Abstract
Tuberkulose (TB) holder stadig en stor trussel mod sundheden for mennesker verden over, og der er et behov for omkostningseffektiv, men pålidelige modeller til at hjælpe os med at forstå de mekanismer, sygdom og fremme opdagelser nye behandlingsmuligheder. In vitro cellekulturer af monolag eller co-kulturer mangler den tredimensionale (3D) miljø og vævsreaktioner. Heri beskriver vi en innovativ in vitro model af en human lungevæv, som lover at være et effektivt værktøj til at studere de komplekse begivenheder, der opstår under infektion med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). 3D vævsmodellen består af vævsspecifikke epitelceller og fibroblaster, som er dyrket i en matrix af collagen på toppen af en porøs membran. Ved lufteksponering, epitelcellerne stratificere og udskiller slim ved apikale side. Ved at indføre humane primære makrofager inficeret med M. tuberkulose til vævet tilstandl, har vi vist, at immunceller vandre ind i inficeret væv og danne tidlige stadier af TB granulom. Disse strukturer rekapitulere særligt træk ved human tuberkulose, den granulom, som adskiller sig fundamentalt eller ej almindeligvis observeret i vid udstrækning anvendes eksperimentelle dyremodeller. Denne organotypisk kultur metode gør det muligt for 3D-visualisering og robust kvantitativ analyse, der giver afgørende oplysninger om rumlige og tidslige funktioner i værtscellelinjer-patogen interaktioner. Tilsammen lungevævet model giver en fysiologisk relevant væv mikro-miljø for undersøgelser af tuberkulose. Således lungevævet model har potentielle konsekvenser for både grundlæggende mekanistiske og anvendte studier. Vigtigere er det, model tillader tilføjelse eller manipulation af individuelle celletyper, som derved udvider dets anvendelse til modellering en vifte af smitsomme sygdomme, der påvirker lungerne.
Introduction
Hos mennesker, reaktioner på infektion, vævsinflammation, cellulær rekruttering, vævsombygning og regulering af væv homeostase er komplekse begivenheder, der involverer forskellige celletyper. Derfor er disse processer bedst undersøgte i lokale vævsmiljø. Tidligere har det hovedsagelig været muligt ved hjælp af eksperimentelle dyremodeller. Men den udbredte forsøgsdyr holde mange grænser, da de ofte reagere på patogener på en anden måde end mennesker, og også vise et andet sygdomsforløb 1. Et menneske in vitro lungevæv model holder mulighederne for at studere specifikke immunresponser i human lunge.
Human tuberkuloseinfektion (TB) er hovedsagelig en sygdom, der påvirker lungerne. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), det kausative agens for tuberkulose, når lungen via aerosoldråber, der transporteres til det alveolære rum, hvor bakterierne er opslugt af pulmonal dendritic celler og alveolære makrofager som en del af svaret på infektionen 2,3 medfødte immunforsvar. Fagocytose af patogenet fører til opdeling af fejlen inden for en fagosomet og ideelt resulterer i neutralisering og drab af patogenet ved phagocyt. Op til 50% af personer udsat for M. tuberkulose menes at være i stand til at fjerne infektionen gennem immunrespons medfødte 4. Andre resultater af infektion er efter det adaptive immunsystem på et senere tidspunkt, latent infektion eller i værste tilfælde kronisk aktiv sygdom 5.
Tidligere har der ikke været in vitro væv modeller til studier af menneskelig TB. Encellede kulturer af humane makrofager eller andre celler fra perifert blod er ofte blevet anvendt 6,7. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at de ikke kan afspejle dynamikken i forskellige celletyper, der sammen i en lungevæv udsat for M. tuberkulose en in vitro model for at kunne udføre funktionelle og mekanistiske undersøgelser på TB. Den cellebaserede in vitro humant lungevæv model beskrives her blev oprindeligt etableret af vores gruppe til undersøgelser af dendritiske celle funktioner 8. Vi har tilpasset denne metode til undersøgelse af TB.
Den menneskelige lungevæv model præsenteres her består af vævsspecifikke epitelceller og fibroblaster 8. Disse celler dyrkes i en matrix af collagen på toppen af en porøs membran i en transwell indsatsen og danne strukturer ligner normalt lungevæv human (figur 1). Når de udsættes for luft cellerne begynder at udskille slim på den apikale side 8. Ved at implantere humane primære makrofager inficeret med M. tuberkulose til modellen, har vi observeret, hvordan de immunceller migrerer i vævet og danne tidlige stadier af TB granulomer 9. Dette er den første humant væv model descrIBED for TB og det udgør et lovende redskab til at studere medfødte immunrespons til tuberkulose og andre sygdomme i lungerne. Til dato har vi kun anvendes monocytter og makrofager som immunceller i modellen, men graden af kompleksitet kan forøges ved medtagelse af yderligere relevante celletyper.
Figur 1. Skematisk oversigt over lungevævet model. (A) Modellen består af humane lunge-specifikke epitelceller, M. tuberculosis-inficerede primære makrofager og røde farvestof mærkede monocytter podet på collagen indlejret fibroblaster fremstillet på en transwell filter. Eksponering af vævet model til luft initierer produktionen af ekstra-cellulære matrixproteiner, slim sekretion og lagdeling af epitel. 3D-væv-modellen således udviklet er et nyttigt redskab til at studere M. tuberkuloseinfektion i et miljø, Closely ligner en menneskelig lunge. (B) Repræsentative mikroskopiske billeder af de forskellige trin i udarbejdelsen af vævet model. (C) Komplet struktur af lungen model vævssnit. Scale -. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Bemærk: Humant perifert blod fra raske bloddonorer anonyme købt på blodbanken over Linköping University Hospital, blev Sverige anvendes som kilde af immunceller til denne undersøgelse. Denne protokol er beregnet til 24 mm plade med 6 brønde skær. Direkte tilpasning til andre godt formater kan ikke anbefales, da vævet modelkontrakter både lodret og vandret under udvikling.
1. Fremstilling af materialer, medier og kultur af bakterier / cellelinier
- Kultur af bakterier:
- Grow den mycobakterielle stammen M. tuberculosis H37Rv bærer pFPV2 plasmid for at konstitutivt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), i Middlebrook 7H9-medium indeholdende 0,05% Tween-80, 0,5% glycerol, kanamycin (20 ug / ml) og suppleret med Middlebrook albumin, dextrose og katalase berigelse ( Middlebrook ADC Enrichment), ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-10 dage.
Bemærk: Alle eksperimenterende skridts involverer levende virulente M. tuberculosis-stammer skal udføres i en BSL-3 anlæg.
- Grow den mycobakterielle stammen M. tuberculosis H37Rv bærer pFPV2 plasmid for at konstitutivt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), i Middlebrook 7H9-medium indeholdende 0,05% Tween-80, 0,5% glycerol, kanamycin (20 ug / ml) og suppleret med Middlebrook albumin, dextrose og katalase berigelse ( Middlebrook ADC Enrichment), ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-10 dage.
- Forbered 1x Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) komplet medium (suppleret med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer og 10 % varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS)). Forbered også antibiotika-fri DMEM komplette medium.
- Forbered 1x Minimum Essential Medium (MEM) komplet medium (1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer og 10% varme- inaktiveret føtalt bovint serum (FBS)).
- Fremstilling af fibronectin / collagen-coatede kolber (total 10 ml):
- Pipette 8,8 ml steril 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) i et rent rør. Der tilsættes 1 ml bovint serumalbumin (1 mg / ml), 100 pi type I bovint kollagen (3 mg / ml) og 100 pi rekombinant humand fibronectin (1 mg / ml).
- Bland opløsningen ved at dreje røret på hovedet 5 gange. Kolber er belagt med et fibronectin / collagen-opløsning (1 ml for en T-25 og 2 ml til en T-75-kolbe). Lad det O / N ved 37 ° C. Efter inkubation fjernes opløsningen og opbevare de coatede kolber ved stuetemperatur.
Bemærk: Den opsamlede opløsning kan opbevares ved 4 ° C og genanvendes til tre gange. Opbevaring i mere end 2 uger, kan få væsken til at blive brun (dannelse af krystaller), hvor over det skal kasseres.
- Kultur af fibroblaster:
- Vokse og opretholde MRC-5, (a human lunge fibroblastcellelinie afledt af normal lungevæv af en 14-uger gamle mandlige foster), i fuldstændig DMEM i 5% CO2 ved 37 ° C. Brug fibroblasterne ved passagerne 24-26 og vokse, indtil 70-80% sammenflydende.
Bemærk: MRC-5 cellelinie ved passage> 30 tendens til at miste morfologi og anbefales ikke til brug i vævet model.
- Vokse og opretholde MRC-5, (a human lunge fibroblastcellelinie afledt af normal lungevæv af en 14-uger gamle mandlige foster), i fuldstændig DMEM i 5% CO2 ved 37 ° C. Brug fibroblasterne ved passagerne 24-26 og vokse, indtil 70-80% sammenflydende.
- Dyrkning af epitelceller:
- Opnå 16HBE14o- (16HBE), en udødeliggjort human bronchieepithelceller cellelinje, der bevarer den differentierede morfologi og funktion af normal menneskelig luftvejsepitel, (dette var en gave fra Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco , USA. 10). Kultur 16HBE celler i fibronectin / collagen-coatede kolber og opretholde cellerne i fuldstændig MEM i 5% CO2 ved 37 ° C.
- Fremstilling af 5x DMEM
- Forbered 5x DMEM ved at opløse 13,4 g DMEM pulver og 3,7 g natriumbicarbonat i 150 ml sterilt destilleret vand. Justere pH af mediet til 7,3, fyldes op til 200 ml og filtreres det ved hjælp af 0,22 um membranfilter. Saml det filtrerede medium i en steril beholder og opbevares indtil anvendelse ved stuetemperatur.
2. Fremstilling af kollagen-indlejrede fibroblaster
- Optø frosne portioner af FBS og L-glutamin i et 37 ° C vandbad.Efter optøning holde prøverne på is. Placer Natriumbicarbonat (71,2 mg / ml) og gentamicin (50 mg / ml) ved 4 ° C. Pre-cool 50 ml centrifugerør og 10 ml sterile pipetter til 4 ° C.
Bemærk: Alle anvendte materialer (undtagen 5x DMEM) er afkølet på is før anvendelse, og alle trin udføres på is. Type I kollagen (1,1 mg / ml) skal holdes koldt, da dette forhindrer størkning af collagen. - Forbered fibroblastcellerne:
- Varm trypsin i et 37 ° C vandbad og inkuber tilstrækkelig mængde med lungefibroblaster (MRC-5) celler i 10 minutter ved 5% CO2 ved 37 ° C. Neutralisere trypsin ved tilsætning 1x DMEM komplet. Aspirer cellesuspensionen og der centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne ved 2,3 x 10 5 celler / ml i DMEM komplet. Placer cellerne på is indtil klar til brug.
- Forbered forblanding:
- Tilføj følgende til et rør mærket "pre-mix"; 395pi 5x DMEM, 40 pi L-glutamin, 120 pi NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 pi FBS, 5 pi Gentamicin (50 mg / ml), Total volumen 1.000 pi, derefter swirl præ-bland godt og sat på is.
Bemærk: De angivne mængder er for en 24 mm 6-brønd kultur insert. Beregn de specifikke beløb, der kræves for det samlede antal indsatser, men tilføjer en ekstra for at være sikker, er tilstrækkelig forblanding forberedt.
- Tilføj følgende til et rør mærket "pre-mix"; 395pi 5x DMEM, 40 pi L-glutamin, 120 pi NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 pi FBS, 5 pi Gentamicin (50 mg / ml), Total volumen 1.000 pi, derefter swirl præ-bland godt og sat på is.
- Forbered acellulær kollagen blandingen:
- Til hver kultur tilsættes 1 ml acellulær kollagen blanding. Tilføj følgende til et 50 ml konisk rør på is i den givne rækkefølge; 686 pi 1,1 mg / ml collagen, 250 pi Pre-mix og 64 pi 1x komplet DMEM til et samlet volumen på 1.000 pi. Blande opløsningen godt sikre ingen luftbobler. Arbejde hurtigt og tilføje collagen på væggen af røret for at undgå luftbobler.
- Der tilsættes 1 ml af den acellulære lag blandingen til indsatsen er placeret i 6-brønds plade. Tilsæt ikke medium til brønden uden for indsatsen. Icubate i 30 minutter i et 37 ° C inkubator. Sørg for, at acellulær blanding dækker hele indsatsen uden luftbobler.
- Forbered cellulære kollagen blandingen:
- Bland bestanddele af cellulære lag i en 50 ml konisk rør holdes på is i følgende rækkefølge; 2 ml Collagen, 615 pi Pre-mix, 58 pi 1x komplet DMEM og 327 pi celle suspension lungefibroblaster (MRC-5) for at gøre op den samlede mængde til 3.000 pi. Hver kultur kræver 3 ml cellulære collagen blanding.
Afgørende skridt: Sørg for at blande kollagen og premix omhyggeligt før tilsætning af cellesuspensionen. Dette vil neutralisere pH i collagen for at undgå toksiske virkninger på fibroblaster. - Tilsæt cellulære lag (3 ml) oven på det acellulære collagenlag og inkuberes i 2 timer i en 37 ° C inkubator. Arbejde hurtigt og tilføje collagen på væggen af røret for at undgå luftbobler.
- Efter polymerisering, tilsættes 2 ml DMEM komplet til tHan bunden af 6-brønds plade (under indsatsen) og inkuberes i 24 timer.
BEMÆRK: Hvis polymerisering ikke sker, kassere pladen indsatse der indeholder fibroblast-kollagen matrix og start-forfra. Den mest sandsynlige årsag er en fejl i tillæg eller forkert volumen af en af de ovenfor anførte reagenser.
- Bland bestanddele af cellulære lag i en 50 ml konisk rør holdes på is i følgende rækkefølge; 2 ml Collagen, 615 pi Pre-mix, 58 pi 1x komplet DMEM og 327 pi celle suspension lungefibroblaster (MRC-5) for at gøre op den samlede mængde til 3.000 pi. Hver kultur kræver 3 ml cellulære collagen blanding.
3. Kontinuerlig kultur af fibroblast-kollagen matrix
- Løft forsigtigt indsatsen ved hjælp af en ren pincet opsuges dyrkningsmediet fra bunden af brønden. Tilsæt 2 ml komplet DMEM til bunden af brønden efterfulgt af 2 ml komplet DMEM inden i indsatsen. Undgå at der dannes luftbobler under indsatsen, da dette vil forhindre diffusion af næringsstoffer mellem de ydre og indre kamre. Fjern luftbobler med en mikropipettespids.
- Skift dyrkningsmediet (i og under indsatsen) hver anden dag og kultur i ca. 5-7 dage. Pas på med at fjerne medierne fra indsatsen. For at undgå contact med fibroblast-kollagen matrix, let vippe indsatsen med en ren pincet og aspireres medierne fra indsatsen vægge.
Afgørende skridt: Fibroblasterne i kollagenmatrixen bør få en langstrakt fænotype, og omforme den kollagen, som derefter kontrakter. I omkring 5-7 dage, har matricen sammen og danner en platform (10-14 mm i diameter) i midten af indsatsen. Den aftalte matrix er klar til brug i det næste trin. At opnå en ensartet sammentrækning af matrix er det afgørende, at fibroblasterne er godt blandet med collagen inden podning (trin 2.6.1).
4. Såning af immunceller (Inficerede / Uinficerede Monocyt-makrofag blanding)
Bemærk: De følgende eksperimentelle trin involverer virulente mykobakterier, og derfor skal udføres i en BSL-3 anlæg.
- Fremstilling af primære monocytter og makrofager:
- Isoler perifere blodmonocytter fra donorblod under anvendelse af en establikaste protokol. Isoler monocytter på samme dag som opsætning af vævet model og kultur og differentiere dem i makrofager i ca. 7 dage før infektion med M. tuberkulose.
BEMÆRK: Dette vil sikre både makrofager og den aftalte fibroblast-kollagen matrix er tilgængelige efter 7 dage. Også isolere friske monocytter, der vil blive tilføjet sammen med de inficerede makrofager.
- Isoler perifere blodmonocytter fra donorblod under anvendelse af en establikaste protokol. Isoler monocytter på samme dag som opsætning af vævet model og kultur og differentiere dem i makrofager i ca. 7 dage før infektion med M. tuberkulose.
- Fremstilling af M. tuberkulose-inficerede makrofager
- Høst de dyrkede bakterier, vask med 1 x PBS indeholdende 0,05% Tween-80, resuspender i antibiotika-fri fuldstændig DMEM, passere gennem en trunkeret steril 27 G nål til at sprede bakterielle klumper og måle den optiske densitet.
Bemærk: Pre-bestemme M. tuberkulose kolonidannende enhed ækvivalenter ekstinktionen i laboratoriet. Dette vil give et skøn over antallet af bakterier, der skal anvendes til infektion. - Inkuber makrofagerne i 4 timer med <em> M. tuberkulose ved infektionsmultiplicitet (MOI) 10). Efter infektion vaskes 3x med 1x PBS til fjernelse af ekstracellulære bakterier. Brug inficerede makrofager dyrket på samme måde, men uden M. tuberkulose, som kontroller.
- Frigør makrofagerne fra dyrkningspladen af behandling med 2 mM EDTA i 10 minutter ved 37 ° C og resuspenderet cellerne i antibiotikum-frit komplet DMEM.
- Høst de dyrkede bakterier, vask med 1 x PBS indeholdende 0,05% Tween-80, resuspender i antibiotika-fri fuldstændig DMEM, passere gennem en trunkeret steril 27 G nål til at sprede bakterielle klumper og måle den optiske densitet.
- Mærkning af monocytter
Bemærk: Isolering og mærkning af monocytter kan udføres i BSL-2 bænk og derefter tages i BSL-3 anlæg til yderligere bearbejdning.- Farv frisklavet monocytter (2 x 10 7 celler) med en slutkoncentration på 2 uM PKH26 rødt farvestof i 5 minutter, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Wash 3x og resuspender cellerne med antibiotika-fri fuldstændig DMEM ved en densitet på 1 x 10 7 celler / ml.
- Tilsætning af immunceller til fibroblast-collagenmatrix
- Enfter 5-7 dages dyrkning af fibroblast-collagenmatrix, aspireres dyrkningsmedierne fra de ydre og indre kamre og tilsæt 1,5 ml frisk antibiotika-fri DMEM komplet til det ydre kammer.
- Der fremstilles en mærket monocyt-makrofag (uinficeret / inficerede) blanding med et forhold på MO: MQ (5: 1) i 50 pi DMEM komplet. For 50.000 makrofager, tage 250.000 mærkede monocytter.
- Der tilsættes 50 pi MO: MQ blandingen til fibroblast-collagenmatrix og inkuberes i 1 time i 5% CO2 ved 37 ° C. Efter inkubation forsigtigt tilsættes 2 ml dyrkningsmedier i indsatsen og inkuberes i yderligere 24 timer i 5% CO2 ved 37 ° C.
Bemærk: Som tilsatte celler er løst fastgjort, bør tilsætning af mediet være langsom ved forsigtigt at tilsætte på væggene i indsatsen.
5. Såning af lungeepitelceller (16HBE)
Bemærk: Følgende trin skal udføres i et BSL-3 anlæg.
- Seed lunge epithelial celler (16HBE) oven på MO: MQ-fibroblast-collagen lag. For at udføre dette, først dissociere 16HBE celler fra kolben ved behandling med trypsin (som i 2.2.1.) Og resuspender på 4 x 10 6 celler / ml i antibiotika-fri DMEM.
- Aspirer dyrkningsmediet i og uden for indsatsen. Derefter tilsættes 1,5 ml antibiotika-fri DMEM komplet i bunden af brønden uden for indsatsen.
- Der tilsættes 50 pi 16HBE oven på immuncellen-fibroblast collagen matrix. Lad i 2 min i hætten og inkuberes i 1 time i 37 ° C inkubator med 5% CO2. Efter inkuberingen tilsættes forsigtigt 2 ml af antibiotika-fri DMEM komplet inden i indsatsen og kultur ved 37 ° C i 3 dage. Trinnet kultur letter proliferation af epitelceller i vævet model.
Bemærk: Som tilsatte celler er løst fastgjort, bør tilsætning af medier være langsom og blid ved at glide gennem væggene af indsatsen.
6. Air-eksponering af 3D LungModel
Bemærk: Efter dag 5 efter tilsætning af inficerede makrofager, vævet modeller er luft-eksponerede og de følgende trin skal udføres i et BSL-3 anlæg.
- Aspirer dyrkningsmediet i og uden for indsatsen.
Bemærk: I dette trin kan opsamles supernatanter til påvisning af udskilte faktorer. Centrifuge, sterilt filtrer og opbevar supernatanter ved -70 ° C. - Tilføj 1,8 ml antibiotika-fri DMEM komplet i det ydre kammer og inkuber i 5% CO2 ved 37 ° C inkubator i 2 dage. Tilføj ikke dyrkningsmedier inden indsatsen.
BEMÆRK: Air-løft af vævet modellen letter dannelsen af lagdelt epitel og slim sekretion, som giver styrke til vævet og fysiologiske lighed med den menneskelige lungevæv.
7. Høst og Montering af 3D-Lung Tissue Model
Bemærk: Følgende trin skal udføres i et BSL-3 anlæg.
- På dag 7 efter implantation af inficerede makrofager, hudmodellerne er klar til høst. Fjern dyrkningsmedier helt fra vævet model. Fastgør vævet model med 4% paraformaldehyd i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. Dette trin dræber bakterierne og fikserer vævet / cellemorfologi til yderligere behandling.
- Ved hjælp af en skalpel, adskille membranen fra brønden indsatsen. Overfør membran indeholdende vævet til en brønd indeholdende 1 X PBS.
- Skær og fjern siderne af vævet model ved hjælp af en ren skalpel. Så skære vævet model i 4 omtrent lige store firkantede stykker. Overfør et stykke væv på et SuperFrost glasplade. Opbevar vævsstykkerne i 1x PBS ved 4 ° C.
- Tør vævet i 5 minutter og montere bruge forlænge Guld antiblegemiddel med DAPI og dækglas. Lad dias uden at forstyrre i mørke ved stuetemperatur indtil tør.
Bemærk: Tykkelsen af vævet kan variere mellem centrum og periferien, der forårsager mindre tilting af dækglasset. For at undgå dette, kan et afstandsstykke (for eksempel parafilm) anbringes på hjørnet af dækglasset. - Anvend neglelak til kanterne af dækglasset og lad det tørre. Fordybe objektglassene i 70% ethanol for at gøre dem sikkert at bringe ud af BSL-3 anlæg.
8. Visualisering, Køb og kvantitativ 3D Analyse
- Visualisere væv slides under anvendelse af et konfokalt mikroskop systemet med lasere udsender ved 488 nm for excitation af GFP (grønne kanal), 420 nm for DAPI (blå) og 555 nm for de PKH26-mærkede monocytter (rød) henholdsvis.
- Anskaf 3D-billeder på et 512x512 opløsning med Z-stakke, der dækker på minimum 20 pm tykkelse og have 1-1,5 um adskillelse mellem stakke. Erhverve 5-10 forskellige områder, der omfatter hele stykke væv.
Bemærk: Brug konfiguration såsom Nyqvist for optimale indstillinger for optisk opløsning (bølgelængde, laser magt / eksponering, pixelstørrelse og zoom). Undgå unwho eller over mætning af pixels. - Analyser konfokale billeder med 3D billedbehandling software. For 3D kvantificering af celleklynger, er følgende trin anbefales til optimal analyse.
- Åbn 3D-billedbehandling software og indlæse billedet. Mål dimensionerne af objekter, der skal analyseres i billedet, for eksempel størrelsen af en kerne, individuel monocyt- og enkelt bakterier. Disse observationer er nyttige til at fastlægge eller filtrering objekterne.
- Ved hjælp af en skærm justering værktøj, optimere volumen rendering ved at justere hver kanal for billedets kontrast, lysstyrke og blend opacitet. Dette trin er at minimere interferensen af støj i volumen rendering.
Bemærk: Gamma korrektion kan føre til manipulation af billeder, og derfor bør undgås. - Opret overflader ved at vælge den røde kanal (monocytter), og indstil tærskel (automatisk eller manuelt valg). Hvis det er nødvendigt, bruge filtre for at begrænse valget af røde monocytter eller at udelukke bBAGGRUND. Tilsvarende skabe overflader til grøn (M. tuberculosis) og blå (kerner) kanaler som beskrevet ovenfor.
- Eksportere data i MS-Excel-filer. Det er muligt at eksportere en bestemt parameter eller alle data. De parametre, der er relevante for analysen af celle klynger er volumen, intensitet, antallet af objekter, antal voxels og kugleform.
- Gem og eksportere billederne i et passende billedformat helst TIFF.
BEMÆRK: Animationer kan også foretages ved hjælp af animation menuen og gemmes som en mediefil. - Gem indstillinger Analysen af hver kanal ved hjælp af Add parametre option og kan hentes senere ved hjælp af Genopbyg funktionen. Samtidig analysere flere filer ved hjælp af Batchbehandling værktøj.
Bemærk: Alle billeder, der skal sammenlignes skal erhverves, behandlet og analyseret på samme måde. For eksempel en 8 bit billede (256 heltal) ikke bør sammenlignes med en 12 bit billede (4096 heltal).
Representative Results
En 3D lungevæv model for menneskelig TB kan bruges effektivt til at studere værten-patogen interaktioner i M. tuberkuloseinfektion. De grundlæggende trin i denne fremgangsmåde, er repræsentative mikroskopiske billeder af forskellige trin og en samlet mikroskopiske struktur af et vævssnit skitseret i figur 1. Modellen har flere komponenter af human lungevæv, herunder lungefibroblaster, bronkiale epitelceller og primære monocytter / makrofager indlejret i 3D vævsmiljø. Udover at indarbejde komponenter af human lungevæv, modellen ligner fysiologiske betingelser, nemlig lagdeling af epitel og slim sekretion.
Et eksempel på brugen af lungevævet modellen i overvågning af en TB-infektion er vist i figur 2. For at visualisere M. tuberkulose -immune celle migration og interaktion, vi introducerede makrofager inficeret med M. tuberkulose, der udtrykker GFP(grøn) sammen med de frisk isolerede PKH26-mærkede monocytter (rød) ind i vævet model (blå, DAPI farvet for kerner). På dag 7 efter tilsætning af M. tuberkulose inficerede celler til vævsmodellen, konfokal mikroskopi afslører gruppering af røde monocytter på infektionsstedet (grøn) (figur 2), som efterligner de kendetegnende læsioner af human TB 9.
En række repræsentative billeder til 3D-visualisering af M. tuberculosis-inficerede vævsmodellen og kvantificering af celleklynger er vist i figur 3. The 3D-visualisering giver brugeren fleksibiliteten til at vekselvirke, undersøge og kvantificere flere funktioner i et 3D-billede. Den rumlige arrangement af grønne bakterier og røde monocyt klynger kan ses fra den apikale, roterende og lateral view som illustreret i figur 3B, der afslører klyngedannelse af monocytter på det sted, M. tuberkulose. Klyngerne blev ikke observeret i inficerede væv (figur 3A). Vi kvantificerede størrelsen og antallet af monocyt celleklynger og fundet, at størrelsen (volumen) af celleklynger er forbedret (p <0,001), mens antallet af individuelle monocytter faldt (p <0,01) i M. tuberkulose inficeret væv i forhold til ikke-inficerede væv modeller (figur 3C og 3D). Disse data validerer vores tidligere fund af tidlig granuloma i M. tuberkulose-infektion observeret i lungevæv modeller analyseret i 2D vævssnit 9.
Vores data tyder på, at vævet model giver en naturlig 3D levested for at undersøge det komplekse vært celle- M. tuberkulose kommunikationsnetværk. Vi fandt også, at 3D-visualisering og kvantitativ analyse er bedre værktøjer til at studere de funktioner i vævet model (figur 3). Kvantificering af en celle klynge (granuloma for eksempel) ofte stræ HES til flere cellelag og kan helt fanget af en 3D-kvantitativ analyse. Desuden visualisering af præcise rumlige og tidslige funktioner i individuelle celler eller bakterier i modellen tillader levende billedbehandling, migration og sporing studier i et udpeget laboratorium.
Figur 2. Monocyt i vævet model klynge omkring virulente M. tuberkulose. Repræsentative konfokale billeder af uinficerede og M. tuberkulose inficeret væv model præsenteres. Paneler fra grøn (M. tuberkulosefri GFP), rød (PKH26-mærkede monocytter), blå (DAPI-farvede kerner) og fusionerede kanaler viser rekrutteringen af monocytter i det inficerede væv i forhold til ikke-inficerede væv. Scale - 100 um.large.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. 3D-visualisering og kvantitativ analyse af væv model give nyttige oplysninger. Repræsentative billeder af 3D-visualisering af hele væv model (A) inficerede væv, (B) inficeret med M. tuberkulose gennem optisk sektionering hjælp Zeiss LSM700 konfokal mikroskop og kvantitativ analyse af Imaris billedbehandling software (version 7.6.8). Disse billeder blev opnået ved 20X forstørrelse, 14 z-stakke dækker et væv tykkelse på 19,5 um med 1,5 um interval, således at visualisering fra apikal, roterende vandret, roterende lodret og lateral view (A og B). (C) Quantitative analyse af monocyt celleklynger afslører forbedret (p <0,0001) størrelsen af tidlige granulomer klynger efter M. tuberkuloseinfektion sammenlignet med fravær af infektionen. (D) Kvantificering af antallet af monocytter viste et fald (p <0,01) i inficeret væv sammenlignet med et ikke-inficerede væv, der gentager flere klynger i det inficerede væv. Grøn - M. tuberkulose -GFP, Rød - PKH26-mærkede monocytter, Blå - cellekerner, Skala -. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
| 6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
| MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
| 16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
| 5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
| Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
| Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
| Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
| Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
| Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
| PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
| Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
| Tween-80 | |||
| Glycerol | |||
| Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
| Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Trypsin -EDTA | |||
| Bovine serum albumin | |||
| Paraformaldehyde | |||
| DAPI | |||
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
| iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |
References
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).
- Saunders, B. M., Britton, W. J. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).
- Kaufmann, S. H. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. Ann Rheum Dis. 63, Suppl 2. ii50-ii56 (2004).
- Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).
- Barry 3rd, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Puissegur, M. P., et al. An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).
- Kapoor, N., et al. Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation. PLoS One. 8, e53657 (2013).
- Nguyen Hoang,, T, A., et al. Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).
- Parasa, V. R., et al. Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue. Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).
- Cozens, A. L., et al. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Brighenti, S., Andersson, J. Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection. J Infect Dis. 205, Suppl 2. S316-S324 (2012).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, 37-49 (2009).
- Gupta, U. D., Katoch, V. M. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).
- Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).
- Singhal, A., et al. Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection. PLoS One. 6, e18632 (2011).
- Subbian, S., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs. PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).
- Lin, P. L., et al. Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model. Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).
- Rahman, S., et al. Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions. Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).
