Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En 3D Human Lung Tissue Modell för funktionella studier på Published: October 5, 2015 doi: 10.3791/53084

Abstract

Tuberkulos (tbc) fortfarande innehar ett stort hot mot människors hälsa i världen, och det finns ett behov av en kostnadseffektiv men tillförlitliga modeller för att hjälpa oss att förstå sjukdomsmekanismer och främja upptäckter av nya behandlingsalternativ. In vitro cellkulturer av monolager eller co-kulturer saknar den tredimensionella (3D) miljö och vävnadssvar. Häri beskriver vi en innovativ in vitro-modell av en mänsklig lungvävnad, som håller löfte till vara ett effektivt verktyg för att studera de komplexa händelser som inträffar under infektion med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). 3D vävnadsmodell består av vävnadsspecifika epitelceller och fibroblaster, vilka är odlade i en matris av kollagen på toppen av ett poröst membran. Vid luftexponering, epitelcellerna stratify och utsöndrar slem på den apikala sidan. Genom att införa humana primära makrofager infekterade med M. tuberkulos till vävnaden lägel, har vi visat att immunceller vandrar in i infekterade vävnads och bildar tidiga stadier av TB granuloma. Dessa strukturer sammanfatta den utmärker mänsklig TB, den granulom, vilket är fundamentalt annorlunda eller inte vanligt förekommande i allmänt använda experimentella djurmodeller. Denna organotypic odlingsmetod gör det möjligt för 3D-visualisering och robust kvantitativ analys som ger central information om rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos värdcell patogen interaktioner. Sammantaget ger lungvävnaden modellen en fysiologiskt relevant vävnadsmikromiljö för studier på TB. Sålunda har lungvävnadsmodell potentiella konsekvenserna för både grundläggande mekanistiska och tillämpade studier. Viktigt, gör modellen tillägg eller manipulation av enskilda celltyper, som därmed breddar dess användning för modellering en mängd olika infektionssjukdomar som drabbar lungorna.

Introduction

Hos människor, svar på infektion, vävnadsinflammation, cellrekrytering, vävnadsombildning och regleringen av vävnadshomeostas är komplexa händelser med olika celltyper. Därför är dessa processer bäst studerade i den lokala vävnadsmiljön. Tidigare har detta främst varit möjligt med hjälp av experimentella djurmodeller. De allmänt använda försöksdjur hålla många begränsningar eftersom de ofta svara på patogener på ett annat sätt än människor och även visa en annan sjukdomsförlopp 1. En människa in vitro-lungvävnaden modellen håller möjligheterna att studera specifika immunsvar i den mänskliga lungan.

Tuberkulos infektion Human (TB) är främst en sjukdom som drabbar lungorna. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), det orsakande medlet av TB, når lungorna via aerosoldroppar som transporteras till den alveolära utrymmet, där bakterierna uppslukas av pulmonell dendritic celler och alveolmakrofager som en del av det medfödda immunsvaret mot infektionen 2,3. Fagocytos av patogenen leder till uppdelning av felet inom en phagosome och helst resulterar i neutralisering och dödandet av patogenen genom fagocyt. Upp till 50% av de individer som utsätts för M. tuberkulos tros kunna rensa smitta genom det medfödda immunsvaret 4. Andra resultat av infektion är klartecken av det adaptiva immunsystemet i ett senare skede, latent infektion eller i värsta fall kronisk aktiv sjukdom 5.

Tidigare har det inte funnits några in vitro vävnadsmodeller för studier av mänsklig TB. Enstaka cellkulturer av humana makrofager eller andra perifera blodceller har ofta använts 6,7. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att de inte kan återspegla dynamiken hos olika celltyper som verkar tillsammans i en lungvävnad exponerad för M. tuberkulos en in vitro-modell för att kunna utföra funktionella och mekanistiska studier på tuberkulos. Den cellbaserade in vitro human lungvävnad modell som beskrivs här upprättades ursprungligen av vår grupp för studier av dendritiska cellfunktioner 8. Vi har anpassat denna metod för att studera TB.

Modellen mänsklig lungvävnad presenteras här består av vävnadsspecifika epitelceller och fibroblaster 8. Dessa celler odlas i en matris av kollagen på toppen av ett poröst membran i en transwell insert och bildar strukturer som liknar normal humanlungvävnad (Figur 1). När de utsätts för luft cellerna börjar utsöndra slem på den apikala sidan 8. Genom att implantera humana primära makrofager infekterade med M. tuberkulos till modellen, har vi observerat hur immunceller vandrar i vävnaden och bildar tidiga stadier av TB granulom 9. Detta är den första humana vävnadsmodell described för TB och det utgör ett lovande verktyg för att studera medfödda immunsvar mot tuberkulos och andra sjukdomar i lungan. Hittills har vi använt endast monocyter och makrofager som immunceller i modellen men nivån av komplexitet kan ökas genom införande av ytterligare relevanta celltyper.

Figur 1
Figur 1. Schematisk skiss av lungan vävnadsmodell. (A) Modellen består av humana lungspecifika epitelceller, M. tuberkulos infekterade primära makrofager och rött färgämne märkta monocyter såddes på kollagen inbäddade fibroblaster beredda på en transwell filter. Exponering av vävnadsmodell för luft initierar produktion av extracellulära matrixproteiner, slemsekretion och skiktning av epitel. 3D vävnadsmodell därför utvecklat är ett användbart verktyg för att studera M. tuberkulosinfektion i en miljö som closely liknar en mänsklig lunga. (B) Representativa mikroskopiska bilder av de olika stegen i framställningen av vävnadsmodell. (C) Komplett struktur lungmodell sektionen vävnaden. Scale -. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Obs: Humant perifert blod från friska anonyma blodgivare som köpts på blodbanken Linköpings Universitetssjukhus, var Sverige används som källa av immunceller för denna studie. Detta protokoll är avsedd för 24 mm 6-brunnars plattskär. Direkt anpassning till andra och format rekommenderas inte eftersom vävnadsstandardkontrakt både vertikalt och horisontellt under utveckling.

1. Beredning av material, media och kultur av bakterier / cellinjer

  1. Bakteriekultur:
    1. Odla mykobakteriella stam M. tuberculosis H37Rv bär pFPV2 plasmiden att konstitutivt uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP), i Middlebrook 7H9-medium innehållande 0,05% Tween-80, 0,5% glycerol, kanamycin (20 | ig / ml), och kompletterat med Middlebrook-albumin, dextros och katalas anrikning ( Middlebrook ADC Enrichment), vid 37 ° C med 5% CO2 under 7-10 dagar.
      Obs: Alla experimentella stegar inbegriper levande virulent M. stammar tuberkulos bör utföras i en BSL-3 anläggning.
  2. Bered 1x Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) komplett medium (kompletterat med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror och 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS)). Förbered också antibiotikafritt DMEM komplett medium.
  3. Bered 1x Minimum Essential Medium (MEM) komplett medium (1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror och 10% värme inaktiverat fetalt bovint serum (FBS)).
  4. Framställning av fibronektin / kollagenbelagda kolvar (totalt 10 ml):
    1. Pipettera 8,8 ml steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till ett rent rör. Tillsätt 1 ml bovint serumalbumin (1 mg / ml), 100 | il typ I bovint kollagen (3 mg / ml) och 100 pl rekombinant huMannen fibronektin (1 mg / ml).
    2. Blanda lösningen genom att vända röret upp och ned 5 gånger. Kolvar är belagda med ett fibronektin / kollagenlösning (1 ml för en T-25 och 2 ml för en T-75-kolv). Lämna det O / N vid 37 ° C. Efter inkubation, ta bort lösningen och lagra de belagda kolvar vid RT.
      Obs: Den uppsamlade lösningen kan lagras vid 4 ° C och återanvändas för tre gånger. Lagring under mer än 2 veckor kan orsaka att vätskan bli brun (bildning av kristaller), varpå det måste kasseras.
  5. Odling av fibroblaster:
    1. Växa och behålla MRC-5, (en human lunga fibroblastcellinje härledd från normal lungvävnad hos en 14-veckor gamla manliga foster), i fullständigt DMEM i 5% CO2 vid 37 ° C. Använd fibroblaster vid passagerna 24-26 och växa tills 70-80% sammanflytande.
      Obs: MRC-5-cellinjen vid passage> 30 tenderar att förlora morfologin och rekommenderas inte för användning vid vävnadsmodell.
  6. Kultur av epitelceller:
    1. Skaffa 16HBE14o- (16HBE), en immortaliserad human bronkialepitelceller cellinje som behåller den differentierade morfologi och funktion av normal mänsklig luftvägsepitel, (detta var en gåva från Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco USA 10.). Kultur 16HBE celler i fibronektin / kollagenbelagda kolvar och bibehålla cellerna i komplett MEM i 5% CO2 vid 37 ° C.
  7. Framställning av 5x DMEM
    1. Förbered 5x DMEM genom upplösning 13,4 g DMEM-pulver och 3,7 g natriumbikarbonat i 150 ml sterilt destillerat vatten. Justera pH i mediet till 7,3, göra upp volymen till 200 ml och filtrera den med 0,22 um membranfilter. Samla det filtrerade mediet i en steril behållare och lagras fram till användning vid RT.

2. Framställning av kollagen-inbäddade fibroblaster

  1. Tina frysta portioner av FBS och L-glutamin i en 37 ° C vattenbad.Efter upptining hålla proverna på is. Placera Natriumbikarbonat (71,2 mg / ml) och gentamicin (50 mg / ml) vid 4 ° C. Pre-kyler 50 ml centrifugrör och 10 ml sterila pipetter till 4 ° C.
    Obs: Allt material som används (utom 5x DMEM) kyls på is före användning och alla steg utförs på is. Typ I kollagen från nötkreatur (1,1 mg / ml) måste hållas kall, eftersom detta förhindrar stelning av kollagen.
  2. Förbered fibroblastceller:
    1. Varm trypsin i en 37 ° C vattenbad och inkubera tillräcklig mängd med lungfibroblaster (MRC-5) celler under 10 min vid 5% CO2 vid 37 ° C. Neutralisera trypsinet genom tillsats 1x DMEM komplett. Aspirera cellsuspensionen och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna vid 2,3 x 10 5 celler / ml i DMEM komplett. Placera cellerna på is tills klar för användning.
  3. Förbered förblandningen:
    1. Lägg till följande till ett rör märkt "förblandning"; 395pl 5x DMEM, 40 pl L-glutamin, 120 pl NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 pl FBS, 5 pl Gentamicin (50 mg / ml), Total volym 1000 pl, sedan virvlar före blanda väl och sätta på is.
      Obs: De volymer som anges är för en 24 mm 6-väl odlingsinsatsen. Beräkna specifika belopp som krävs för det totala antalet insatser men lägg till en extra för att vara säker, är tillräckligt förblandning framställdes.
  4. Förbered acellulära kollagenblandningen:
    1. Till varje kultur tillsätt 1 ml av acellulärt kollagenblandning. Lägg till följande till en 50-ml koniskt rör på is i angiven ordning; 686 pl av 1,1 mg / ml kollagen, 250 pl förblandning och 64 pl 1x komplett DMEM till en totalvolym av 1000 il. Blanda lösningen väl garantera några luftbubblor. Arbeta snabbt och tillsätt kollagen på väggen av röret för att undvika luftbubblor.
    2. Tillsätt 1 ml av det acellulära skiktet blandningen till insatsen placeras i sex brunnar. Lägg inte till något medium till brunnen utanför insatsen. Icubate för 30 min i en 37 ° C inkubator. Se till det acellulära blandningen täcker hela skäret utan några luftbubblor.
  5. Förbered cellkollagenblandningen:
    1. Blanda komponenterna i det cellulära skiktet i en 50 ml koniskt rör på is i följande ordning; 2 ml kollagen, 615 pl Pre-mix, 58 il 1x komplett DMEM och 327 pl cellsuspensions lungfibroblaster (MRC-5) för att kompensera den totala volymen till 3000 l. Varje kultur kräver 3 ml av cellulär kollagenblandning.
      Avgörande steg: Se till att blanda kollagen och förblandning noggrant före tillsats av cellsuspensionen. Detta kommer att neutralisera pH-värdet för kollagen för att undvika toxiska effekter på de fibroblaster.
    2. Lägg det cellulära skiktet (3 ml) på toppen av det acellulära kollagenskiktet och inkubera i 2 h i en 37 ° C inkubator. Arbeta snabbt och tillsätt kollagen på väggen av röret för att undvika luftbubblor.
    3. Efter polymerisation, tillsätt 2 ml DMEM komplett till than botten av 6 brunnar (under insats) och inkubera under 24 timmar.
      OBS: Om polymerisation inte förekomma, kasta plattan skär innehållande fibroblast-kollagenmatrisen och start om igen. Den troligaste orsaken är ett fel i tillägg eller felaktig volym ett av de ovan angivna reagens.

3. Kontinuerlig kultur av Fibroblast-kollagen Matrix

  1. Lyft försiktigt insatsen med en ren pincett och aspirera odlingsmedierna från botten av brunnen. Tillsätt 2 ml fullständigt DMEM till botten av brunnen följt av 2 ml fullständigt DMEM i insatsen. Undvika att införa luftbubblor bildas under insatsen, eftersom detta kommer att förhindra att diffusion av näringsämnen mellan de yttre och inre kamrarna. Ta bort luftbubblor med en mikropipett spets.
  2. Ändra odlingsmedia (inom och under insatsen) varannan dag och kultur under ca 5-7 dagar. Var försiktig i att ta bort media från insatsen. För att undvika contact med fibroblast-kollagenmatrisen, något luta insatsen med en ren pincett och aspirera media från insatsväggarna.
    Kritiskt steg: De fibroblaster i kollagenmatrisen bör få en långsträckt fenotyp, och omforma den kollagen, som sedan kontrakt. I omkring 5-7 dagar, har matrisen anlitats för att bilda en plattform (10-14 mm i diameter) i centrum av skäret. Den kontrakterade matrisen är klar för användning i nästa steg. För att erhålla en likformig sammandragning av matrisen är det kritiskt att fibroblasterna är väl blandade med den kollagen före sådd (steg 2.6.1).

4. Sådd av immunceller (Infekterade / Oinfekterade Monocyte-makrofag Blandning)

Obs: Följande experimentella steg innebär virulenta mykobakterier och därför måste utföras i en BSL-3 anläggning.

  1. Framställning av primära monocyter och makrofager:
    1. Isolera perifera blodmonocyter från donatorblod med användning av en establiskjul protokoll. Isolera monocyter på samma dag som inrättandet av vävnadsmodell och kultur och differentiera dem i makrofager i cirka 7 dagar före infektion med M. tuberkulos.
      OBS: Detta kommer att säkerställa både makrofager och den kontrakterade fibroblast-kollagenmatris finns efter 7 dagar. Isolera också färska monocyter som kommer att läggas tillsammans med de infekterade makrofagerna.
  2. Framställning av M. makrofager tuberculosis-infekterade
    1. Skörda de odlade bakterierna, tvätta med 1 x PBS innehållande 0,05% Tween-80, återsuspendera i antibiotikafritt fullständigt DMEM, passera genom en stympad steril 27 G nål för att dispergera bakteriella klumpar och mäta den optiska densiteten.
      Obs: Pre-bestämma M. tuberkulos kolonibildande enhets ekvivalenter optisk densitet i laboratoriet. Detta kommer att ge en uppskattning av antalet bakterier som skall användas för infektion.
    2. Inkubera makrofagerna under 4 timmar med <em> M. tuberkulos på den mångfald av infektion (MOI) 10). Efter infektion, tvättas 3x med 1 x PBS för att avlägsna de extracellulära bakterierna. Använd oinfekterade makrofager odlade på samma sätt men utan M. tuberkulos, som kontroller.
    3. Drag av makrofagerna från odlingsplattan genom behandling med 2 mM EDTA under 10 min vid 37 ° C och återsuspenderades cellerna i antibiotikafritt fullständigt DMEM.
  3. Märkning av monocyter
    Anmärkning: Isolering och märkning av monocyter kan utföras i BSL-2 bänk och sedan tas in i BSL-3 anläggning för ytterligare behandling.
    1. Stain nyberedda monocyter (2 x 10 7 celler) med en slutlig koncentration av 2 | iM PKH26 rött färgämne under 5 min, i enlighet med tillverkarens instruktioner. Tvätta 3x och återsuspendera cellerna med antibiotikafritt komplett DMEM vid en densitet av 1 x 10 7 celler / ml.
  4. Tillsats av immunceller till fibroblastliknande kollagenmatris
    1. ENfter 5-7 dagars odling av fibroblastliknande kollagenmatrisen, aspirera odlingsmedierna från de yttre och inre kamrarna och tillsätt 1,5 ml färskt antibiotikafritt DMEM komplett till den yttre kammaren.
    2. Förbered en märkt monocyt-makrofag (oinfekterade / smittade) blandning med ett förhållande MO: MQ (5: 1) i 50 pl DMEM komplett. För 50.000 makrofager, ta 250.000 märkta monocyter.
    3. Lägg 50 pl MO: MQ blandningen till fibroblastliknande kollagenmatrisen och inkubera under 1 h i 5% CO2 vid 37 ° C. Efter inkubering försiktigt tillsätt 2 ml av odlingsmedium i insatsen och inkubera under ytterligare 24 h i 5% CO2 vid 37 ° C.
      Obs: Som celler tillsatta är löst fästa, bör tillägg av media vara långsam genom att försiktigt tillsätta på väggarna i insatsen.

5. Sådd av lungepitelceller (16HBE)

Obs: Följande steg måste utföras i en BSL-3 anläggning.

  1. Utsäde lunga epithelial celler (16HBE) ovanpå MO: MQ-fibroblast-kollagenskiktet. För att utföra detta först skilja 16HBE celler från kolven genom behandling med trypsin (som i 2.2.1.) Och återsuspendera på 4 x 10 6 celler / ml i antibiotikafritt DMEM.
  2. Aspirera odlingsmedia insidan och utsidan av insatsen. Tillsätt sedan 1,5 ml antibiotikafritt DMEM komplett i botten av brunnen utanför insatsen.
  3. Tillsätt 50 pl av 16HBE ovanpå immuncell fibroblast kollagenmatrisen. Låt stå i 2 min i huven och inkubera under 1 h i 37 ° C inkubator med 5% CO2. Efter inkubationen, till försiktigt 2 ml antibiotikafritt DMEM fullständig inom insatsen och odling vid 37 ° C under 3 dagar. Kulturen steget underlättar proliferation av epitelceller i vävnadsmodell.
    Obs: Som celler tillsatta är löst fästa, bör tillägg av media vara långsam och varsam genom att skjuta genom väggar insatsen.

6. Luft exponering av 3D LungModell

Obs: Efter dag 5 efter tillsats av infekterade makrofager, vävnads modellerna är luftkonditione exponerade och de följande stegen måste utföras i en BSL-3 anläggning.

  1. Aspirera odlingsmedia insidan och utsidan av insatsen.
    Obs: I detta steg supernatanter kan samlas för detektering av utsöndrade faktorer. Centrifugera, steril filtrera och lagra supernatanter vid -70 ° C.
  2. Lägg 1,8 ml antibiotikafritt DMEM komplett i den yttre kammaren och inkubera i 5% CO2 vid 37 ° C inkubator under 2 dagar. Lägg inte till odlingsmedia i insatsen.
    OBS: Luft lyftning av vävnadsmodell underlättar bildandet av stratifierat epitel och slem sekretion, vilket ger styrkan att vävnaden och fysiologisk likhet med human lungvävnad.

7. Skörd och Montering av 3D-Lung Tissue Modell


Obs: Följande steg måste utföras i en BSL-3 anläggning.

  1. På dag 7 efter implantation av infekterade makrofager, vävnadsmodeller är redo för skörd. Avlägsna odlingsmediet helt från vävnadsmodell. Fäst vävnadsmodell med 4% paraformaldehyd under 30 minuter i mörker vid RT. Detta steg dödar bakterierna och fixerar vävnad / cellmorfologin för vidare bearbetning.
  2. Med användning av en skalpell, separera membranet från brunnen insatsen. Överför membranet innehållande vävnaden till en brunn innehållande 1 x PBS.
  3. Klipp och avlägsna sidorna av vävnadsmodell med hjälp av en ren skalpell. Då skiva vävnadsmodell i 4 ungefär lika stora fyrkantiga bitar. Överför en bit vävnad på en Superfrost glasskiva. Förvara vävnaden bitar i 1x PBS vid 4 ° C.
  4. Torka vävnaden under 5 min och montera med hjälp Förläng Gold antifad med DAPI och täck. Lämna glasen utan att störa i mörker vid RT tills torr.
    Obs: Tjockleken av vävnaden kan variera mellan centrum och periferin, vilket orsakar liten Tilting av täck. För att undvika detta, kan en distans (till exempel parafilm) placeras i hörnet av locket halka.
  5. Applicera nagellack till kanterna på täckglas och låt det torka. Sänk bilderna i 70% etanol för att göra dem säkra att föra ut av BSL-3 anläggning.

8. Visualisering, Förvärv och Kvantitativ 3D analys

  1. Visualisera vävnadsobjektglasen med användning av ett konfokalmikroskop system med lasrar som emitterar vid 488 nm för excitering av GFP (grön kanal), 420 nm för DAPI (blå) och 555 nm för de PKH26-märkta monocyter (röd) respektive.
  2. Förvärva 3D-bilder på en 512x512 upplösning med Z-stackar som täcker minst 20 um tjocklek och med 1-1,5 um separation mellan staplar. Förvärva 5-10 olika områden som omfattar hela bit vävnad.
    Obs: Använd konfigurations såsom Nyqvist för optimala inställningar för optisk upplösning (våglängd, lasereffekt / exponering, pixelstorlek och zoom). Undvik under eller över mättnad av pixlar.
  3. Analysera konfokala bilder med 3D bildbehandlingsprogram. För 3D kvantifiering av cellkluster, är följande steg rekommenderas för optimal analys.
  4. Öppna 3D bildbehandlingsprogram och ladda bilden. Mät dimensionerna hos föremålen som skall analyseras i bilden, till exempel storleken på en kärna, individuell monocyt- och enstaka bakterier. Dessa observationer är användbara för att definiera eller filtrering av föremålen.
  5. Med hjälp av en justeringsverktyg display, optimera volymen rendering genom att justera varje kanal för bildkontrast, ljusstyrka och blanda opacitet. Detta steg är att minimera störningen av brus i volymrendering.
    Obs: Gammakorrigering kan leda till manipulering av bilder och därför bör undvikas.
  6. Skapa ytor genom att välja den röda kanalen (monocyter) och ställ in tröskelvärdet (automatiskt eller manuellt val). Om det behövs, använda filter för att begränsa urvalet av röda monocyter eller att utesluta background. På liknande sätt skapar ytor för grönt (M. tuberculosis) och blå (kärnor) kanaler som beskrivs ovan.
  7. Exportera data till MS-Excel-filer. Det är möjligt att exportera en viss parameter eller alla data. De parametrar som är relevanta för analys av cell klustring är volym, intensitet, antal objekt, antal voxlar och sfäriskhet.
  8. Spara och exportera bilderna i ett lämpligt bildformat företrädesvis TIFF.
    OBS: Animationer kan också göras med hjälp av animation menyn och sparas som en mediefil.
  9. Spara inställningarna analys av varje kanal med hjälp av alternativet lägga till parametrar och kan hämtas senare genom att använda Återskapa funktionen. Samtidigt analysera fler filer med Batchbearbetning verktyget.
    Obs: Alla bilder som ska jämföras måste förvärvas, bearbetas och analyseras på samma sätt. Till exempel en 8 bitars bild (256 heltal) inte bör jämföras med en 12 bitars bild (4096 heltal).

Representative Results

En modell 3D lungvävnad för mänsklig TB effektivt kan användas för att studera värd-patogen interaktioner i M. tuberkulosinfektion. De grundläggande stegen i denna metod, är representativa mikroskopiska bilder av olika steg och ett övergripande mikroskopiska strukturen av en vävnadssektion beskrivs översiktligt i fig 1. Modellen har flera komponenter i mänsklig lungvävnad, inklusive lungfibroblaster, bronkiala epitelceller och primära monocyter / makrofager inbäddade i 3D vävnadsmiljön. Förutom att införliva delar av human lungvävnad, liknar modellen fysiologiska förhållanden nämligen skiktning av epitel och slemutsöndring.

Ett exempel på användningen av vävnadsmodell lungan vid övervakning av en TB-infektion visas i fig 2. För att visualisera M. tuberkulos Immun cell migration och interaktion, introducerade vi makrofager som infekterats med M. tuberkulos som uttrycker GFP(grön) tillsammans med de nyligen isolerade PKH26-märkta monocyter (röd) in i vävnadsmodell (blå, färgade DAPI för kärnor). På dag 7 efter tillsats av M. tuberkulos infekterade celler till vävnadsmodell, avslöjar konfokalmikroskopi kluster av röda monocyter vid infektionsstället (grön) (Figur 2), som härmar kännetecknet lesioner av mänsklig TB 9.

En serie av representativa bilder för 3D visualisering av M. tuberkulos infekterade vävnadsmodell och kvantifiering av cellkluster visas i figur 3. 3D-visualisering ger användaren möjlighet att interagera, undersöka och kvantifiera flera funktioner i en 3D-bild. Den rumsliga arrangemanget av press bakterier och röda monocyt kluster kan ses från den apikala, rotations- och sidovy såsom visas i fig 3B, som avslöjar klusterbildning av monocyter vid stället för M. tuberkulos. Klustren inte obtjänstgjorde i oinfekterade vävnader (figur 3A). Vi kvantifieras storlek och antalet monocyt cellkluster och fann att storleken (volym) av cellkluster förstärks (p <0,001), medan antalet enskilda monocyter minskade (p <0,01) i M. tuberkulos smittade vävnader jämfört med oinfekterade vävnadsmodeller (figur 3C och 3D). Dessa data bekräftar vår tidigare bedömning av tidig granulombildning i M. tuberkulosinfektion observerades i lungvävnad modeller analyseras i 2D vävnadssnitt 9.

Våra data tyder på att vävnadsmodell ger en naturlig 3D-miljö för att utreda komplexa värd cell- M. tuberkulos kommunikationsnätverk. Vi fann också att 3D-visualisering och kvantitativ analys är bättre verktyg för att studera funktionerna i vävnadsmodell (Figur 3). Kvantifiering av en cellkluster (granulom till exempel) ofta stretch hes till flera cellskikt och kan vara helt fångas upp av en 3D kvantitativ analys. Dessutom, visualisering av exakta geografiska och tidsmässiga funktioner i enskilda celler eller bakterier i modellen tillåter levande imaging, migration och spårning studier i ett utsett laboratorium.

Figur 2
Figur 2. Monocyt i vävnadsmodell kluster runt virulent M. tuberkulos. Representativa konfokala bilder av oinfekterade och M. tuberkulos infekterad vävnadsmodell presenteras. Paneler från grön (M. tuberkulos- GFP), röd (PKH26-märkta monocyter), blå (DAPI-färgade kärnor) och sammanslagna kanaler visar rekrytering av monocyter i den infekterade vävnaden jämfört med oinfekterade vävnader. Scale - 100 pm.large.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. 3D-visualisering och kvantitativ analys av vävnadsmodell ge användbar information. Representativa bilder av 3D-visualisering av hela vävnadsmodell (A) oinfekterade vävnad, (B) infekterade med M. tuberkulos, genom den optiska sektionering med hjälp av Zeiss LSM700 konfokalmikroskop och kvantitativ analys av Imaris bildbehandlingsprogram (version 7.6.8). Dessa bilder förvärvades 20X förstoring, 14 z-stackar som täcker en vävnadstjocklek på 19,5 pm med 1,5 um intervall, vilket gör visualisering från apikala, rotations horisontella, roterande vertikal och lateral view (A och B). (C) Quantitative analys av monocyt cellkluster avslöjar förstärkt (p <0,0001) storleken på tidiga granulom kluster efter M. tuberkulosinfektion i jämförelse med frånvaron av infektion. (D) Kvantifiering av antalet monocyter visade en nedgång (p <0,01) i infekterad vävnad jämfört med icke-infekterade vävnader, upprepade fler kluster i den infekterade vävnaden. Grön - M. tuberkulos -GFP, Röd - PKH26-märkta monocyter, blå - cellkärnor, Scale -. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture inserts BD Falcon 353092
6-well culture plates BD Falcon 353046
MRC-5 cells, lung fibroblasts ATCC#CCL-171
16HBE cells, lung epithelial cells Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA 
5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) Gibco 12800-082 Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x Gibco 41965-039
Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts Sigma M4655
Non-Essential Amino Acids Solution, 100x Life Technologies 11140-035
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-024
Sodium Pyruvate Life Technologies 11360-039
NaHCO3 (71.2 mg/ml) Prepared in house
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106 Heat inactivated for 30 min, 56 °C
Gentamicin (50 mg/ml) Gibco 15750-060
Hepes buffer solution 1M Gibco 15630-056
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Gibco 15140-122
Lymphoprep Axis-Shield 7801
Ultrapure 0.5 M EDTA Gibco 15575
Bovine Collagen PA treated (500 ml) Organogenesis 200-055
Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) Advanced biomatrix 5005-B
Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) BD 354008
Primary human monocytes/macrophages Isolated from human whole blood or buffy coats.
PKH26 Red fluorescent cell linker Sigma MINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.
Middlebrook 7H9 medium  Difco 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BBL 211887
Tween-80
Glycerol
Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) Sigma B5264
Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI Invitrogen P36935
Trypsin -EDTA
Bovine serum albumin
Paraformaldehyde
DAPI
LSM700 Confocal microscope Zeiss
iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 Bitplane AG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).
  2. Saunders, B. M., Britton, W. J. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).
  3. Kaufmann, S. H. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. Ann Rheum Dis. 63, Suppl 2. ii50-ii56 (2004).
  4. Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).
  5. Barry 3rd, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  6. Puissegur, M. P., et al. An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).
  7. Kapoor, N., et al. Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation. PLoS One. 8, e53657 (2013).
  8. Nguyen Hoang,, T, A., et al. Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).
  9. Parasa, V. R., et al. Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue. Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).
  10. Cozens, A. L., et al. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
  11. Brighenti, S., Andersson, J. Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection. J Infect Dis. 205, Suppl 2. S316-S324 (2012).
  12. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, 37-49 (2009).
  13. Gupta, U. D., Katoch, V. M. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).
  14. Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).
  15. Singhal, A., et al. Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection. PLoS One. 6, e18632 (2011).
  16. Subbian, S., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs. PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).
  17. Lin, P. L., et al. Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model. Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).
  18. Rahman, S., et al. Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions. Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).

Tags

Infektion , 3D-modell 3D-analys lungvävnad tuberkulos, Granulom
En 3D Human Lung Tissue Modell för funktionella studier på<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braian, C., Svensson, M., Brighenti, More

Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (104), e53084, doi:10.3791/53084 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter