Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dei soggetti Stanford University Umani e approvati protocollo Institutional Review Board.
Isolamento 1. articolare di condrociti
- Ottenere la cartilagine da tessuti scartati durante protesi totale di ginocchio e sezionare come descritto in precedenza 8.
- Visivamente selezionare i condili femorali mediale o laterale di campioni di cartilagine per superfici lisce e rendere incisione alla superficie della cartilagine attraverso un bisturi per rimuovere 4-5 biopsie mm cartilagine senza influenzare l'osso subcondrale.
- Isolare condrociti dalla matrice extracellulare per dissociazione enzimatica del tessuto con il trattamento / N O con collagenasi purificata. Utilizzare rapporto 1: 1 di collagenasi II (125 U / ml) e Collagenasi IV (160 U / ml) in terreni di coltura di condrociti a 37 ° C.
- Il giorno seguente, filtrare il tessuto digerito contenente le cellule dissociate attraverso un 70mm pori maglie di dimensione nylon. Lavare due volte con 20 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 5 min.
- Piastra le condrociti isolati ad una densità di 1 x 10 6 cellule / 60 mm piatto di coltura dopo risospensione in DMEM / F12 addizionato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 25 mg / ascorbato ml, 2 mM L-glutammina, antimicrobici (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,25 mg / ml Fungizone). Conservare le piastre a 37 ° C e mantenere le colture di condrociti primari come un monostrato alta densità prima incapsulamento in idrogel biomimetici.
2. Biomimetic Hydrogel Fabrication
NOTA: Questo metodo permette la sintesi di un idrogel biomimetico contenente poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW 5000 g / mole), condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) in DPBS. L'aggiunta di fotoiniziatore permette reticolazione fotoattivato. La composizione idrogel finale contiene il 7% pesaret / Volume (w / v) di PEGDA, 3% w / v di CS-MA, e 0,05% w / v di fotoiniziatore.
- Sintetizzare CS-MA per funzionalizzazione CS polimero con gruppi di metacrilato.
- Preparare la soluzione tampone di 50 mM di acido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) e 0,5 M di cloruro di sodio (NaCl) sciogliendo 1,952 g di MES e 5,84 g di NaCl in 200 ml di acqua deionizzata (DIH 2 O). Sciogliere 5 g di sale di condroitin solfato sodico nella soluzione tamponata.
- Aggiungere 0,532 g (4,62 mmol) N-idrossisuccinimmide (NHS) e 1.771 g (9.24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) cloridrato -carbodiimide (EDC) (rapporto molare di NHS: EDC = 1: 2) a la soluzione e mescolare per 5 min.
- Aggiungere 0,765 g (4,62 mmol) metacrilato di 2-amminoetil (Aema) (rapporto molare di NHS: EDC: Aema = 1: 2: 1) alla soluzione e mantenere la reazione a temperatura ambiente per 24 ore.
- Purificare il composto con la dialisi contro acqua deionizzata (diH 2 O) per 4 giorni usando tubo di dialisi (12-14 kDa MWCO).
- Filtrare la purified soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e posizionare i tubi aperti contenenti la soluzione in un essiccatore sotto vuoto e O / N. Assicurarsi che tutti i tubi siano protetti dalla luce. Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall'umidità.
Incapsulamento 3. cellulare
- Autoclave i film e cilindrici aste PCR (per punzonatura gli idrogel 3D cell-carico) e sterilizzare lo stampo gel cilindrica su misura per immersione in 0,2 micron filtrato etanolo al 70% in cappuccio coltura tissutale sotto raggi UV.
- Sigillare il fondo dello stampo gel con pellicola PCR autoclave senza bolle d'aria o lacune per impedire perdite. Tenerlo in una piastra sterile, 150 millimetri.
- Il giorno prima di incapsulamento delle cellule in idrogel biomimetica, dissociare il condrociti monostrato ad alta densità con trattamento O / N in Collagenase II e soluzione Collagenasi IV. Utilizzare 125 U / ml per Collagenasi II e 160 U / ml per Collagenasi VI ciascuno in crescita di condrociti dei mediaa 37 ° C.
- Dai tubo da 50 ml e si aggiungono 5% peso / volume (w / v) di poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW = 5,000 g / mole), 3% w / v condroitin solfato-metacrilato (CS-MA), e 0.05% w / v fotoiniziatore in DPBS. Agitare la provetta per miscelare la soluzione e tenerlo da parte. Proteggere il tubo dalla luce.
- Raccogliere le cellule dissociate in un tubo Falcon da 50 ml, contare e centrifugare a 460 xg per 5 min. Aspirare tutti i media dal tubo cellule e aggiungere il materiale sopra il gel miscelato risospendere le cellule ad una densità di 15 × 10 6 cellule / ml. Mescolare 30 volte a fondo, evitando la formazione di bolle d'aria.
- Dispensare 72 ml di sospensione cellulare-idrogel o da soli idrogel nello stampo gel cilindrica su misura e indurre gelificazione attraverso l'esposizione alla luce UV (365 nm) a 3 mW / m 2 per 5 min. Preparare una soluzione idrogel senza contenuto della cella. Utilizzare questi costrutti come controlli negativi per il futuro i test biochimici e meccanici. Misure l'intensità della luce UV con un misuratore di intensità UV. Per regolare l'intensità, modificare la distanza tra la sorgente di luce UV e il ponteggio idrogel durante la gelificazione.
NOTA: Dal momento che l'idrogel contiene CS, il contributo acellulare viene sottratto dal contenuto GAG biochimica degli idrogel cellulari carichi di rappresentare solo il GAG cellulare. - Utilizzare un bisturi per tagliare il film per easy peel e rimuovere con cautela. Con l'aiuto delle aste cilindriche, spingere fuori il gel in una piastra ben 6 con 5 ml di DPBS sterili per lavare gel polimerizzato e cellule allentati.
- Culture idrogel cellulari carichi in piastre da 24 pozzetti contenenti 1,5 ml di terreni di crescita di condrociti in ogni pozzetto. Utilizzare una spatola monouso per trasferire i idrogel lavati nel pozzo.
- Valutare la vitalità cellulare del morto in diretta colorazione 24 ore post-incapsulamento utilizzando un kit di sopravvivenza / citotossicità. Cultura idrogel cellulari carichi e gli idrogeli vuote per 3-6 settimane che cambiano a gro chondrocyte freschiwth dei media ogni 2 giorni prima della raccolta per le analisi.
4. RNA Estrazione e Gene Expression analisi
- Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote.
- Con l'aiuto di una spatola sterile, trasferire ogni idrogel di clean 1,5 ml provetta Eppendorf e aggiungere 250 ml di Tri-reattivo ad ogni provetta. Seguire le istruzioni del produttore per isolare l'RNA.
- Dopo l'isolamento di RNA e quantificazione uso 1 mg di esso da ogni campione e di eseguire una trascrizione inversa in cDNA utilizzando l'alta capacità cDNA corredo d'inversione di trascrizione.
- Per PCR quantitativa utilizzare TaqMan array di espressione genica per l'esame dell'espressione di geni di interesse. Normalizzare i livelli di espressione genica internamente per GAPDH.
- Per le condizioni di PCR includere un 2 min di incubazione a 50 ° C per inattivare ampliconi precedenti con glicosilasi uracile-DNA, seguito da 1060; min di incubazione a 95 ° C per attivare la polimerasi Taq. Quindi eseguire cicli di PCR quaranta, costituito da 15 sec a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C.
5. Analisi biochimiche
- Per ogni costruzioni cellulari-idrogel quantificare il DNA e glicosaminoglicani solfato (sGAG) la produzione come segue.
- Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. Pesare un tubo vuoto e mettere l'idrogel all'interno dopo assorbente su carta velina e registrare il peso o il peso umido degli idrogel.
- Congelare ogni idrogel a -20 ° C in un tubo separato ml eppendorf 1.5 per digestione enzimatica e successivamente utilizzare una aliquota di prodotto digerita eseguire PicoGreen dosaggio (DNA) e dimetil-metilene assay blu (GAG).
- Preparare la soluzione papainase per digestione enzimatica degli idrogel.
- Per prima cosa preparate il buffer PBE pesando 7,1 g di sodio phosphate bibasico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g di acido etilendiamminotetracetico disodico sale (EDTA-Na 2). Sciogliere in 500 ml di dH 2 O, regolare il pH a 6,5 e filtrare la soluzione purificata attraverso un filtro 0.22 mm.
- Sciogliere 0,035 g di L-cisteina in 20 ml di tampone PBE. Filtrare la soluzione e 100 ml di sterile papaina enzima.
- Al momento di eseguire saggi, prendere le provette da -20 ° C e aggiungere 300 microlitri della soluzione papaina pronto a idrogel congelati. Schiacciare il gel con un mortaio e pestello e mescolare bene con il pestello motore.
- Portare il volume a 500 ml con soluzione papaina aggiuntivo. Eseguire la stessa procedura per i gel di controllo. Incubare a 60 ° C per 16 ore 3,9. La soluzione contenente l'idrogel digerito può quindi utilizzato per il DNA e GAG quantificazione. Misurare il contenuto di DNA con il saggio PicoGreen con Lambda fago DNA di serie seguente pr del produttoreotocol.
- Quantificare il contenuto solfato-GAG utilizzando il blu 1,9-metilmetilene (DMMB)-dye legame test con squalo condroitin solfato di serie 10. Determinare il contenuto di GAG dividendo l'importo di GAG per la corrispondente peso umido.
6. Prove meccaniche
- Eseguire prove di compressione non confinati usando un sistema di prova Instron 5944 dotato di una cella di carico di 10 N.
- Dopo i giorni desiderati di coltura in vitro, eseguire il test di compressione sull'impalcatura cellula-idrogel e gli idrogeli controllo acellulari.
- Immergere i campioni in un bagno PBS a temperatura ambiente e comprimere ad un tasso del 1% ceppo / sec per un ceppo massimo del 15% 11,12 dal momento che la sforzo fisico vissuta da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20% 13,14.
- Creare lo stress contro curve deformazione e la curva in forma con un terzo ordine un'equazione polinomiale. Determinare i compressive tangente modulo dalla curva equazione forma in valori di deformazione del 15%.
Representative Results
Idrogel bioattivi contenenti PEG e frazioni CS (Figura 1) rappresentano una piattaforma ideale per la cultura e la maturazione dei condrociti articolari umani 2,3,5,7. I condrociti di diverse epoche e stati patologici possono essere coltivati con il metodo descritto ed analizzati per la loro fenotipo, espressione genica e proprietà biochimiche e meccaniche del tessuto cartilagineo generato. Tre campioni chondrocyte, juvenile- 6 mesi, adulto-34 anni e osteoarthritic- 74 anni, sono state raccolte dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. Analisi dell'espressione genica di condrociti normali, sia giovani che adulti, hanno mostrato un aumento dell'espressione dei geni COL2A1 e COL6A1 condrociti. Al contrario, condrociti malate mostrato una diminuzione drammatica COL2A1 mantenendo l'espressione di Col6a1 (Figura 2) mostra una perdita di fenotipo condrogenica pur essendo coltivate in un ambiente biomimetico favorevole.
Gli idrogel CS-PEG servono anche come un ambiente dinamico per i condrociti a proliferare, digerire la matrice preesistente di PEG e CS e depositano la loro matrice pericellulare e extracellulare, i principali componenti del tessuto cartilagineo maturo. Alla luce di queste capacità, espansione di condrociti dopo 3 settimane di coltura in vitro può essere stimato per la quantificazione del DNA con il colorante PicoGreen. Analisi comparativa dei tre gruppi di cellule mostrano che la densità cellulare di giovani e adulti popolazioni è rimasto invariato mentre condrociti OA hanno mostrato una diminuzione drammatica rispetto al giorno 1 di cultura. Stata anche osservata una perdita del contenuto di DNA per OA ma non altre condrociti suggerendo possibile morte delle cellule durante la coltura a lungo termine (Figura 3). La matrice secreta è stato quantificato come contenuto solfato-GAG per DMMB test-dye vincolante nella fase punto finale dopo 3 settimane di culture. Contenuto GAG è normalizzata per il peso umido del idrogel come recorded prima della digestione enzimatica e il contributo acellulare viene sottratto. Come mostrato in figura 4, condrociti depositato un'analoga quantità significativa di GAG per 3 settimane di coltura in idrogel 3D.
La presenza di un ponteggio fisica consente la valutazione delle proprietà biomeccaniche dei campioni attraverso unconfined prove di compressione 2,3. Mentre idrogel acellulari subiscono una diminuzione della moduli compressione, costrutti cellulari carichi mantenuti i moduli di compressione dopo 3 settimane in coltura (Figura 4). Il fenotipica, analisi biochimiche e biomeccaniche qui descritte sono quindi utili per valutare e comprendere le potenzialità di diverse popolazioni di condrociti per l'ingegneria cartilagine.
Figura 1. PEG-CS idrogel biomimetici per 3D condrociti cultura. condrociti sono risospesi in una miscela contenente poli (glicole etilenico diacrilato) (PEGDA) e condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) e colato nello stampo gel cilindrica su misura. Dopo l'esposizione ai raggi UV, solidificati gel sono raccolti dagli stampi e vitalità cellulare è valutata mediante colorazione morto dal vivo 24 ore post-incapsulamento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Espressione dei geni condrogeniche in condrociti umani coltivati in 3D idrogel biomimetici. Espressione genica quantitativa di marker cartilagine COL2A1 e Col6a1 da giovani, adulti e OA condrociti dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. I valori sono normalizzati a livello di espressione genica a giorno 1. Errore bars rappresentano media ± SD. * p <0,05 come determinato da un test t Student a due code. Modificato da Smeriglio e coll. 2 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. contenuto di DNA in condrociti umani coltivati in idrogel biomimetici 3D. Quantificazione del DNA da PicoGreen test in giovani, adulti e OA condrociti dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. I valori sono normalizzati a livello del DNA a giorno 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
<br /> Figura 4. Misurazione del contenuto di GAG e test di compressione non confinato di condrociti umani in giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura in 3D idrogel biomimetici. (A) GAG quantificazione mediante test DMMB in condrociti al giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura idrogel biomimetici 3D. I valori sono normalizzati a bagnare peso (ww) ed espressi in mg / g. (B) modulo di compressione (kPa) di acellulari e cellulari carichi di idrogel a giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura in 3D idrogel biomimetici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Come riportato in questo protocollo, gli idrogel 3D sono in grado di mantenere condrociti fenotipo nella cultura, evitando il processo di de-differenziazione delle cellule in cellule fibrocartilagine riscontrate in genere con colture monostrato 15. Inoltre, le colture a lungo termine di idrogel costrutto chondrocytes- rivelato un ambiente favorevole che mantiene le caratteristiche intrinseche delle cellule associate con l'età e la malattia.
L'uso di un idrogel biomimetico 3D ha diversi vantaggi. In primo luogo, l'inclusione di condroitin solfato (CS), uno dei principali componenti trovati nella cartilagine articolare, attivare le cellule di degradare la matrice idrogel secernendo condroitinasi e stabilire la cartilagine nuova sintesi extracellulare matrice 5, 16. Inoltre, CS è stato dimostrato per avere proprietà anti-infiammatorie nel giunto artritico. L'idrogel biomimetico può anche essere usato come materiale per la consegna ponteggio cella riparazione della cartilagine, e può essere modificato chimicamenteper facilitare una migliore integrazione dei tessuti 17,18-biomateriale.
L'uso degli idrogel PEG-CS consente colture a lungo termine di condrociti e la valutazione delle proprietà biochimiche e meccaniche. Qui mostriamo come questa piattaforma può essere utile per le analisi comparative delle varie fonti di condrociti differenziati al fine di definire il tipo cellulare ottimale per l'ingegneria cartilagine. È interessante notare che, condrociti incapsulate in idrogel rimangono vitali e proliferano in base alle loro capacità intrinseche. I supporti composizione idrogel, infatti, la crescita di giovani e adulti condrociti sani come mostrato in Figura 2. La composizione e la struttura degli idrogel descritti promuove anche la formazione di tessuto cartilagineo come indicato dalla deposizione di matrice extracellulare funzionale valutata glicosaminoglicani (GAG ) quantificazione.
Un ulteriore vantaggio è che i costrutti chondrocyte-idrogelpuò essere valutata per le proprietà meccaniche del tessuto cartilagineo neoformato. Si noti che il test di compressione non confinato dovrebbe essere eseguita sul idrogel acellulare per il confronto. Gli idrogeli, infatti, hanno una rigidità intrinseca dovuta alla rigidità delle porzioni CS. Ceppo compressione unconfined del 5-20% (a velocità di deformazione 1% / s) può essere applicato per la prove meccaniche della cartilagine tessuto 11,12 in quanto il ceppo fisiologico sperimentato da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20 13,14%. La risposta delle cellule sia carichi e acellulari idrogel a prove meccaniche è stata valutata al punto finale cultura. Nell'esempio descritto sopra osservato una rigidità paragonabile dei costrutti contenenti adulti e giovanili condrociti in contrasto con la rigidità inferiore dei costrutti contenenti condrociti OA. Tali proprietà meccaniche del costrutto cellule idrogel permettono la valutazione delle proprietà funzionali deltessuto formata dando una analisi approfondita della capacità maturazione delle cellule.
In conclusione, l'utilizzo degli idrogel biomimetici 3D per studiare il potenziale della popolazione condrociti diverso per generare tessuto cartilagineo può essere ampiamente applicato. Oltre agli studi in vitro qui descritti, trapianto in vivo dei costrutti cellulari carichi può essere prevista per studiare la maturazione delle cellule e potenziale rigenerativo nel contesto fisiologico. Ulteriori modifiche della piattaforma idrogel con ulteriori fattori biomimetici possono anche essere immaginato per ottimizzare la proliferazione di condrociti e maturazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
- Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
- Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553 (2013).
- Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
- Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
- Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
- Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
- Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
- Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
- Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
- Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
- Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
- Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).
