। यह कदम मात्रा प्रतिपादन में शोर के हस्तक्षेप को कम करने के लिए है।
    नोट: गामा सुधार से बचा जाना चाहिए, इस प्रकार की छवियों के हेरफेर के लिए नेतृत्व और हो सकती है।
  6. सीमा (स्वत: या मैनुअल चयन) लाल चैनल (monocytes) का चयन करके सतहों बनाने और निर्धारित किया है। यदि आवश्यक हो, लाल monocytes के चयन को प्रतिबंधित करने के लिए फिल्टर का उपयोग करें या ख बाहर करने के लिएackground। इसी तरह, ग्रीन (एम तपेदिक) और ऊपर वर्णित के रूप में नीले (नाभिक) चैनलों के लिए सतहों बनाने।
  7. एमएस एक्सेल फाइल में डेटा निर्यात करें। यह एक विशेष पैरामीटर या सभी डेटा निर्यात करने के लिए संभव है। सेल क्लस्टरिंग के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक हैं कि मापदंडों मात्रा, तीव्रता, वस्तुओं की संख्या, voxels और गोलाई की संख्या में हैं।
  8. बचाने के लिए और एक उपयुक्त तस्वीर प्रारूप अधिमानतः झगड़ा में छवियों का निर्यात।
    नोट: एनिमेशन भी एनीमेशन मेनू का उपयोग किया जाता है और एक मीडिया फ़ाइल के रूप में बचाया जा सकता है।
  9. ऐड मापदंडों के विकल्प का उपयोग कर प्रत्येक चैनल के विश्लेषण सेटिंग्स को बचाने और समारोह के पुनर्निर्माण का उपयोग कर बाद में वापस लाया जा सकता है। इसके साथ ही बैच प्रसंस्करण उपकरण का उपयोग कर अधिक फ़ाइलों का विश्लेषण।
    नोट: हासिल कर ली संसाधित और एक ही तरीके से विश्लेषण किया जाना चाहिए तुलना करने के लिए सभी छवियों। उदाहरण के लिए एक 8 बिट छवि (256 पूर्णांक) एक 12 बिट छवि (4096 पूर्णांक) के साथ तुलना नहीं की जानी चाहिए।

Representative Results

मानव टीबी के लिए एक 3 डी फेफड़े के ऊतकों मॉडल को प्रभावी ढंग से एम में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता तपेदिक संक्रमण। इस पद्धति के बुनियादी कदम, विभिन्न चरणों और एक ऊतक अनुभाग का एक समग्र सूक्ष्म संरचना के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों चित्रा 1 में रेखांकित कर रहे हैं। मॉडल फेफड़ों फ़ाइब्रोब्लास्ट, ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं और प्राथमिक monocytes / मैक्रोफेज सहित मानव फेफड़े के ऊतकों के कई घटक हैं, 3 डी ऊतक वातावरण में एम्बेडेड। मानव फेफड़े के ऊतकों के घटकों को शामिल करने के अलावा, मॉडल शारीरिक शर्तों epithelia और बलगम स्राव का अर्थात् स्तरीकरण जैसा दिखता है।

एक टीबी संक्रमण की निगरानी में फेफड़े के ऊतकों मॉडल के उपयोग के लिए एक उदाहरण चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है। एम visualizing के लिए तपेदिक -immune सेल प्रवास और बातचीत, हम एम से संक्रमित मैक्रोफेज शुरू की व्यक्त GFP कि तपेदिक(हरा) एक साथ ऊतक मॉडल में हौसले से पृथक PKH26 लेबल monocytes (लाल) के साथ (नीले, DAPI नाभिक के लिए दाग)। एम के दिन 7 पद अलावा पर ऊतक मॉडल के लिए तपेदिक -infected कोशिकाओं, confocal माइक्रोस्कोपी मानव टीबी 9 की बानगी घावों mimics जो संक्रमण (हरा) की साइट (चित्रा 2), पर लाल monocytes के क्लस्टरिंग का पता चलता है।

एम के 3 डी दृश्य के लिए प्रतिनिधि छवियों की एक श्रृंखला तपेदिक ऊतक मॉडल और सेल समूहों की मात्रा का ठहराव 3 चित्र में दिखाया गया है। 3 डी दृश्य, बातचीत की जांच करने और एक 3 डी छवि में कई विशेषताएं यों के लिए उपयोगकर्ता लचीलापन देता है -infected। एम के स्थल पर monocytes के क्लस्टरिंग का पता चलता है जो चित्रा 3 बी, में सचित्र के रूप में हरी बैक्टीरिया और लाल एककेंद्रकश्वेतकोशिका समूहों के स्थानिक व्यवस्था, शिखर घूर्णी और पार्श्व दृश्य से देखा जा सकता है तपेदिक। समूहों ओब नहीं थेअसंक्रमित ऊतकों (चित्रा 3) में सेवा की। हम एककेंद्रकश्वेतकोशिका सेल समूहों की संख्या और आकार और मात्रा निर्धारित व्यक्ति monocytes के नंबर एम में (पी <0.01) में कमी आई है, जबकि सेल समूहों का आकार (मात्रा), (पी <0.001) बढ़ाया है कि पाया असंक्रमित ऊतक मॉडल (चित्रा -3 सी और 3 डी) की तुलना में क्षयरोग ऊतकों संक्रमित। इस डेटा एम में जल्दी ग्रेन्युलोमा गठन के हमारे पिछले निष्कर्ष की पुष्टि की तपेदिक संक्रमण 2 डी ऊतक वर्गों 9 में विश्लेषण फेफड़े के ऊतकों मॉडल में मनाया।

हमारे डेटा ऊतक मॉडल जटिल मेजबान एम सेल की जांच के लिए एक प्राकृतिक 3 डी निवास स्थान प्रदान करता है कि पता चलता है तपेदिक संचार नेटवर्क। हम यह भी 3 डी दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण ऊतक मॉडल में (चित्रा 3) सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए बेहतर उपकरण हैं कि पाया। एक सेल क्लस्टर की मात्रा (उदाहरण के लिए ग्रेन्युलोमा) अक्सर stretc कई सेल परतों को hes और पूरी तरह से एक 3 डी मात्रात्मक विश्लेषण द्वारा कब्जा किया जा सकता है। इसके अलावा, अलग-अलग कक्षों या मॉडल में बैक्टीरिया की सटीक स्थानिक और लौकिक सुविधाओं के दृश्य के एक नामित प्रयोगशाला में रहते इमेजिंग, प्रवास और ट्रैकिंग अध्ययन अनुमति देते हैं।

चित्र 2
विषमय एम के आसपास ऊतक मॉडल क्लस्टर में चित्रा 2. Monocyte तपेदिक। असंक्रमित और एम के प्रतिनिधि confocal छवियों तपेदिक से संक्रमित ऊतक मॉडल प्रस्तुत किया है। असंक्रमित ऊतकों की तुलना में पैनलों हरे रंग से (एम tuberculosis- GFP), लाल (PKH26 लेबल monocytes), नीला (DAPI से सना हुआ नाभिक) और विलय चैनलों संक्रमित ऊतक में monocytes की भर्ती दिखा। स्केल - 100 माइक्रोन।large.jpg "शैली =" font-size: 14px; रेखा से ऊंचाई: 28px; "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. 3 डी दृश्य और ऊतक मॉडल के मात्रात्मक विश्लेषण उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं। एम से संक्रमित पूरे ऊतक मॉडल (ए) असंक्रमित ऊतक, (बी) के 3 डी दृश्य की छवियों प्रतिनिधि तपेदिक, Imaris इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (संस्करण 7.6.8) द्वारा जीस LSM700 confocal खुर्दबीन और मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग ऑप्टिकल सेक्शनिंग के माध्यम से। इन छवियों 20X बढ़ाई पर हासिल किया गया, शिखर, बारी-बारी से क्षैतिज, बारी-बारी से ऊर्ध्वाधर और पार्श्व दृश्य (ए और बी) से दृश्य की अनुमति, 1.5 माइक्रोन अंतराल के साथ 19.5 माइक्रोन के एक ऊतक मोटाई को कवर 14 जेड ढेर। (सी) योग्यताएम के बाद जल्दी ग्रेन्युलोमा समूहों के एककेंद्रकश्वेतकोशिका सेल समूहों के ntitative विश्लेषण बढ़ाया प्रकट (पी <0.0001) आकार संक्रमित ऊतक में अधिक समूहों दोहराते, असंक्रमित ऊतक की तुलना में संक्रमण के अभाव की तुलना में जब तपेदिक संक्रमण। (डी) monocytes के नंबर की मात्रा संक्रमित ऊतक में गिरावट (पी <0.01) से पता चला है। ग्रीन - एम तपेदिक -GFP, लाल - PKH26 लेबल monocytes, ब्लू - सेल नाभिक, स्केल -। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture inserts BD Falcon 353092
6-well culture plates BD Falcon 353046
MRC-5 cells, lung fibroblasts ATCC#CCL-171
16HBE cells, lung epithelial cells Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA 
5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) Gibco 12800-082 Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x Gibco 41965-039
Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts Sigma M4655
Non-Essential Amino Acids Solution, 100x Life Technologies 11140-035
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-024
Sodium Pyruvate Life Technologies 11360-039
NaHCO3 (71.2 mg/ml) Prepared in house
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106 Heat inactivated for 30 min, 56 °C
Gentamicin (50 mg/ml) Gibco 15750-060
Hepes buffer solution 1M Gibco 15630-056
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Gibco 15140-122
Lymphoprep Axis-Shield 7801
Ultrapure 0.5 M EDTA Gibco 15575
Bovine Collagen PA treated (500 ml) Organogenesis 200-055
Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) Advanced biomatrix 5005-B
Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) BD 354008
Primary human monocytes/macrophages Isolated from human whole blood or buffy coats.
PKH26 Red fluorescent cell linker Sigma MINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.
Middlebrook 7H9 medium  Difco 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BBL 211887
Tween-80
Glycerol
Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) Sigma B5264
Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI Invitrogen P36935
Trypsin -EDTA
Bovine serum albumin
Paraformaldehyde
DAPI
LSM700 Confocal microscope Zeiss
iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 Bitplane AG

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References

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संक्रमण अंक 104, 3 डी मॉडल 3 डी विश्लेषण फेफड़े के ऊतकों तपेदिक, ग्रेन्युलोमा
पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक 3 डी मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल<em&gt; माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em&gt; संक्रमण
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Braian, C., Svensson, M., Brighenti, … More

Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (104), e53084, doi:10.3791/53084 (2015).

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