Protocol
Все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами испытуемых Стэнфордский университет человека »и утвержден протокол Экспертный совет.
1. Суставной хондроцитов Изоляция
- Получить хрящ из ткани, выброшенных во время тотального эндопротезирования коленного сустава и анализировать, как описано ранее 8.
- Визуально выбрать медиальной или боковой бедренной мыщелков образцов хряща для гладких поверхностей и сделать разрез на поверхности хряща через скальпелем, чтобы удалить 4-5 мм хряща биопсии без воздействия субхондральной кости.
- Изолировать хондроциты из внеклеточного матрикса путем ферментативного разложения ткани с O / N лечении очищенной коллагеназы. Использование соотношении 1: 1 коллагеназы II (125 Ед / мл) и коллагеназы IV (160 Ед / мл) в среде роста хондроцитов при 37 ° С.
- На следующий день, фильтровать переваренной ткани, содержащей клетки диссоциированных через 70мм размер пор нейлоновая сетка. Промыть два раза с 20 мл DMEM / F12 и центрифуге при 600 х г в течение 5 мин.
- Пластина изолированных хондроциты при плотности 1 х 10 6 клеток / 60 мм чашки для культивирования следующие ресуспендирования в DMEM / F12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 25 мкг / мл аскорбата, 2 мМ L-глутамина, противомикробных препаратов (100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл фунгизона). Хранить пластин при 37 ° С и поддерживают культуры хондроцитов первичные как высокой плотности монослоя до инкапсуляции в биомиметические гидрогелей.
2. Биомиметический Гидрогель Изготовление
Примечание: Этот метод позволяет синтез биомиметического гидрогеля, содержащего поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA, МВт 5000 г / моль), хондроитин сульфат-метакрилат (CS-MA) в DPBS. Добавление фотоинициатора позволяет фотоактивированного сшивание. Окончательный состав гидрогеля содержит 7% вест / объем (вес / объем) PEGDA, 3% вес / объем CS-MA и 0,05% вес / объем фотоинициатора.
- Обобщить CS-MA по функционализации полимера CS с метакрилатными групп.
- Подготовка буферного раствора 50 мМ 2-morpholinoethanesulfonic кислоты (MES) и 0,5 М хлорида натрия (NaCl) путем растворения 1,952 г MES и 5,84 г NaCl в 200 мл деионизированной воды (DIH 2 O). Растворяют 5 г хондроитинсульфата натриевой соли в буферном растворе.
- Добавить 0,532 г (4,62 ммоль) N-гидроксисукцинимид (NHS) и 1.771 г (9,24 ммоль) 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) (мольное соотношение NHS: EDC = 1: 2) в раствор и перемешивают в течение 5 мин.
- Добавить 0,765 г (4,62 ммоль) 2-аминоэтил-метакрилат (AEMA) (мольное соотношение NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) к раствору и поддержания реакции при КТ в течение 24 ч.
- Очищают смесь путем диализа против деионизированной воды (DIH 2 O) в течение 4 дней с использованием диализа (12-14 кДа MWCO).
- Фильтр рurified раствора через фильтр 0,22 мкм и помещают в открытые пробирки, содержащие раствор в эксикаторе и вакуумной O / N. Убедитесь, что все трубки защищены от света. Храните растворенного полимера при -20 ° С защищен от света и влаги.
3. Сотовый инкапсуляции
- Автоклав ПЦР кино и цилиндрические стержни (для пробивания клеточных нагруженные 3D гидрогели) и стерилизовать на заказ цилиндрическую форму геля погружением в 0,2 мкм фильтрованной 70% этанола в ткани капот культуры в УФ-свете.
- Уплотнение дна геля формы с автоклавного ПЦР пленки без воздушных пузырьков и зазоров для предотвращения утечек. Храните ее в стерильной 150 мм пластины.
- На следующий день перед клеток инкапсуляции в биомиметического гидрогеля, отделить высокой плотности монослоя хондроцитов с O / N в лечении коллагеназы II и решения Коллагеназа IV. Используйте 125 ед / мл коллагеназы для II и 160 U / мл коллагеназы для VI каждый роста хондроцитов СМИпри 37 ° С.
- Возьмем 50 мл трубки и добавить 5% вес / объем (в / о) поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA, ММ = 5000 г / моль), 3% вес / объем хондроитинсульфат-метакрилат (CS-MA), и 0,05% вес / об фотоинициатора в DPBS. Vortex трубку для смешивания раствора и держать его в сторону. Защитите трубки от света.
- Сбор разложенных клеток в 50 мл Сокол трубки, рассчитывать и центрифуги при 460 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте все средства массовой информации от клетки пробирку и добавляют выше смешанного геля, повторно приостанавливать клетки при плотности 15 × 10 6 клеток / мл. Смешайте его в 30 раз тщательно избегая пузырьков воздуха образование.
- Внесите 72 мкл клеточной суспензии гидрогеля-или только гидрогеля в заказ форму цилиндрической гель и вызывают гелеобразование в результате воздействия УФ-излучения (длина волны 365 нм) в 3 мВт / м 2 в течение 5 мин. Подготовить гидрогеля решение без содержимого ячейки. Используйте эти конструкции в качестве отрицательного контроля для будущего биохимических и механических испытаний. MeasuRe интенсивности ультрафиолетового света с измерителем интенсивности УФ. Для регулировки интенсивности, изменить расстояние между УФ источником света и гидрогеля эшафот во время гелеобразования.
Примечание: Так как гидрогель содержит CS, бесклеточная вклад вычитается из биохимического состава ГАГ клеточных нагруженные гидрогели представляют только клеточный GAG. - Используйте скальпель, чтобы сократить фильм для легкого пилинга от и тщательно удалите его. С помощью цилиндрических стержней, вытолкнуть гель в луночный планшет 6 5 мл стерильной ДЗФР смывать Неполимеризованные гель и свободные клетки.
- Культура клеток гидрогели нагруженные в 24-луночных планшетах, содержащих 1,5 мл роста хондроцитов сред в каждую лунку. Использование одноразовых шпатель для передачи промытых гидрогели в скважину.
- Оценка жизнеспособности клеток живой мертвой окрашивание 24 ч после инкапсуляции с использованием набора жизнеспособность / цитотоксичность. Культура клеточные Ладена гидрогели и пустые гидрогели для 3-6 недель изменение свежие хондроцитов GROт-й СМИ каждые 2 дня до сбора урожая для анализа.
4. Экстракция РНК и экспрессия генов анализ
- Тщательно аспирата СМИ и поставить стерильную PBS 1X на клетки-Ладена, а также пустые гидрогели управления.
- С помощью стерильным шпателем, передавать каждый гидрогель в чистую 1,5 мл пробирку Эппендорфа и добавить 250 мкл три-реагента в каждую пробирку. Следуйте инструкциям производителя, чтобы изолировать РНК.
- После изоляции РНК и количественного использования 1 мкг этом из каждого образца и выполнить обратную транскрипцию в кДНК в использовании High Capacity кДНК обратной транскрипцией Kit.
- Для количественной ПЦР TaqMan использовать экспрессии генов массивов для изучения экспрессии генов ваших интересов. Нормализация уровни экспрессии гена GAPDH внутренне.
- Для условий ПЦР включают 2 мин инкубации при 50 ° С инактивировать предыдущие ампликонов с гликозилаз урацил-ДНК, с последующим 10-60; мин инкубации при 95 ° C, чтобы активировать полимеразы Taq. Затем выполните сорок циклов ПЦР, состоящий из 15 сек при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С.
5. Биохимические анализы
- Для каждой ячейки-гидрогель конструкций количественно ДНК и сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) производство как следовать.
- Тщательно аспирата СМИ и поставить стерильную PBS 1X на клетки-Ладена, а также пустые гидрогели управления. Взвесить пустую трубку и положить, что гидрогель внутрь после блоттинга его на папиросную бумагу и записывать вес или влажный вес гидрогелей.
- Замораживание каждый гидрогель при -20 ° С в отдельном 1,5 мл пробирку Эппендорфа на ферментативного расщепления, а затем использовать Аликвоту расщепленной продукта для запуска PicoGreen определения (ДНК) и диметил-метиленовый синий определения (GAG).
- Подготовка papainase решение для ферментативного расщепления гидрогелей.
- Сначала подготовьте буфер PBE путем взвешивания 7,1 г натрия Phosphatе двухосновной (Na 2 HPO 4) и 1,6 г этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли (ЭДТА-Na 2). Растворить в 500 мл дН 2 O, доведения рН до 6,5 и фильтруют через очищенного раствора 0,22 мм фильтр.
- Растворите 0,035 г L-цистеина в 20 мл буфера PBE. Фильтр решение и 100 мкл стерильной фермента папаина.
- Когда все будет готово для выполнения анализов, принять трубы от -20 ° С и добавить 300 мкл готового раствора папаина в замороженных гидрогелей. Измельчите гель с помощью ступки и пестика и хорошо перемешать с пестиком двигателя.
- Довести объем до 500 мкл с дополнительной решения папаин. Выполните ту же процедуру для гелей управления. Инкубируют при 60 ° С в течение 16 ч 3,9. Поэтому раствор, содержащий переваренной гидрогель может использоваться для ДНК и GAG количественного. Измерьте содержание ДНК с использованием анализа PicoGreen с ДНК фага лямбда в качестве стандарта следующее пр производителяotocol.
- Количественно содержание сульфатированных-GAG с помощью 1,9-диметилметилен синий (DMMB) анализа связывания красителя с акулой хондроитинсульфат в качестве стандартного 10. Определяют содержание GAG путем деления количества ГАГ для соответствующего сырого веса.
6. Механические испытания
- Выполните испытаний на неограниченное сжатие, используя Инстрон 5944 тестирования системы впрыска с датчиком нагрузки 10 Н.
- После нужные дни культуры в пробирке, выполнить тест на сжатие клеток-гидрогель эшафот и межклеточных гидрогели управления.
- Погрузите образцы в ванне PBS при комнатной температуре и сжатие в размере 1% деформации / с до максимальной деформации 15% 11,12 после физиологической деформации, испытываемой хрящевой ткани под условия нагрузки, как сообщается, будет на 10-20% 13,14.
- Создать стресс против деформационных кривых и кривой посадки с использованием полиномиального уравнения третьего порядка. Определить COMPRщий касательного модуля из кривой уравнения подборки при значениях деформации 15%.
Representative Results
Биологически активные гидрогели, содержащие ПЭГ и CS фрагменты (рисунок 1) представляет собой идеальную платформу для культуры и созревания хондроцитов суставных 2,3,5,7 человека. Хондроцитов из разных возрастов и болезненных состояний можно культивировать с описанным способом и анализировали на их фенотип, экспрессии генов и биохимических и механических свойств хрящевой ткани, генерируемого. Три образца хондроцитов, ювенального 6 месяцев, взрослой жизни 34 лет и osteoarthritic- 74 лет, собирали через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Экспрессия генов анализ нормальных хондроцитов, как несовершеннолетних и взрослых, показали увеличение экспрессии генов хондроцитов Col2a1 и Col6a1. Напротив, больные хондроциты показали резкое снижение Col2a1 сохраняя экспрессию Col6a1 (рисунок 2) показывает потерю хондрогенной фенотипа несмотря на то, культивируют в выгодном биомиметического среды.
Гидрогели CS-PEG также служить в качестве динамичной среде для хондроциты размножаться, переварить уже существующие матрицу ПЭГ и CS и хранение их перицеллюлярный и внеклеточный матрикс, основные компоненты зрелого хрящевой ткани. Учитывая эти способности, расширение хондроцитов после 3 недель культуры в пробирке можно оценить путем количественного ДНК с красителем PicoGreen. Сравнительный анализ трех групп клеток показывают, что плотность клеток несовершеннолетних и взрослых групп населения не изменилась, а О.А. хондроциты демонстрировали резкое снижение по сравнению с 1-й день культуры. Потеря содержания ДНК наблюдалось также для ОА, но не других хондроцитов, предлагая возможные гибель клеток во время долгосрочного культуры (рис 3). Секретируемый матрицы количественно как содержание сульфатированного GAG с красителем Анализ связывания DMMB на стадии конечной точки через 3 недели культуры. ГАГ содержание нормируется сырого веса гидрогеля как RecorДед до ферментативного расщепления и бесклеточной вклад вычитается. Как показано на рисунке 4, хондроциты хранение подобный значительное количество GAG в течение 3 недель культуры в 3D гидрогелей.
Наличие физической помост позволяет оценить биомеханических свойств образцов через испытаний на неограниченное сжатие 2,3. В то время как бесклеточные гидрогели пройти уменьшение сжатия модулей, сотовые Ладена конструкции поддерживается сжимающие модули после 3 недель в культуре (рисунок 4). Фенотипический, биохимические и биомеханические анализы, описанные здесь, следовательно, полезны для оценки и понимания потенциала разных групп населения хондроцитов для инженерной хряща.
Рисунок 1. ПЭГ-CS биомиметических гидрогели для 3D хондроцитов кульры. Хондроциты ресуспендировали в смеси, содержащей поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA) и хондроитин сульфат-метакрилата (CS-МА) и приведением в заказ цилиндрической форму для геля. После УФ-облучения, затвердевает гели собраны из форм и жизнеспособность клеток оценивают по живой мертвой окрашивания 24 ч после инкапсуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Экспрессия генов в хондрогенных хондроцитов человека, культивируемых в 3D биомиметических гидрогелей. Количественный экспрессию генов хряща маркеров Col2a1 и Col6a1 несовершеннолетними, взрослых и ОА хондроциты через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Значения нормированы на уровне экспрессии генов в день 1. Ошибка бARS представляют среднее ± SD. р * <0,05, как определено по тестам двух Стьюдента. Измененный Smeriglio др. 2 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Содержание ДНК в человеческих хондроцитов, культивируемых в 3D биомиметических гидрогелей. Количественное определение ДНК с помощью анализа PicoGreen в отношении несовершеннолетних, взрослых и ОА хондроциты через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Значения нормированы на уровне ДНК в день 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
<ш /> Рисунок 4. Измерение содержания ГАГ и неограниченный испытание на сжатие человеческих хондроцитов в 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. (А) ГАГ количественное по DMMB анализа в хондроцитах на 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметические гидрогели. Значения нормированы на влажный вес (WW) и выражается в мкг / г. (Б) при сжатии модуль (кПа) бесклеточной и клеточных нагруженные гидрогели на 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Discussion
Как сообщалось, в этом протоколе, 3D гидрогели способны поддерживать фенотип хондроцитов в культуре, избегая процесса клеточной дифференцировке в клетки, как правило, волокнистый хрящ, с которыми сталкиваются с монослойных культур 15. Кроме того, долгосрочные культурах chondrocytes- гидрогеля конструкции показали благоприятную среду, которая поддерживает функции клеток внутренние, связанные с возрастом и болезнями.
Использование 3D биомиметического гидрогеля имеет несколько преимуществ. Во-первых, включение сульфата хондроитина (CS), основным компонентом найти в суставного хряща, позволяют клеткам деградировать гидрогеля матрицу, пряча хондроитиназу и лег вновь синтезированной хряща внеклеточного матрикса 5, 16. Кроме того, CS было показано чтобы иметь противовоспалительные свойства в артритом суставов. Биомиметический гидрогель можно также использовать в качестве материала для строительных лесов доставки клеток в восстановлении хрящей, а может быть химически модифицированычтобы облегчить ткани-биоматериал интеграции 17,18.
Использование гидрогелей ПЭГ-CS позволяет долгосрочные культур хондроцитов и оценку биохимических и механическими свойствами. Здесь мы показываем, как эта платформа может быть полезным для сравнительных анализов различных источников дифференцированных хондроцитов, чтобы определить оптимальный тип клеток для машиностроения хряща. Интересно, что хондроциты, заключенные в гидрогели остаются жизнеспособными и размножаются в соответствии с их собственными способностями. Опоры гидрогелевой композиции, по сути, рост здоровых хондроцитов молодых и взрослых, как показано на рисунке 2. Состав и структура описанных гидрогелей также способствует формированию хрящевой ткани, как указано осаждения функционального внеклеточного матрикса, оцененной гликозаминогликанов (GAG ) количественное.
Дополнительным преимуществом является то, что хондроцитов-гидрогелевые конструкцииможет быть оценена по механическим свойствам новообразованной хрящевой ткани. Следует отметить, что испытание на сжатие неограниченном должны быть выполнены на бесклеточной гидрогеля для сравнения. В гидрогели, на самом деле, имеют характеристическую жесткость за счет жесткости фрагментов CS. Неограниченном деформации сжатия, 5-20% (при скорости деформации 1% / с) могут быть применены для механических испытаний хрящевой ткани 11,12 после физиологической деформации, испытываемой хрящевой ткани под условия нагрузки, как сообщалось, 10-20 % 13,14. Реакция и клеток-Ладена и межклеточных гидрогелей в механических испытаний оценивалась в культуральной конечной точки. В описанном выше примере мы наблюдали сравнимую жесткость содержащих конструкций взрослых и подростков хондроциты, в отличие от нижней жесткости конструкций, содержащих ОА хондроциты. Такие механические свойства клеток-гидрогеля конструкции позволяют оценивать функциональных свойствахформируется ткань дает углубленный анализ способности клеток созревания.
В заключение, использование 3D-биомиметические гидрогелей изучить потенциал различных популяций хондроцитов для генерации хрящевой ткани может широко применяться. Кроме того, исследования в пробирке, описанных здесь, трансплантация в естественных клеточных нагруженные конструкции могут быть предусмотрены для изучения клеток и созревание регенеративный потенциал в физиологическом контексте. Дальнейшие модификации гидрогеля платформы с дополнительными биомиметических факторов также может быть предусмотрено, чтобы оптимизировать пролиферацию хондроцитов и созревание.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
- Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
- Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553 (2013).
- Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
- Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
- Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
- Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
- Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
- Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
- Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
- Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
- Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
- Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).
