Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med de Stanford University Mänskliga försöks riktlinjer och godkändes Institutional Review Board-protokollet.
1. Artikulära chondrocyte Isolering
- Skaffa brosk från vävnad kasseras under total knäplastik och dissekera som beskrivits tidigare 8.
- Välja visuellt de mediala eller laterala femorala kondyler brosk prover för släta ytor och göra snitt vid ytan av brosket genom en skalpell för att avlägsna 4-5 mm brosk biopsier utan att påverka det subkondrala benet.
- Isolera kondrocyter från den extracellulära matrisen genom enzymatisk dissociation av vävnaden med O / N behandling med renat kollagenas. Använd 1: 1 förhållande av kollagenas II (125 U / ml) och kollagenas IV (160 U / ml) i chondrocyte tillväxtmedium vid 37 ° C.
- Följande dag, filtrera rötas vävnad som innehåller de dissocierade cellerna genom en 70mm porstorlek nylonnät. Tvätta två gånger med 20 ml DMEM / F12 och centrifugera vid 600 xg under 5 minuter.
- Plate de isolerade kondrocyter vid en densitet av 1 x 10 6 celler / 60 mm odlingsskål efter resuspension i DMEM / F12 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 25 ^ g / ml askorbat, 2 mM L-glutamin, antimikrobiella medel (100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 0,25 | ig / ml fungizon). Håll plattorna vid 37 ° C och hålls kvar de primära kondrocytceller kulturer som en hög densitet monoskikt före inkapsling i biomimetiska hydrogeler.
2. Biomimetisk Hydrogel Fabrication
OBS: Denna metod tillåter syntes av en biomimetisk hydrogel innehållande poly (etylenglykoldiakrylat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), kondroitinsulfat-metakrylat (CS-MA) i DPBS. Tillsatsen av fotoinitiator möjliggör photoactivated tvärbindning. Den slutliga hydrogelsammansättning innehåller 7% vägert / volym (vikt / volym) av PEGDA, 3% vikt / volym av CS-MA, och 0,05% vikt / volym av fotoinitiator.
- Syntetisera CS-MA genom funktionalisering CS polymer med metakrylatgrupper.
- Bered buffrad lösning av 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic syra (MES) och 0,5 M natriumklorid (NaCl) genom upplösning av 1,952 g av MES och 5,84 g NaCl i 200 ml avjoniserat vatten (DIH 2 O). Lös 5 g kondroitinsulfat-natriumsalt i den buffrade lösningen.
- Lägg 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroxisuccinimid (NHS) och 1,771 g (9,24 mmol) 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) -karbodiimid-hydroklorid (EDC) (molförhållande NHS: EDC = 1: 2) till lösningen och rör om under 5 minuter.
- Lägg 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoetyl-metakrylat (AEMA) (molförhållande NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) till lösningen och bibehålla reaktionen vid RT under 24 h.
- Rena blandningen genom dialys mot avjoniserat vatten (DIH 2 O) under 4 dagar med användning av dialysrör (12-14 kDa MWCO).
- Filtrera purified lösningen genom ett 0,22 pm filter och placera de öppna rören innehållande lösningen i exsickator och vakuum O / N. Säkerställ att alla rör är skyddade från ljus. Förvara den upplösta polymeren vid -20 ° C i skydd mot ljus och fukt.
3. Cell Inkapsling
- Autoklavera PCR film och cylindriska stavar (för att stansa ut de cell lastat 3D hydrogeler) och sterilisera skräddarsydda cylindrisk gel form genom nedsänkning i 0,2 pm filtrerad 70% etanol i vävnadsodling huva under UV-ljus.
- Täta botten av gelen mögel med autoklaveras PCR film utan luftbubblor eller brister för att förhindra läckage. Förvara den i en steril 150 mm platta.
- Dagen före cell inkapsling i biomimetisk hydrogel, dissociera hög densitet kondrocyt monolager med O / N behandling i kollagenas II och kollagenas IV lösning. Använd 125 U / ml för kollagenas II och 160 U / ml för kollagenas VI vardera i chondrocyte tillväxtmediumvid 37 ° C.
- Ta en 50 ml-rör och tillsätt 5% vikt / volym (vikt / vol) poly (etylenglykol-diakrylat) (PEGDA, molekylvikt = 5000 g / mol), 3% vikt / volym kondroitinsulfat-metakrylat (CS-MA) och 0,05% vikt / volym fotoinitiator i DPBS. Vortexa röret för att blanda lösningen och hålla den undan. Skydda slangen från ljus.
- Samla de dissocierade cellerna i ett 50 ml Falcon-rör, räkna och centrifugera vid 460 xg under 5 minuter. Aspirera alla medier från celler rör och tillsätt ovanstående blandade gelmaterialet att återsuspendera celler vid en densitet av 15 x 10 6 celler / ml. Blanda 30 gånger ordentligt samtidigt som man undviker luftbubblor bildas.
- Pipettera 72 pl av cell hydrogel suspension eller enbart hydrogel i skräddarsydda cylindrisk gel mögel och inducera gelning genom exponering för UV-ljus (365 nm våglängd) vid 3 mW / m 2 i 5 minuter. Förbereda några hydrogel lösning utan cellinnehåll. Använd dessa konstruktioner som negativa kontroller för den framtida biokemiska och mekanisk provning. Measuåter intensiteten för UV-ljus med en UV-intensitetsmätare. För att justera intensiteten, ändra avståndet mellan UV-ljuskällan och hydrogel schavotten under gelning.
OBS: Eftersom hydrogelen innehåller CS, är det acellulära bidrag subtraheras från biokemiska GAG innehållet i cell lastad hydrogeler att representera endast den cellulära GAG. - Använd en skalpell för att skära filmen för enkel lossna och försiktigt bort det. Med hjälp av de cylindriska stängerna, trycka ut gelén in i en 6-brunnars platta med 5 ml steril DPBS för att tvätta bort opolymeriserad gel och lösa celler.
- Kultur cell-lastad hydrogeler i 24 brunnsplattor innehållande 1,5 ml chondrocyte tillväxtmedium i varje brunn. Använd en engångsspatel för att överföra de tvättade hydrogelerna i brunnen.
- Bedöm cellviabiliteten med levande döda färgning 24 timmar efter inkapsling med hjälp av en lönsamhets / cytotoxicitet kit. Kultur cellladdade hydrogeler och de tomma hydrogeler för 3-6 veckor byter till nya kondrocytceller growth media varje 2 dagar före skörd för analyser.
4. RNA-extraktion och Gene Expression Analyser
- Försiktigt aspirera media och sätta steril PBS 1X på cell lastat liksom de tomma kontroll hydrogel.
- Med hjälp av en steril spatel, överför varje hydrogelen till en ren 1,5 ml Eppendorf-rör och tillsätt 250 | il Tri-reagens till varje rör. Följ tillverkarens instruktioner för att isolera RNA.
- Efter RNA-isolering och kvantifiering användning 1 mikrogram av det från varje prov och utföra en omvänd transkription till cDNA med hjälp av High Capacity cDNA omvänd transkription Kit.
- För kvantitativ PCR använda TaqMan Gene Expression arrayer för undersökning av uttrycket av dina gener av intresse. Normalisera genuttryck nivåer internt till GAPDH.
- För PCR-betingelser innefattar en 2 min inkubation vid 50 ° C för att inaktivera tidigare amplikoner med uracil-DNA-glykosylas, följt av en 1060; min inkubation vid 95 ° C för att aktivera Taq-polymeras. Utför sedan fyrtio PCR-cykler, bestående av 15 sek vid 95 ° C och 1 min vid 60 ° C.
5. Biokemisk analys
- För varje cell-hydrogel konstruktioner kvantifiera DNA och sulfaterad glykosaminoglykan (sGAG) produktion enligt följande.
- Försiktigt aspirera media och sätta steril PBS 1X på cell lastat liksom de tomma kontroll hydrogel. Väg en tom slang och sätta hydrogel inuti efter blotting det på mjukpapper och notera vikten eller våt vikten av hydrogel.
- Freeze varje hydrogel vid -20 ° C i ett separat 1,5 ml Eppendorf-rör för enzymatisk digerering och senare använda en alikvot av det digererade produkten för att köra Picogreen analys (för DNA) och dimetyl-metylenblått analys (för GAG).
- Förbered papainase lösning för enzymatisk digerering av hydrogeler.
- Först förbereda PBE buffert genom att väga upp 7,1 g natrium Phosphate dibasiskt (Na 2 HPO 4) och 1,6 g etylendiamintetraättiksyra-dinatriumsalt (EDTA-Na 2). Lös i 500 ml dH 2 O, justera pH till 6,5 och filtrera den renade lösningen genom ett 0,22 mm filter.
- Lös 0,035 g L-cystein i 20 ml PBE buffert. Filtrera lösningen och 100 ul steril papain enzym.
- När redo att utföra analyserna, ta rören från -20 ° C och tillsätt 300 ul av redo papainlösning till de frusna hydrogeler. Krossa gelén med en mortel och mortelstöt och blanda det väl med motorn mortelstöt.
- Bringa volymen till 500 pl med ytterligare papainlösning. Utför samma procedur för kontroll geler. Inkubera vid 60 ° C under 16 h 3,9. Lösningen innehållande det spjälkade hydrogelen kan därför användas för DNA och GAG kvantifiering. Mät DNA-innehåll med hjälp av Picogreen analysen med Lambda fag-DNA som standard efter tillverkarens protocol.
- Kvantifiera sulfat-GAG innehåll med hjälp av 1,9-dimetylmetylen blå (DMMB) färgämnesbindningsanalys med haj kondroitinsulfat som standard 10. Bestäm GAG-halt genom att dividera mängden av GAG för motsvarande våtvikt.
6. Mekanisk provning
- Utför unconfined kompressions tester med en Instron 5944 provningssystem utrustad med en 10 N belastningscell.
- Efter önskade dagar av odling in vitro, utför kompressionstest på cell hydrogel byggnadsställning och acellulära kontroll hydrogel.
- Sänk proverna i en PBS bad vid RT och komprimera med en hastighet av 1% töjning / sekund till en maximal stam av 15% 11,12 eftersom fysisk ansträngning upplevs av broskvävnad i lastfall har rapporterats vara 10-20% 13,14.
- Skapa spänning mot töjningskurvor och kurvpassning med hjälp av en tredje ordningens polynomekvation. Bestäm compressive tangentmodulen från kurvan passade ekvationen vid töjningsvärdena på 15%.
Representative Results
Bioaktiva hydrogeler innehållande PEG och CS delar (Figur 1) utgör en idealisk plattform för kultur och mognad av mänskliga ledkondrocyter 2,3,5,7. Kondrocyter från olika åldrar och sjukdomstillstånd kan odlas med den beskrivna metoden och analyserades för deras fenotyp, genexpression och biokemiska och mekaniska egenskaper hos broskvävnad genererad. Tre kondrocytceller prover, juvenil 6 månader, vuxen- 34 år och osteoarthritic- 74 år, skördades efter 3 veckors odling i 3D biomimetiska hydrogeler. Gene expression analyser av normala kondrocyter, både unga och vuxna, visade en ökning i uttrycket av kondrocytceller generna Col2a1 och Col6a1. Tvärtom diseased kondrocyter uppvisade en dramatisk minskning av Col2a1 under bibehållande av expressionen av Col6a1 (figur 2) visar en förlust av kondrogen fenotyp trots att odlas i ett gynnsamt biomimetisk miljö.
Den CS-PEG hydrogeler tjänar också som en dynamisk miljö för kondrocyter att föröka sig, smälta den befintliga matris av PEG och CS och deponera sina pericellulär och extracellulära matrix, de viktigaste komponenterna i den mogna broskvävnad. Med tanke på dessa förmågor, kondrocyt expansion efter 3 veckors odling in vitro kan uppskattas genom kvantifiering av DNA med Picogreen färgämnet. Jämförande analys av de tre grupper av celler visar att celldensitet på unga och vuxna befolkningen var oförändrad medan OA kondrocyter uppvisade en dramatisk minskning jämfört med dag 1 av kultur. En förlust av DNA-innehåll observerades också för OA men inte andra kondrocyter antyder möjlig celldöd under långtidsodling (Figur 3). Det utsöndrade matrisen kvantifierades som sulfat-GAG innehåll genom DMMB färgbindningsanalys vid slutpunkten scenen efter 3 veckor av kulturer. GAG-halt normaliseras genom den våta vikten av hydrogelen som RECORded innan den enzymatiska nedbrytning och acellulära bidraget subtraheras. Såsom visas i fig 4, kondrocyter deponerat en liknande signifikant mängd av GAG under 3 veckors odling i 3D hydrogel.
Närvaron av en fysisk byggnadsställning tillåter utvärdering av biomekaniska egenskaper hos proven genom enaxligt tryckförsök 2,3. Medan acellulära hydrogeler genomgå en minskning av tryckmoduler, cell lastat konstruktioner behållit de tryckmoduler efter 3 veckor i odling (Figur 4). Den fenotypiska, biokemiska och biomekaniska analyser som beskrivs här är därför användbara för att utvärdera och förstå potentialen i olika kondrocytceller populationer för konstruktion brosk.
Figur 1. PEG-CS biomimetiska hydrogeler för 3D kondrocyt culturen. Kondrocyter återsuspenderas i en blandning innehållande poly (etylenglykol diakrylat) (PEGDA) och kondroitinsulfat-metakrylat (CS-MA) och gjutna in i skräddarsydda cylindrisk gel mögel. Efter UV-exponering, stelnade geler samlas in från formarna och cellviabiliteten bedöms av levande döda färgning 24 timmar efter inkapsling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Expression av kondrogena gener i mänskliga kondrocyter odlade i 3D biomimetiska hydrogeler. Kvantitativ genuttrycket av broskmarkörer Col2a1 och Col6a1 av unga, vuxna och OA kondrocyter efter 3 veckors odling i 3D biomimetiska hydrogeler. Värden normaliseras till genuttryck nivå vid dag 1. Fel bars representerar medelvärde ± SD. p * <0,05 enligt bestämning med en två-tailed Students t-test. Modifierad från Smeriglio et al. 2 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. DNA-innehållet i mänskliga kondrocyter odlade i 3D biomimetiska hydrogeler. DNA kvantifiering av Picogreen analys i unga, vuxna och OA kondrocyter efter 3 veckors odling i 3D biomimetiska hydrogeler. Värden normaliseras till DNA-nivå vid dag 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
<br /> Figur 4. GAG innehåll mätning och unconfined komprimering test av mänskliga kondrocyter vid dag 1 och efter 3 veckors odling i 3D biomimetiska hydrogeler. (A) GAG kvantifiering av DMMB analys i kondrocyter vid dag 1 och efter 3 veckors odling i 3D biomimetiska hydrogeler. Värdena är normaliserade till våt vikt (ww) och uttrycktes som ug / g. (B) Tryck modul (kPa) i acellulära och cell lastad hydrogeler vid dag 1 och efter 3 veckors odling i 3D biomimetiska hydrogeler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Som rapporterats i detta protokoll, 3D hydrogeler kan hålla kondrocytfenotyp i kultur, undvika processen av cell dedifferentiering i fibrobrosk celler vanligen uppkommer med monolagerkulturer 15. Dessutom långsiktiga kulturer i chondrocytes- hydrogel konstruktionen visade en gynnsam miljö som upprätthåller de inneboende cellfunktioner i samband med ålder och sjukdom.
Användningen av en 3D biomimetisk hydrogel har flera fördelar. Först, inbegripet införandet av kondroitinsulfat (CS), en viktig komponent som finns i ledbrosk, aktiverar celler att nedbryta hydrogelmatrisen genom att utsöndra kondroitinas och fastställa nysyntetiserade brosk extracellulär matrix 5, 16. Dessutom har CS visats ha antiinflammatoriska egenskaper i artritisk led. Den biomimetisk Hydrogelen kan också användas som en ställningsmaterial för celladministrering i broskreparation, och kan modifieras kemisktatt underlätta bättre vävnads biomaterial integration 17,18.
Användningen av PEG-CS hydrogeler möjliggör långsiktiga kulturer av kondrocyter och utvärdering av biokemiska och mekaniska egenskaper. Här visar vi hur denna plattform kan vara till nytta för jämförande analyser av olika källor av differentierade kondrocyter för att bestämma den optimala celltyp för broskteknik. Intressant, kondrocyter inkapslade i hydrogeler förbli livskraftig och föröka enligt deras inneboende förmågor. Hydrogelkompositionen bärarna, i själva verket, tillväxten av friska unga och vuxna kondrocyter såsom visas i fig 2. Sammansättningen och strukturen hos de beskrivna hydrogelerna främjar också broskvävnadsbildning såsom anges med avsättning av ett funktionellt extracellulär matris bedömas av glykosaminoglykan (GAG ) kvantifiering.
En ytterligare fördel är att kondrocytceller-hydrogel konstruktionerkan utvärderas för de mekaniska egenskaperna hos den nybildade broskvävnad. Observera att unconfined tryckprovet ska utföras på acellulära hydrogel för jämförelse. Hydrogeler, i själva verket har en inneboende styvhet på grund av styvheten hos CS enheter. Unconfined tryckdeformationen av 5-20% (vid en töjningshastighet 1% / s) kan användas för mekanisk provning av broskvävnad 11,12 eftersom fysisk ansträngning upplevs av broskvävnad i lastfall har rapporterats vara 10-20 % 13,14. Svaret både cell lastat och acellulära hydrogeler till mekanisk provning utvärderades vid kulturslutpunkten. I det beskrivna exemplet ovan har vi observerat en jämförbar styvhet av konstruktionerna som innehåller vuxna och juvenila kondrocyter i motsats till den lägre styvheten hos de konstruktioner som innehåller OA kondrocyter. Sådana mekaniska egenskaperna hos cell hydrogel konstruktionen medger en bedömning av de funktionella egenskaperna hosbildade vävnad ger en fördjupad analys av cellmognad förmåga.
Sammanfattningsvis kan användningen av 3D biomimetiska hydrogeler att undersöka potentialen olika kondrocytpopulation befolkningen att generera broskvävnad tillämpas allmänt. Förutom in vitro-studier som beskrivs här, kan in vivo-transplantation av de cell lastat konstruktioner tänkas att studera cellmognad och regenerativ potential i den fysiologiska kontexten. Ytterligare modifieringar av hydrogel plattform med ytterligare biomimetiska faktorer kan också tänkas att optimera kondrocyt proliferation och mognad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
- Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
- Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553 (2013).
- Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
- Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
- Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
- Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
- Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
- Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
- Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
- Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
- Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
- Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).
