Abstract
Tuberkulose (TB) holder fortsatt en stor trussel for helsen til mennesker over hele verden, og det er behov for kostnadseffektive, men pålitelige modeller for å hjelpe oss å forstå sykdomsmekanismene og fremme funn av nye behandlingstilbud. In vitro cellekulturer fra monolag eller ko-kulturer mangler den tre-dimensjonale (3D) miljø og vev responser. Heri beskrives en in vitro modell av et humant lungevev, som holder løftet for å være et effektivt verktøy for å studere de komplekse hendelser som oppstår i løpet av infeksjon med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). 3D-vevet Modellen består av vevsspesifikke epitelceller og fibroblaster, som er dyrket i en matriks av kollagen på toppen av en porøs membran. Ved luft eksponering, epitelcellene stratify og skiller ut slim på den apikale siden. Ved å introdusere humane primære makrofager smittet med M. tuberkulose til vevet modusl, har vi vist at immunceller migrere inn i infisert vev og danner tidlige stadier av TB granuloma. Disse strukturene rekapitulere den distinkte trekk ved menneskelig TB, den granulomer, som er fundamentalt annerledes eller ikke ofte observert i mye brukt eksperimentelle dyremodeller. Dette organotypiske kultur metoden muliggjør 3D-visualisering og robust kvantitativ analyse som gir sentral informasjon om romlige og tidsmessige funksjoner i vertscelle-patogen interaksjoner. Til sammen gir lungevevet modellen en fysiologisk relevant vev mikro-miljø for studier på TB. Dermed har lungevevet modellen potensielle konsekvenser for både grunnleggende mekanistiske og anvendt studier. Viktigst av alt gir modellen tilsetning eller manipulering av individuelle celletyper, noe som derved utvider dens anvendelse for modellering en rekke infeksjonssykdommer som påvirker lungene.
Introduction
Hos mennesker reaksjoner på infeksjon, vev betennelse, cellular rekruttering, vev ombygging og regulering av vev homeostase er komplekse hendelser som involverer ulike celletyper. Derfor er disse prosessene mest studerte i det lokale vevet miljøet. Tidligere har dette i hovedsak vært mulig ved hjelp av eksperimentelle dyremodeller. Men de brukte forsøksdyr holde mange grenser som de ofte svare på patogener på en annen måte enn mennesker, og også vise en annen sykdomsforløp 1. Et in vitro humant lungevev modellen har muligheter for å studere spesifikke immunresponser i den menneskelige lunge.
Menneskelig tuberkulose infeksjon (TB) er hovedsakelig en sykdom som påvirker lungene. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), den utløsende agent for TB, når lungene via aerosol dråper som blir transportert til alveolar plass, der bakteriene er omsluttet av lunge dendritic celler og alveolære makrofager som en del av det medfødte immunrespons på infeksjon 2,3. Fagocytose av organismen fører til compartmentalization av feilen innen en phagosome og ideelt resulterer i nøytralisering og drap av patogenet ved phagocyte. Opp til 50% av individer som utsettes for M. tuberkulose antas å være i stand til å fjerne infeksjonen gjennom medfødte immunrespons fire. Andre resultater av infeksjon er en avklaring fra adaptive immunsystemet på et senere tidspunkt, latent infeksjon eller i verste fall kronisk aktiv sykdom 5.
Det har tidligere ikke vært noen in vitro vevsmodeller for studier av menneskelig TB. Enkeltcellekulturer av humane makrofager eller andre perifere blodceller er ofte blitt brukt 6,7. Ulempen ved denne tilnærmingen er at de ikke kan gjenspeile dynamikken i ulike celletyper som opererer sammen i et lungevev utsatt for M. tuberkulose en in vitro modell for å være i stand til å utføre funksjonelle og mekanistiske undersøkelser på TB. Cellebasert in vitro humant lungevev modellen beskrevet her ble opprinnelig etablert av vår gruppe for studier av dendrittiske cellefunksjoner 8. Vi har tilpasset denne metoden for studiet av TB.
Den menneskelige lungevev modell presenteres her består av vevsspesifikke epitelceller og fibroblaster 8. Disse cellene blir dyrket i en matriks av kollagen på toppen av en porøs membran i en transwell innsats og danner strukturer som ligner normalt humant lungevev (figur 1). Når de utsettes for luft cellene begynner å skille ut slim på apikal side 8. Ved å implantere humane primære makrofager smittet med M. tuberkulose til modellen, har vi sett på hvordan immunceller vandrer i vevet og danner tidlige stadier av TB granulomer 9. Dette er den første menneskelig vev modell descrIbed for TB og det utgjør et lovende verktøy for å studere medfødte immunresponser mot tuberkulose og andre sykdommer i lungene. Til dags dato, har vi benyttet bare monocytter og makrofager som immunceller i modellen, men kompleksitetsnivå kan økes ved innlemmelse av flere relevante celletyper.
Figur 1. Skjematisk omriss av lungevev modell. (A) Modellen er sammensatt av human lunge-spesifikke epitelceller, M. tuberkulose -infected primære makrofager og rødt fargestoff merket monocytter seedet på kollagen innebygd fibroblaster forberedt på en transwell filter. Eksponering av vevet modellen til luft initierer produksjonen av ekstra-cellulære matriksproteiner, slimsekresjon og lagdeling av epitelet. 3D-modell for vev og dermed utviklet er et nyttig verktøy for å studere M. tuberkulose infeksjon i et miljø som CLOog omgir ligner en menneskelig lunge. (B) Representative mikroskopiske bilder av de forskjellige trinnene i fremstillingen av vev-modellen. (C) Fullstendig strukturen av lungevevet modellseksjon. Scale -. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Merk: Human perifert blod fra friske anonyme blodgivere kjøpt på blodbanken i Linköping universitetssykehus, ble Sverige brukt som kilde av immunceller for denne studien. Denne protokollen er konstruert for 24 mm til 6-brønns plateinnsatser. Direkte tilpasning til andre brønn formater er ikke anbefalt siden vev modellkontrakter både vertikalt og horisontalt under utvikling.
1. Utarbeidelse av Materials, Media og kultur av bakterier / cellelinjer
- Kultur av bakterier:
- Grow mycobakteriell belastningen M. tuberculosis H37Rv bærer pFPV2 plasmidet for å konstitutivt uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP), i Middlebrook 7H9 medium inneholdende 0,05% Tween-80, 0,5% glycerol, kanamycin (20 ug / ml), og supplert med Middle albumin, dekstrose og katalase anrikning ( Middle ADC Enrichment), ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-10 dager.
Merk: Alle eksperimentell trinns involverer levende virulent M. tuberkulose stammer bør utføres i et BSL-3 anlegg.
- Grow mycobakteriell belastningen M. tuberculosis H37Rv bærer pFPV2 plasmidet for å konstitutivt uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP), i Middlebrook 7H9 medium inneholdende 0,05% Tween-80, 0,5% glycerol, kanamycin (20 ug / ml), og supplert med Middle albumin, dekstrose og katalase anrikning ( Middle ADC Enrichment), ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-10 dager.
- Forbered 1x Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) komplett medium (supplementert med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 10 % varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS)). Forbered også antibiotika-free DMEM komplett medium.
- Forbered 1x Minimum Essential Medium (MEM) komplett medium (1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, og 10% varme- inaktivert føtalt bovint serum (FBS)).
- Utarbeidelse av fibronectin / kollagen-belagt kolber (totalt 10 ml):
- Pipetter 8,8 ml steril 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) til et rent rør. Tilsett 1 ml bovint serumalbumin (1 mg / ml), 100 pl type I kollagen (3 mg / ml) og 100 ul rekombinant human fibronektin (1 mg / ml).
- Bland løsningen ved å snu røret opp ned 5 ganger. Kolber er belagt med et fibronektinet / kollagen løsning (1 ml for en T-25 og 2 ml til en T-75 kolbe). La den stå O / N ved 37 ° C. Etter inkubering, fjernes oppløsningen og lagre de belagte kolbene ved RT.
Merk: Det oppsamlede løsning kan lagres ved 4 ° C og gjenbrukt for tre ganger. Lagring i mer enn 2 uker, kan føre til at væsken å bli brun (dannelse av krystaller), hvoretter det må kasseres.
- Culture of fibroblaster:
- Vokse og vedlikeholde MRC-5, (en human lunge fibroblast cellelinje avledet fra normalt lungevev av en 14-ukers gamle hann foster), i fullstendig DMEM i 5% CO2 ved 37 ° C. Bruk fibroblaster på passasjer 24-26 og vokse til 70-80% sammenflytende.
Merk: MRC-5 cellelinje ved passering> 30 har en tendens til å miste morfologi og anbefales ikke for bruk i vevet modell.
- Vokse og vedlikeholde MRC-5, (en human lunge fibroblast cellelinje avledet fra normalt lungevev av en 14-ukers gamle hann foster), i fullstendig DMEM i 5% CO2 ved 37 ° C. Bruk fibroblaster på passasjer 24-26 og vokse til 70-80% sammenflytende.
- Culture of epitelceller:
- Skaff 16HBE14o- (16HBE), en udødeliggjort human bronkial epitelcellelinje som beholder den differensierte morfologi og funksjon av normal menneskelig luftveis epitel, (dette var en gave fra Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco , USA 10.). Culture 16HBE celler i fibronektin / kollagen-belagte kolber og opprettholder cellene i komplett MEM i 5% CO2 ved 37 ° C.
- Utarbeidelse av 5x DMEM
- Forbered 5x DMEM ved å oppløse 13,4 g pulver DMEM og 3,7 g natriumbikarbonat i 150 ml sterilt destillert vann. Juster pH i mediet til 7,3, utgjør volumet til 200 ml og filtrerer den med 0,22 um membranfilter. Samle det filtrerte medium i en steril beholder og lagres inntil bruk ved RT.
2. Utarbeidelse av kollagen-innvevde Fibroblaster
- Tine frosne porsjoner av FBS og L-glutamin i et 37 ° C vannbad.Etter opptining holde prøvene på is. Plasser Natriumbikarbonat (71,2 mg / ml) og gentamicin (50 mg / ml) ved 4 ° C. Pre-kule 50 ml sentrifugerør og 10 ml sterile pipetter til 4 ° C.
Merk: Alle materialer (bortsett fra 5x DMEM) er kjølt på is før bruk, og alle trinnene er utført på is. Type I kollagen (1,1 mg / ml) må holdes kald, da dette hindrer størkning av kollagen. - Forbered fibroblastceller:
- Varm Trypsin i et 37 ° C vannbad og inkuber tilstrekkelig mengde med lungefibroblaster (MRC-5-celler) i 10 minutter ved 5% CO2 ved 37 ° C. Nøytralisere trypsin ved å legge 1x DMEM komplett. Aspirer cellesuspensjonen og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender cellene på 2,3 x 10 5 celler / ml i DMEM komplett. Plasser cellene på is inntil den er klar til bruk.
- Forbered pre-mix:
- Legg til følgende i et rør merket "pre-mix"; 395ul 5x DMEM, 40 ul L-Glutamin, 120 mL NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 mikroliter FBS, 5 mL Gentamicin (50 mg / ml), Total volum 1000 mL, deretter virvle pre-bland godt og legg på is.
Merk: De angitte volumene er for en 24 mm 6-brønnen kultur innsats. Beregne bestemte beløp som kreves for det totale antall innsatser men legger man ekstra for å være sikker, er nok pre-mix forberedt.
- Legg til følgende i et rør merket "pre-mix"; 395ul 5x DMEM, 40 ul L-Glutamin, 120 mL NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 mikroliter FBS, 5 mL Gentamicin (50 mg / ml), Total volum 1000 mL, deretter virvle pre-bland godt og legg på is.
- Klargjør acellular kollagen blanding:
- Til hver kultur tilsett 1 ml acellulær kollagen blanding. Legg til følgende til en 50 ml konisk rør på is i den gitte rekkefølge; 686 mL av 1,1 mg / ml kollagen, 250 mL Pre-mix og 64 mL 1x komplett DMEM til et totalvolum på 1.000 ul. Bland løsningen godt sikrer ingen luftbobler. Arbeide raskt og tilsett kollagen på veggen av røret for å unngå luftbobler.
- Tilsett 1 ml av acellulær lag blandingen til innsatsen er plassert i 6-brønners plate. Ikke legg noe medium til godt utenfor innsatsen. Icubate i 30 minutter i en 37 ° C inkubator. Kontroller at acellulær blandingen dekker hele innsatsen uten luftbobler.
- Forbered mobil kollagen blanding:
- Bland komponenter av cellelaget i et 50 ml konisk rør holdes på is i følgende rekkefølge; 2 ml kollagen, 615 ul forblanding, 58 ul av 1 x komplett DMEM og 327 ul cellesuspensjon lungefibroblaster (MRC-5) for å gjøre det totale volum opp til 3000 mL. Hver kultur krever 3 ml celle kollagen blanding.
KRITISK STEP: Sørg for å blande kollagen og premix nøye før tilsetting av cellesuspensjonen. Dette vil nøytralisere pH av kollagen for å unngå toksiske effekter på fibroblaster. - Tilsett cellelag (3 ml) på toppen av acellulær kollagensjikt og inkuber i 2 timer i en 37 ° C inkubator. Arbeide raskt og tilsett kollagen på veggen av røret for å unngå luftbobler.
- Etter polymerisasjon, tilsett 2 ml DMEM komplett til tHan bunnen av 6 brønn plate (under innsatsen) og inkuberes i 24 timer.
MERK: Hvis polymerisering ikke skjedde, forkaste plate inserts inneholder fibroblast-kollagen matrise og oppstart på nytt. Den mest sannsynlige årsaken er en feil i tillegg eller feil volumet av en av de ovennevnte reagenser.
- Bland komponenter av cellelaget i et 50 ml konisk rør holdes på is i følgende rekkefølge; 2 ml kollagen, 615 ul forblanding, 58 ul av 1 x komplett DMEM og 327 ul cellesuspensjon lungefibroblaster (MRC-5) for å gjøre det totale volum opp til 3000 mL. Hver kultur krever 3 ml celle kollagen blanding.
3. Kontinuerlig Culture of fibroblast-kollagen Matrix
- Løft forsiktig innsatsen med en ren pinsett og aspirer dyrkingsmedier fra bunnen av brønnen. Tilsett 2 ml komplett DMEM til bunnen av brønnen, etterfulgt av 2 ml komplett DMEM i innsatsen. Unngå å innføre luftbobler under innsatsen, da dette vil hindre diffusjon av næringsstoffer mellom de ytre og indre kamre. Fjern luftbobler med en mikropipette tips.
- Endre kulturen media (inni og under innsats) annenhver dag og kultur i ca 5-7 dager. Vær forsiktig i å fjerne media fra innsatsen. For å unngå contact med fibroblast-kollagen matrise, litt skrå innsatsen med en ren pinsett og aspirer media fra innleggs vegger.
KRITISK STEP: De fibroblaster i kollagenmatriksen bør få en langstrakt fenotype, og renovere kollagen, som deretter kontrakter. Etter ca 5-7 dager, har matrisen kontrahert for å danne en plattform (10 til 14 mm i diameter) i midten av innsatsen. Den sammentrukne matrisen er ferdig til bruk i det neste trinn. For å oppnå en jevn sammentrekning av matriksen er det avgjørende at fibroblastene er godt blandet med kollagen før såing (trinn 2.6.1).
4. Seeding av immunceller (Infected / Uinfiserte Monocyte-makrofag blanding)
Merk: Følgende eksperimentelle trinnene skal virulente mykobakterier og må derfor utføres i en BSL-3 anlegg.
- Fremstilling av primære monocytter og makrofager:
- Isolere perifert blod monocytter fra donor blod ved hjelp av en utviklskur protokollen. Isoler monocytter på samme dag som setter opp vev modell og kultur og skille dem i makrofager i ca 7 dager før infeksjon med M. tuberkulose.
MERK: Dette vil sikre både makrofagene og den kontraktsfestede fibroblast-kollagenmatriksen er tilgjengelig etter 7 dager. Isolere også ferske monocytter som vil bli lagt sammen med de infiserte makrofager.
- Isolere perifert blod monocytter fra donor blod ved hjelp av en utviklskur protokollen. Isoler monocytter på samme dag som setter opp vev modell og kultur og skille dem i makrofager i ca 7 dager før infeksjon med M. tuberkulose.
- Utarbeidelse av M. tuberkulose -infected makrofager
- Høste dyrkede bakterier, vaskes med 1 x PBS inneholdende 0,05% Tween-80, resuspender i antibiotika-fritt fullstendig DMEM, passere gjennom en avkortet steril 27 G nål for å spre bakterielle klumper og måle den optiske tetthet.
Merk: Forhånds bestemme M. tuberkulose kolonidannende enhet ekvivalenter av optisk tetthet i laboratoriet. Dette vil gi et estimat over antall bakterier for å bli brukt for infeksjon. - Inkuber makrofager i 4 timer med <em> M. tuberkulose ved multiplisitet av infeksjon (MOI) 10). Etter infeksjon, vaskes 3 ganger med 1 x PBS for å fjerne de ekstracellulære bakterier. Bruke ikke-infiserte makrofager dyrket på samme måte, men uten M. tuberkulose, som kontroller.
- Løsne makrofager fra kulturplaten ved behandling med 2 mM EDTA i 10 min ved 37 ° C og resuspenderes cellene i antibiotika-fritt fullstendig DMEM.
- Høste dyrkede bakterier, vaskes med 1 x PBS inneholdende 0,05% Tween-80, resuspender i antibiotika-fritt fullstendig DMEM, passere gjennom en avkortet steril 27 G nål for å spre bakterielle klumper og måle den optiske tetthet.
- Merking av monocytter
Note: Isolering og merking av monocytter kan utføres i BSL-2-benk og deretter tatt inn i BSL-3 anlegg for videre behandling.- Flekk nylagede monocytter (2 x 10 7 celler) med en endelig konsentrasjon på 2 uM PKH26 rødt fargestoff i 5 min, i henhold til produsentens instruksjoner. Vask 3 x og resuspender cellene med antibiotika-fritt fullstendig DMEM i en tetthet på 1 x 10 7 celler / ml.
- Tilsetning av immunceller for å fibroblast-kollagenmatriksen
- After 5-7 dagers dyrking av fibroblast-kollagen matriks, aspirer kulturmedium fra de ytre og indre kamre og tilsett 1,5 ml ny antibiotika-fritt DMEM fullstendig til det ytre kammer.
- Forbered en merket monocyttlignende makrofag (infisert / smittet) blanding med en ratio på MO: MQ (5: 1) i 50 mL DMEM komplett. For 50.000 makrofager, ta 250.000 merket monocytter.
- Tilsett 50 ul MO: MQ blandingen til fibroblast-kollagenmatriksen og inkuberes i 1 time i 5% CO2 ved 37 ° C. Etter inkubasjon tilsett 2 ml dyrkningsmedier inn innsatsen og inkuberes i ytterligere 24 timer i 5% CO 2 ved 37 ° C.
Merk: Som celler lagt er løst festet, bør tillegg av media være treg ved forsiktig å legge på veggene av innsatsen.
5. Seeding av Lung Epitelceller (16HBE)
Merk: Følgende trinn må utføres i en BSL-3 anlegg.
- Seed lunge epithelial celler (16HBE) på toppen av MO: MQ-fibroblast-kollagen laget. For å utføre dette, først distansere 16HBE celler fra kolben ved behandling med trypsin (som i 2.2.1.) Og resuspender på 4 x 10 6 celler / ml i antibiotika-free DMEM.
- Aspirer dyrkingsmedier på innsiden og utsiden av innsatsen. Deretter legger 1,5 ml antibiotika-fritt DMEM fullstendig i bunnen av brønnen utenfor innsatsen.
- Tilsett 50 ul 16HBE på toppen av immuncelle fibroblast kollagenmatriksen. Permisjon for 2 min i panseret og inkuberes i 1 time i 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Etter inkubering, tilsett forsiktig 2 ml av antibiotika-fritt DMEM fullstendig i innsatsen og kulturen ved 37 ° C i 3 dager. Kulturen trinn letter spredning av epitelceller i vevet modell.
Merk: Som celler lagt er løst festet, bør tillegg av media være langsom og forsiktig ved å skyve gjennom vegger av innsatsen.
6. Air-eksponering av 3D LungModell
Merk: Etter dag 5 etter tilsetting av infiserte makrofager, vevet modeller er luft-eksponert og de følgende trinnene må utføres i en BSL-3 anlegg.
- Aspirer dyrkingsmedier på innsiden og utsiden av innsatsen.
Merk: I dette trinnet supernatanter kan samles for påvisning av utskilte faktorer. Sentrifuger, steril-filter og lagre Supernatantene ved -70 ° C. - Legg 1,8 ml antibiotika-fritt DMEM fullstendig i det ytre kammer og inkuberes i 5% CO2 ved 37 ° C inkubator i 2 dager. Ikke legg til kulturmedier i innsatsen.
MERK: Air-løfting av vev modellen muliggjør dannelsen av stratifisert epitel og slim, som gir styrke til vevet og fysiologisk likhet med menneskelig lungevevet.
7. Høsting og Montering av 3D lungevev Model
Merk: Følgende trinn må utføres i en BSL-3 anlegg.
- På dag 7 etter implantasjon av infiserte makrofager, vevet modellene er klare for høsting. Fjern kultur media helt fra vevet modell. Fest vev modell med 4% paraformaldehyd i 30 minutter i mørke ved RT. Dette trinnet dreper bakterier og fikserer vev / celle-morfologi for videre behandling.
- Ved hjelp av en skalpell, skiller membranen fra brønnen innsatsen. Overfør membranen som inneholder vevet til en brønn inneholdende 1 x PBS.
- Kutte og fjerne sidene av vevet modellen ved hjelp av en ren skalpell. Deretter skjære vevet modell i 4 tilnærmet like firkantede biter. Overfør et stykke vev på en Superfrost glass lysbilde. Oppbevar vev stykker i 1x PBS ved 4 ° C.
- Tørk vev i 5 min og montere hjelp forlenge Gold antifade med DAPI og dekkglass. La lysbildene uten å forstyrre i mørket ved RT til tørr.
Merk: Tykkelsen av vev kan variere mellom sentrum og periferien, forårsaker liten tilting av dekkglass. For å unngå dette, kan en spacer (for eksempel Parafilm) plasseres på hjørnet av dekkglass. - Påfør neglelakk til kantene av dekkglass og la den tørke. Fordype lysbildene i 70% etanol for å gjøre dem trygge å bringe ut av BSL-3 anlegg.
8. Visualisering, Oppkjøp og Kvantitativ 3D analyse
- Visual vevet glir ved hjelp av et konfokalt mikroskop system med laser sender ut ved 488 nm for eksitasjon av GFP (grønt kanal), 420 nm for DAPI (blå) og 555 nm for de PKH26-merkede monocytter (rød) respektivt.
- Tilegne seg 3D-bilder på en 512x512 oppløsning med Z-stabler dekker på minimum 20 mikrometer tykkelse og med fra 1 - 1,5 mikrometer skille mellom stabler. Erverve 5-10 ulike felt som dekker hele stykke vev.
Merk: Bruk konfigurasjons som Nyqvist for optimale innstillinger for optisk oppløsning (bølgelengde, laser makt / eksponering, pikselstørrelse og zoom). Unngå unDer eller over metning av piksler. - Analyser konfokale bilder med 3D-bildebehandling. For 3D kvantifisering av cellegrupper, er følgende trinn anbefales for optimal analyse.
- Åpne 3D bildebehandling og laste bildet. Måle dimensjonene på objekter som skal analyseres i bildet, for eksempel størrelsen av en kjerne, individuell monocytt og enkle bakterier. Disse observasjonene er nyttige for å definere filtrering eller objektene.
- Ved hjelp av en skjerm justeringsverktøy, optimalisere volumgjengivelse ved å justere hver kanal for bilde kontrast, lysstyrke og bland opasitet. Dette trinnet er å minimalisere forstyrrelser av støy i volumgjengivelse.
Merk: Gammakorreksjon kan føre til manipulering av bilder og derfor bør unngås. - Lag overflater ved å velge den røde kanalen (monocytter) og sette terskelen (automatisk eller manuelt valg). Hvis det er nødvendig, bruke filtre for å begrense utvalget av røde monocytter eller å utelukke background. Tilsvarende lage flater for grønn (M. tuberculosis) og blå (kjerner) kanaler som beskrevet ovenfor.
- Eksportere data til MS-Excel-filer. Det er mulig å eksportere en bestemt parameter eller alle dataene. Parametrene som er relevante for analyse av celle clustering er volum, intensitet, antall objekter, antall lydelementer og sphericity.
- Lagre og eksportere bildene i et passende bildeformat helst TIFF.
MERK: Animasjoner kan også gjøres ved hjelp av animasjon menyen og lagret som en mediefil. - Lagre innstillingene analyse av hver kanal ved å legge til parametre alternativet og kan hentes senere ved hjelp av Gjenoppbygg funksjonen. Samtidig analysere flere filer ved hjelp av Batch prosessering verktøy.
Merk: Alle bildene som skal sammenlignes må anskaffes, bearbeidet og analysert på samme måte. For eksempel en 8 bits bilde (256 heltall) ikke bør sammenlignes med et 12 bits bilde (4096 heltall).
Representative Results
En 3D lungevev modell for menneskelig TB kan være effektivt brukes til å studere verts-patogen interaksjoner i M. tuberkulose infeksjon. De grunnleggende trinnene i denne fremgangsmåten, er representative mikroskopiske bilder av forskjellige trinn og en generell mikroskopisk struktur av et tissue seksjon skissert i figur 1. Modellen har flere komponenter av humant lungevev, inkludert lungefibroblaster, bronkiale epitelceller og primære monocytter / makrofager innleiret i 3D-vevet miljø. Foruten å innlemme deler av menneskelig lungevev, ligner modellen fysiologiske forhold nemlig lagdeling av epitel og slim.
Et eksempel på bruk av lungevev modellen i å overvåke et TB-infeksjon er presentert i figur 2. For å visualisere M. tuberkulose -immune cellemigrasjon og samhandling, vi introduserte makrofager smittet med M. tuberkulose som uttrykker GFP(grønn) sammen med de nylig isolerte PKH26-merket monocytter (røde) i vevet modell (blå, DAPI farget for kjerner). På dag 7 etter tilsetning av M. tuberkulose -infected celler til vev modell, avslører konfokalmikroskopi clustering av røde monocytter ved infeksjonsstedet (grønn) (figur 2), som etterligner kjennemerket lesjoner av menneskelig TB 9.
En rekke representative bilder for 3D visualisering av M. tuberkulose -infected vev modell og kvantifisering av cellegruppene er vist i figur 3. 3D visualisering gir brukeren fleksibilitet til å samhandle, undersøke og kvantifisere flere funksjoner i et 3D-bilde. Den romlige ordning med grønne bakterier og røde monocytter klynger kan sees fra den apikale, rotasjons og lateral view figur 3B, som avslører clustering av monocytter på stedet av M. tuberkulose. De klynger ble ikke observert i friske vev (figur 3A). Vi kvantifisert størrelsen og antallet av monocytt cellegrupper og funnet at størrelse (volum) av cellegruppene er forbedret (p <0,001), mens antallet individuelle monocytter ble redusert (p <0,01) i M. tuberkulose infisert vev sammenlignet med ikke-infiserte vev modeller (Figur 3C og 3D). Denne informasjonen validerer vår tidligere funn av tidlig dannelse av arrvev i M. tuberkulose infeksjon observert i lungevev modeller analysert i 2D vevssnitt 9.
Våre data tyder på at vevet modellen gir en naturlig 3D habitat for å undersøke det komplekse verten celle- M. tuberkulose kommunikasjonsnettverk. Vi fant også at 3D-visualisering og kvantitativ analyse er bedre verktøy for å studere funksjonene i vevet modellen (figur 3). Kvantifisering av en celle klynge (granulomer for eksempel) ofte strekke hes til flere cellelag og kan bli fullstendig fanget av et 3D-kvantitativ analyse. Videre visualisering av eksakte romlige og tidsmessige funksjoner i individuelle celler eller bakterier i modellen tillate levende-bildebehandling, migrasjon og sporing studier i en utpekt laboratorium.
Figur 2. Monocyte i vevet modellen klynge rundt virulent M. tuberkulose. Representative konfokale bilder av infisert og M. tuberkulose infisert vev modellen blir presentert. Paneler fra grønt (M. tuberkulose GFP), røde (PKH26-merket monocytter), blå (DAPI-farget kjerner) og fusjonerte kanalene viser rekruttering av monocytter i infisert vev sammenlignet med ikke-infiserte vev. Scale - 100 mikrometer.large.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. 3D-visualisering og kvantitativ analyse av vev modell gi nyttig informasjon. Representative bilder av 3D-visualisering av det hele vev modellen (A) som ikke er infisert vev, (B) infisert med M. tuberkulose, gjennom optisk snitting bruker Zeiss LSM700 konfokalmikroskop og kvantitativ analyse av Imaris bildebehandling (versjon 7.6.8). Disse bildene ble kjøpt til 20X forstørrelse, 14 z-stabler dekker en vev tykkelse på 19,5 mikrometer med 1,5 mikrometer intervall at visualisering fra apikal, rotasjons horisontal, rotasjons vertikal og lateral view (A og B). (C) Quantitative analyse av monocytter cellegrupper avslører forbedret (p <0,0001) størrelsen på tidlige granulomer klynger etter M. tuberculosis-infeksjon sammenlignet med fravær av infeksjon. (D) Kvantifisering av antall monocytter viste en reduksjon (p <0,01) i infisert vev, sammenlignet med ikke-infiserte vev, gjentok flere klynger i det infiserte vevet. Green - M. tuberkulose -GFP, Red - PKH26 merkede monocytter, Blå - cellekjerner, Scale -. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
| 6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
| MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
| 16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
| 5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
| Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
| Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
| Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
| Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
| Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
| PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
| Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
| Tween-80 | |||
| Glycerol | |||
| Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
| Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Trypsin -EDTA | |||
| Bovine serum albumin | |||
| Paraformaldehyde | |||
| DAPI | |||
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
| iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |
References
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).
- Saunders, B. M., Britton, W. J. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).
- Kaufmann, S. H. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. Ann Rheum Dis. 63, Suppl 2. ii50-ii56 (2004).
- Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).
- Barry 3rd, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Puissegur, M. P., et al. An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).
- Kapoor, N., et al. Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation. PLoS One. 8, e53657 (2013).
- Nguyen Hoang,, T, A., et al. Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).
- Parasa, V. R., et al. Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue. Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).
- Cozens, A. L., et al. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Brighenti, S., Andersson, J. Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection. J Infect Dis. 205, Suppl 2. S316-S324 (2012).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, 37-49 (2009).
- Gupta, U. D., Katoch, V. M. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).
- Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).
- Singhal, A., et al. Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection. PLoS One. 6, e18632 (2011).
- Subbian, S., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs. PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).
- Lin, P. L., et al. Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model. Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).
- Rahman, S., et al. Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions. Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).
